全 文 ：文章编号 :100028551 (2007) 062581204
蓝刺头组织培养和叶片再生植株的研究
朱海军　俞红强　义鸣放
(中国农业大学农学与生物技术学院 ,北京　100094)
摘 　要 :以蓝刺头 ( Echinops latifolius Tausch. )叶片为外植体 ,建立了蓝刺头的再生体系 ,并对其影响因素
进行了研究。结果表明 ,MS + 62BA 110mg·L - 1 + NAA 011mg·L - 1为最适分化培养基 ,再生率达 48133 % ,
平均每个外植体再生芽数 3156 ;添加 210mg·L - 1的硝酸银以及暗处理 15d 均可显著提高不定芽的再生
率和再生芽数 ,再生率分别提高到 80133 %和 63133 %。
关键词 :蓝刺头 ;再生体系 ;硝酸银 ;暗处理
TISSUE CULTURE AND PLANT REGENERATION FROM LEAVES OF Echinops latifolius Tausch.
ZHU Hai2jun 　YU Hong2qiang 　YI Ming2fang
( College of Agriculture and biotechnology , China Agricultural University , Beijing 　100094)
Abstract :Using leaves as explants , we established a high frequency regeneration system of Echinops latifolius Tausch , and
studied the main factors which affecting plant regeneration in vitro. The results showed that the optimum medium for shoot
regeneration was MS + 62BA 110mg·L - 1 + NAA 011mg·L - 1 . The frequency of shoot regeneration was 48133 % and mean
number of buds per explant was 31561 The optimum medium plus 210mg·L - 1 AgNO3 , and incubating for 15 days under dark
condition could strikingly promote shoot regeneration and the number of bud , with frequency of 80133 % and 63133 %
respectively.
Key words : Echinops latifolius Tausch. ; regeneration system ; AgNO3 ; dark incubation
收稿日期 :2007203207
基金项目 :北京市林业局花卉产业处资助项目 (25012482)
作者简介 :朱海军 (19812) ,男 ,山东潍坊人 ,在读硕士生 ,从事野生花卉引种驯化及商品化开发工作。
通讯作者 :义鸣放 (19572) ,女 ,山西左权人 ,教授 ,从事花卉栽培生理的研究。E2mail : ymfang @cau. edu. cn　　蓝刺头 ( Echinops latifolius Tausch. ) 是菊科蓝刺头属多年生宿根草本植物 ,在我国东北及西北大部分地区均有分布[1 ] ,其花形奇特 ,观赏期长 ,可以做鲜切花和干花。同时由于其生态适应性广 ,抗性强 ,在干旱、贫瘠的土地及山坡疏林下生长良好 ,而且一次种植能多年观赏能作为地被绿化材料 ,极大节约管理成本。另外 ,蓝刺头也具有很高的药用价值 ,其根和花序可以入药 ,有清热解毒、排脓消肿、活血作用。国外将其果实作为强心剂 ,用于治疗高血压及动脉粥样硬化等症 ;其嫩枝、叶、花序可作马、骆驼的饲料[2 ] 。目前对蓝刺头的研究报道较少 ,而有关蓝刺头组织培养和植株再生的研究尚未见报道[3～7 ] 。本试验以蓝刺头叶片为外植体 ,在筛选最适不定芽分化培养基的基础上 ,研究了 添加硝酸银和暗培养对不定芽分化的影响 ,以期建立蓝刺头高频、稳定的植株再生体系 ,为蓝刺头组培繁殖、无性系选种及开展基因工程育种等提供技术支持。1 　材料和方法111 　无菌材料的获得试验材料来自中国农业大学科学园。取叶龄 30d的蓝刺头根插苗叶片 ,用试管刷蘸少量洗衣粉洗掉叶片表面的污物 ,流水冲干净 ,75 %酒精浸泡 30s ,2 %的次氯酸钠浸泡 10min 消毒 ,最后无菌水冲洗 5～6 次。112 　不定芽分化以 MS 为基本培养基 ,附加 3 %的蔗糖和 017 %的
