全 文 ：© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
文章编号 :100028551 (2001) 0520290204
创伤诱导苹果离体叶片高效
直接体细胞胚胎发生
达克东 张 松 米瑞芙 周志文 魏钦平 束怀瑞3
(山东农业大学园艺系 ,山东 泰安 271018)
摘 要 :以苹果品种“嘎拉”试管苗叶片为试材 ,建立了苹果离体叶片高效直接体细胞
胚胎发生体系 ,研究了创伤处理对外植体直接体细胞胚胎发生的效应。结果显示 ,创
伤处理提高了外植体直接体细胞胚胎发生率和单位外植体体细胞胚胎产量 ,其中 ,各
处理效应大小依次为 :刺伤 > 横切 > 纵切 ;一定范围内随横切次数和刺点数增加 ,外
植体直接体细胞胚胎发生率保持稳定的高水平 ,单位叶片直接体细胞胚胎产量逐渐
增加。刺 8 点时直接体细胞胚胎发生率由对照的 65 %增至 100 % ,直接体细胞胚胎
再生数量由对照的 219Π叶增至 2612Π叶。
关键词 :苹果 ;叶片 ;直接体细胞胚胎 ;创伤
收稿日期 :2000211222
作者简介 :达克东 (1967～) ,男 ,甘肃兰州人 ,博士 ,主要从事植物生物技术和辐射研究
建立高效苹果离体叶片直接体细胞胚胎发生体系 ,对于苹果诱变育种、遗传工程和植物体
细胞胚胎发生机理的阐明具有重要意义。苹果离体叶片培养直接体细胞胚胎发生已见报道 ,
但胚状体分化频率和单位叶片胚状体产量偏低的问题仍未解决[1 ] 。如何提高苹果离体叶片直
接体细胞胚胎发生率和单位叶片直接体细胞胚胎产量是本文的研究目的。已经研究过的影响
植物外值体直接体细胞胚胎发生的因素有外植体遗传类型、外植体来源、年龄、激素配比、糖、
含氮化合物和光照等[2 ] ,本文报道创伤对外植体直接体细胞胚胎发生的影响。
1 材料与方法
111 材料
苹果 Malus domestica Borkh. 栽培品种嘎拉 ( Gala)试管苗由本室保存。
112 方法
11211 苹果体细胞胚胎发生培养基 1) 胚性细胞诱导条件 MS 附加 BA 110mgΠL、NAA 5mgΠL
和 2142D 015mgΠL。2)胚胎发生诱导条件为 MS 附加 BA 1mgΠL。
11212 创伤处理方法 1) 横切和纵切 :垂直叶脉切割称为横切 ;顺叶脉切为等份称为纵切。
2)横切次数 :将叶片横切为大小相近的 3 块为横切 2 次 ,类推可切 3 次、4 次 ,本实验最多切 4
次 (图版 Ⅰ21) 。3)刺伤处理 :将叶片在垂直于叶脉等分线的 1Π4 和 3Π4 处各刺 1 点为刺 2 点 ,3
分线的 1Π4 和 3Π4 处各刺 1 点为刺 4 点 ,类推可刺 6 点、8 点 ,本实验最多刺 8 点 (图版 Ⅰ- 2) 。
11213 培养方法 具体培养方法见参考文献 [ 1 ]。培养基 pH 值 518 ,121 ℃高温高压灭菌
20min。每平皿接种叶片 3 片 ,每处理 20 皿。
092 核 农 学 报 2001 ,15 (5) :290～293Acta Agriculturae Nucleatae Sinica
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2 结果与分析
211 横切与纵切对体细胞胚胎发生率和体细胞胚胎产量的效应
表 1 结果显示 ,无论横切或纵切都提高了叶片直接体细胞胚的发生率和产量 ,而且横切比
纵切效果好。这是由于生长素是胚性细胞诱导所必须 ,生长素在叶片中由叶脉运输 ,两种切割
方式对生长素输通道的损伤作用不同 ,纵切后尽管使生长素运输距离缩短 ,利用率提高而使分
化率和产量提高 ,但也使叶片主脉受损而使生长素运输不畅。横切后叶片主脉尽管也受损伤
但比纵切损伤程度轻 ,同时横切造成的创伤面积小于纵切 ,所以横切处理体细胞胚发生率和产
量高于纵切。从外植体表型变化看 ,纵切处理比横切处理变化剧烈 ,表现为外植体愈伤化和卷
曲严重。从再生体胚的部位看横切处理后体胚再生部位比较固定 ,多在外植体形态学下端及
近伤口部位发生 (图版 Ⅰ25) ,而纵切后体胚仅在近伤口部位发生。
表 1 横切和纵切对叶片体细胞胚胎发生的效应
Table 1 Effect of cutting on somatic embryogenesis (SE) of apple leaf
切割处理
cutting treatment
再生率
regeneration rate
( %)
产量
No. of SE
regenerated
再生类型
type of regeneration
直接
direct
间接
indirect
横切
latitudinal cutting 96 437 407 30
纵切
longitudinal cutting 71 265 173 92
对照 control 65 168 168 0
212 横切次数对叶片体细胞胚发生率和产量的影响型
表 2 结果显示 ,随横切次数增加 ,叶片分化百分率变化不大而体细胞胚胎产量明显增加 ,
说明切割次数不同对体细胞胚胎发生具有不同的效应。随横切次数增加 ,间接类型体细胞胚
胎发生数量有增加趋势 ,则说明切割处理后为了仍然得到直接体细胞胚胎发生 ,可以通过减少
胚性细胞诱导时间来实现 (图版 Ⅰ23) 。
表 2 横切次数对叶片体细胞胚发生的影响
Table 2 Effect of cross cutting times on somatic embryogenesis (SE) of apple leaf
横切次数
latitudinal cutting times
再生率
regeneration rate
( %)
产量
No. of SE regenerated
再生类型
type of regeneration
直接
direct
间接
indirect
1 次 once 96 437 407 30
2 次 twice 97 751 735 16
3 次 three times 100 1286 1265 21
4 次 four times 97 1869 1809 60
对照 control 65 168 168 0
213 刺伤对叶片体细胞胚胎发生的影响
表 3 结果显示 ,随刺点数增加 ,体细胞胚胎发生率变化不大而产量增加. 刺伤后外植体仅
发生直接类型体细胞胚胎 ,发生部位一般在刺伤口周围 ,并且距离伤口越近发生量越多 ,越远
192 5 期 创伤诱导苹果离体叶片高效直接体细胞胚胎发生
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发生量越少 (图版 Ⅰ24) ,表明刺伤对体细胞胚胎发生具有距离效应。由伤口脱分化的愈伤组
织上无体细胞胚胎发生 (图版 Ⅰ26) 。
表 3 刺伤对叶片体细胞胚胎发生率和产量的影响
Table 3 Effect of pricking on somatic embryogenesis (SE) of apple leaf
刺点数目
No. of pricking
再生率
regeneration rate
( %)
产量
No. of SE regenerated
再生类型
type of regeneration
直接
direct
间接
indirect
刺伤 2 次 2 pricks 100 729 729 0
刺伤 4 次 4 pricks 97 1385 1385 0
刺伤 6 次 6 pricks 97 1763 1763 0
刺伤 8 次 8 pricks 100 2326 2326 0
对照 control 65 168 168 0
图版 Ⅰ:
11 叶片切割处理后的情况 ( ×015) ; 21 叶片刺伤处理后的情况 (经 7d 胚性细胞诱导 , ×1) ;31 切割 4 次后直接体细胞胚胎
发生情况 ( ×015) ; 41 刺伤 6 点后直接体细胞胚胎发生情况 ( ×1) ; 51 直接体细胞胚胎在切割伤口附近发生 ( ×40) ; 61 直
接体细胞胚胎在刺伤伤口附近发生 ( ×30) 。
Plate Ⅰ:
1. cutting treatment of leaves ×(015) ; 2. pricking treatment of leaves(after 7 days of embryonic cell induction , ×1) ; 3. direct somatic
embryogenesis after cutting treatment ( ×015) ; 4. direct somatic embryogenesis after pricking treatment ( ×1) ; 5. direct somatic embryo
regenerated near wounding region (cutting treatment , ×40) ; 6. direct somatic embryo regenerated near wounding region (pricking treat2
ment , ×30) .