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琼脂 ,pH 518～610 ,经 121 ℃高温灭菌 20min。硝酸银
需过滤灭菌。无菌培养室培养条件 :温度 25 ℃±1 ℃,
光强 1500～2000lx ,光照时间 16hΠd。
11211 　不同激素及浓度对不定芽分化的影响 　接种
时去除叶缘和叶片中脉 ,切成 015cm ×015cm 的小块接
种于添加 NAA 011mg·L - 1 、62BA (011、015、110、210 和
310mg·L - 1 ) ,或只加 2 ,42D (011、015 和 110mg·L - 1 ) 的
培养基上 ,远轴面向下。40d 后统计不定芽的再生率
和平均每个外植体再生芽数。
11212 　添加硝酸银对不定芽分化的影响 　在上述试
验所得出的最适分化培养基中添加硝酸银 (0、015、
110、210 和 410mg·L - 1 ) ,15d 后统计各处理分化的外植
体数、再生的不定芽数量。
11213 　不同时间的暗处理对不定芽分化的影响 　将
叶片接种到最适分化培养基中暗培养 0、5、10、15、20、
25 和 30d ,每隔 4d 从暗培养条件下取出 5 瓶转入光下
培养。40d 后 ,统计各处理分化的外植体数、再生的不
定芽数及不定芽的生长状况[8 ,9 ] 。
所有处理重复 3 次 ,用 SAS 软件对数据进行差异
性分析。
2 　结果与分析
211 　不同种类和浓度的植物生长调节剂对不定芽分
化的影响
MS培养基中附加不同浓度的 62BA、NAA 和 2 ,42
D ,结果表明 (表 1) ,植物生长调节剂种类和组合对不
定芽的分化影响很大。单独使用 62BA 仅得到较低的
再生率和不定芽数 ;仅添加 2 ,42D 的培养基中外植体
虽然有大量愈伤组织出现 ,但很少有不定芽的分化 ,说
明 2 , 42D 不利于蓝刺头叶片不定芽再生。62BA 和
NAA 配合使用的效果要明显优于单独使用 62BA 或 2 ,
42D ;其中以 62BA 110mg·L - 1加 NAA 011mg·L - 1组合的
效果最好 ,不定芽再生率达到 48133 % ;但是随着 62BA
浓度的增大 ,不定芽的分化率以及平均每个外植体再
生芽数反而降低 ,并且随着植物生长调节剂浓度的增
加 ,不定芽的玻璃化现象加重。因此 ,蓝刺头叶片再生
最适分化培养基为 MS + 62BA 110mg·L - 1 + NAA 011mg
·L - 1 。
212 　不同浓度的硝酸银对不定芽分化的影响
在最适分化培养基中添加不同浓度的硝酸银 ,对
不定芽的再生影响较大。由表 2 可以看出 ,添加硝酸
银后不定芽的再生率以及不定芽数都显著高于对照。
在 0～210mg·L - 1 范围内 ,随着硝酸银浓度的增加 ,不
定芽再生率和芽数逐渐增加 ,而且玻璃化苗减少 ;但达
到 410mg·L - 1后 ,硝酸银对叶片再生表现出抑制作用 ,
再生苗的叶片表现出不健康的黄白色。综合来看 ,以
添加 210mg·L - 1的硝酸银效果最佳 ,不定芽再生率和
芽数分别达到了 80133 %和 3118 ,且再生苗生长健壮 ,
生长势强。
表 1 　不同的生长调节物质组合对蓝刺头不定芽分化的影响
Table 1 　Effects of different growth regulators on shoot
regeneration of Echinops latifolius Tausch
植物生长调节剂
plant growth regulator (mg·L - 1)
62BA NAA 2 ,42D 不定芽再生率shoot regenerationfrequency ( %) 平均每个外植体再生的芽数mean number ofbuds per explant
011 6167 c 0183 c
015 5100 c 1117 bc
110 8133 c 1100 bc
011 3133 c 1100 bc
015 0 0
110 0 0
110 011 48133 a 3156 a
210 011 18133 b 2163 ab
310 011 26167 b 1102 bc
注 :不同字母表示差异显著 ( p = 0105) ,下表同。
Note : Different letters within columns represent significantly diffrent at p = 0105
level , the same as the following tables.