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3 讨 论
关于创伤诱导高效直接体细胞胚胎发生的机制 ,有 3 种假说 ,第一种假说是切割促进植物
对外源生长激素的吸收 ,直接证据是切割后外植体更大的界面接触外源生长素 (培养基) 而产
生大量的根和愈伤组织 ;第二种假说是切割改进了外源生长素向感受态组织的运输和刺激该
部位内源植物生长素的产生 ,证据是切割后体细胞胚胎多数由伤口附近细胞中与体细胞胚胎
发生有关基因的表达。第三种假说是基因开关假说 ,创伤处理首先刺激创伤细胞中和愈合有
关的基因表达而使伤口部位成为一个制造和调运有机物和激素能力很强的部位 ,调运包括外
部调运和内部调运 ,内部调运的过程又是信息传递和交换的过程 ,当创伤附近未受伤组织细胞
接受传递来的创伤信息时 ,该细胞中与体细胞胚胎发生有关的基因开始表达 ,最终产生体细胞
胚胎。创伤后体细胞胚胎多在伤口附近未受伤组织直接发生 ,则表明创伤信息诱导体细胞胚
胎发生基因表达具有距离效应 (即在一定距离范围内传递)和位置效应 (特定位置) 。
创伤作为一种逆境 ,可以诱导植物自我保护系统发挥作用 ,其中包括脂氧合酶基因的表
达[3 ] ,茉莉酸和蛋白酶抑制剂的产生等[4 ] 。创伤又可诱导钙调素蛋白的激活 ,使细胞内活性钙
增加 ,现在已经知道 ,钙二价阳离子作为第二信使具有传递信息、修饰激素进而调控生理生化
过程的作用。体细胞胚胎发生作为植物自我保护反应的最复杂过程之一 ,创伤在此过程中如
何诱导细胞中与体细胞胚胎发生有关的基因的表达及直接体细胞胚胎发生由多少基因控制有
待进一步研究。
参考文献 :
[ 1 ] 达克东 ,张松 ,李雅志 ,等. 苹果离体叶片培养直接体细胞胚胎发生研究. 园艺学报 ,1996 ,23 (3) :241～245
[ 2 ] 周俊彦.植物体细胞在组织培养中产生的胚状体 Ⅱ影响植物胚状体发生和发育因素.植物生理学报. 1982 ,8(2) :91～99
[ 3 ] David M S ,James N S. The differential expression of wound2inducible lipoxygenase genes in soybean leaves. Plant Physiol . 1996 ,110 :
287～2995
[ 4 ] Green T R ,Ryan C A. Wuond2induced proteinase inhibition in plant leaves :a possible defence mechanism against insects. Science ,.
1972 ,175 :776～777
WOUNDING INDUCED EFFICIENT DIRECT SOMATIC EMBRYOGENESIS IN APPLE LEAVES
DA Ke2dong ZHANG Song MI Rui2fu ZHOU Zhi2wen WEI Qin2ping SHU Huai2rui
( Department of Horticulture , Shandong Agricultural University , Taian Shandong prov . 271018)
ABSTRACT :A procedure of eff icient direct somatic embryogenesis from in vitro leaves of apple
cultivar has been developed. Effect of wounding ( pricking , latitudinal cutting and longitudinal
cutting) on direct somatic embryogenesis from in vitro leafves of apple was studied. The results
showed that effect of pricking was most effective. Regeneration rate and yield of direct embryos in2
creased from 65 % to 96 %and 219Πleaf to 2612Πleaf , respectively when 8 pricks were made on a
leaf .
Key words :apple ; leaf ; culture in vitro ; somatic embryo ; wounding
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2001 ,15 (5) :290～293