　　本试验发现 ,加入硝酸银后 ,不定芽的再生途径发
生了改变 ,不再是单纯通过愈伤组织途径 ,而是以直接
形成不定芽的途径为主。多数研究证明 Ag+ 能促进植
株再生 ,直接诱导生成不定芽而减少愈伤组织的形
成[11 ,12 ] ,本研究结果与之一致。
表 2 　添加不同浓度的硝酸银对蓝刺头不定芽分化的影响
Table 2 　Effects of AgNO3 on shoot regeneration of
Echinops latifolius Tausch
硝酸银浓度
AgNO3
concentration (mg·L - 1)
不定芽再生率
shoot regeneration
frequency( %)
平均每个外植体再生的芽数
mean number of
buds per explant
0 41167c 1118c
015 50100bc 1189b
110 70133ab 2181a
210 80133a 3118a
410 65100bc 3106a
213 　不同时间的暗培养对不定芽分化的影响
将叶片接种于最适分化培养基上 ,不同时间的暗
培养后置于光下培养 ,发现暗培养不仅能提高叶片不
定芽的再生率和再生芽数 ,而且也缩短了不定芽再生
的时间。由表 3 可以看出 ,随着暗培养时间的延长 ,不
定芽再生率逐渐增加 ,但 20d 以后再生率呈现下降趋
势 ,而且不定芽生长势减弱 ;就平均每个外植体再生芽
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数来看 ,对照与暗培养 5、10、15、25 及 30d 的均无显著
差异。因此 ,综合不定芽再生率、不定芽数和不定芽生
长状况 ,叶片再生以暗培养 15d 的效果为佳。
表 3 　暗培养对蓝刺头不定芽分化的影响
Table 3 　Effects of dark culture on shoot regeneration of Echinops latifolius Tausch.
暗培养天数
dark days(d)
不定芽再生率
shoot regeneration
frequency( %)
平均每个外植体再生的芽数
mean number of
buds per explant
不定芽生长状况
growth status
0 53133b 3131ab 长势较强 ,外植体边缘褐化严重
stronger growth vigour , with serious browning at the edge of explants
5 56167b 2176ab 长势较强 ,外植体边缘稍有褐化
stronger growth vigour , with a little browning at the edge of explants
10 56167b 3115ab 长势较强 ,外植体边缘有褐化
stronger growth vigour , with browning at the edge of explants
15 63133ab 2173ab 长势较强 ,玻璃化程度轻 ,外植体边缘少有褐化
stronger growth vigour , with light vitrification and little browning at the edge of explants
20 81167a 2119b 长势弱 ,玻璃化严重 weaker growth vigour , strong vitrification
25 51167b 3168a 同上 , the same as above
30 48133b 3103ab 同上 , the same as above
图 1 　蓝刺头叶片的再生不定芽
Fig. 1 　Plant regeneration from leaves of Echinops latifolius Tausch.
A :接种于最适分化培养基上 20d 的外植体 ;B :接种于最适分化培养基上 40d 的外植体 ;
C :添加 210mg·L - 1硝酸银的培养基上培养 15d 的外植体 ;D :在添加硝酸银的培养基中生长 30d 后 ,
转入 MS中生长 15d 的外植体 ; E :暗培养 15d 的外植体 ;F :暗培养 15d 再转到光下培养 30d 的外植体
A :explant cultured on optimum medium for 20 days ; B : explant cultured on optimum medium for 40 days ;
C : explant on medium added 210 mg·L - 1 AgNO3 for 15 days ;D : cultured on medium with AgNO3 for 30 days , then transported on
MS medium for 15 days ; E:explant cultured under dark condition for 15 days ; F :cultured under dark
incubation for 15 days , then grow in illumination for 30 days.
3 　讨论
蓝刺头叶片不定芽的分化受外源生长调节物质的
影响较大。本试验发现 ,在培养基中单一加入 62BA 效
果不好 ,叶片不定芽数和再生率都很低 ;加入 2 ,42D 虽
能诱导叶片产生大量愈伤 ,但几乎没有不定芽的分化。
其他一些研究也表明 ,2 ,42D 对愈伤诱导作用明显 ,但 却强烈抑制芽的形成 ,其原因目前尚不清楚[12 ] 。本试验中 ,暗培养可显著提高蓝刺头叶片的再生率 ,而且缩短了不定芽分化的时间。这与其他一些研究结果也是一致的[13 ] ,其原因可能是暗培养条件下IAA 分解减少 ,从而提高了 IAA 的浓度 ,刺激了不定芽的产生。其机理还需进一步的研究。许多研究表明 ,Ag + 是一种乙烯抑制剂 ,由于它的存在 ,乙烯不能干扰多胺的合成。因此 ,Ag+ 通过促进
385　6 期 蓝刺头组织培养和叶片再生植株的研究
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多胺的合成提高植株再生率。张鹏等报道 ,在培养基
中附加 AgNO3 (2～12mg·L - 1 ) 能明显诱导不定芽的再
生[14 ] ,这与本研究的结果一致。而蒋细旺等在菊花
( Dendranthema morifolium) 的培养中加入 AgNO3 后 ,反
而抑制了不定芽的再生 ,这可能是由于基因型的差异 ,
导致了不同的植物对 AgNO3 反应不一致[15 ] 。在本研
究中 ,添加硝酸银显著促进了蓝刺头叶片分化不定芽 ,
而且不定芽的再生途径也变成以直接发生为主 ,其原
因有待于进一步从细胞学水平进行研究验证。
参考文献 :
[ 1 ] 　中国科学院中国植物志编辑委员会编. 中国植物志 ,第七十八
卷 ,第一分册. 北京 :科学出版社 ,1987
[ 2 ] 　石　雷 ,张金政 ,斯琴毕力格主编. 防沙治沙 植物资源及其利用.
北京 :中国科学技术出版社 ,2003
[ 3 ] 　Murch S J , Wierenga E J , El2Demerdash M A , Saxena P K. In vitro
propagation of the Egyptian medicinal plant , Echinops spinosissimus
Turra. Plant Cell , Tissue and Organ Culture ,2003 , 74 : 81～86
[ 4 ] 　果德安 ,楼之岑 ,等. 华东蓝刺头根挥发油成分的研究. 中国中药
杂志 ,1994 , (02) :100～101
[ 5 ] 　De2An Guo , Sheng2Hua Li . Morphological and histological studies on
chinese crude drug“loulu”. Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences ,
1994 , (01) :18～29
[ 6 ] 　刘　　 ,叶 　冠 ,等. 华东蓝刺头地上部分化学成分研究. 中草
药 ,2004 , (01) :18
[ 7 ] 　李华民 ,曹坳程 ,等. 砂蓝刺头中的三萜类化合物研究. 中草药 ,
2002 , (04) :306
[ 8 ] 　刘翠琼 ,汤浩茹 ,等. 不同基因型梨叶片离体培养和植株再生. 园
艺学报 ,2005 ,32 (6) :1080～1083
[ 9 ] 　秦永华 ,张上隆 ,等.‘丰香’草莓叶片高效再生体系的建立. 园艺
学报 ,2005 ,32 (1) :101～104
[10 ] 　Chraibi B K M , Latche A , Roustan J P , Fallot J . Stimulation of shoot
regeneration from cotyledons of Helianthus annuus by the ethylene
inhibitors , silver and cobalt . Plant Cell Reports , 1991 ,10 (4) :204～
207
[11 ] 　Yang XiaoHan , Jin Bo , Zhang Yan , Mu Ding , Tang XueMei .
Enhancement of direct shoot regeneration from internode segments of
chrysanthemum by silver nitrate. Acta Horticulturae , 1995 ,404 : 68～
731
[12 ] 　李浚明译. 植物组织培养教程. 北京 :中国农业大学出版社 ,2002
[13 ] 　师校欣 ,杜国强 ,等. 黑暗培养对苹果组培快繁及叶片再生的影
响. 河北农业大学学报 ,2004 ,27 (4)
[14 ] 　张鹏 ,凌定厚. 提高菜心离体植株再生频率的研究. 植物学报 ,
1995 ,37 (11) :902～908
[15 ] 　蒋细旺. 根癌农杆菌介导的 Bt 与 GNA 基因转化菊花品种的研
究. 华中农业大学博士学位论文 ,2003
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