全 文 ：文章编号 :100028551 (2007) 022160204
辐照对虾过敏原生化性质的影响
顾可飞　高美须　李春红　李淑荣　潘家荣
(农业部农业核技术与农产品加工重点实验室Π中国农业科学院农产品加工研究所 , 北京　100094)
摘 　要 :研究了以 0、3、5、7、10kGy 的辐照处理对虾过敏原的生化性质的影响。结果表明虾过敏原 ( Pen a
1)提取液经辐照处理后 ,过敏原蛋白质的结构发生了变化 ,浊度和疏水性增加。并发现 Pen a 1 的溶液
状态要比固体状态及活体状态对辐照处理更敏感。
关键词 :虾过敏原 ;辐照 ;过敏原生化性质
EFFECT OF IRRADIATION ON BIOCHEMISTRY PROPERTIES OF SHRIMP ALLERGEN
GU Ke2fei 　GAO Mei2xu 　LI Chun2hong 　LI Shu- rong 　PAN Jia2rong
( Institute of Agro2food Science & Technology , Chinese Academy of Agricultural SciencesΠKey Laboratory of Agricultural
Nuclear Technology and Agro2Food Processing of MOA , Beijing 　100094)
Abstract :Study on the effects of 60 Coγ- rays irradiation at the dose of 0、3、5、7、10kGy on shrimp allergen biochemistry
properties was conducted. The results indicated that the allergen protein molecule can be broken down to smaller molecules or
coagulated to larger molecules by irradiation. The hydrophobicity and turbidity of irradiated allergen increased with the increase
of absorbed dose. The results also show that allergen solution is more sensitive to irradiation than allergen in solid state or in
the whole shrimp .
Key words :shrimp allergen ;irradiation ;allergen bio2chemistry properties
收稿日期 :2006210220
基金项目 :国家自然科学基金资助项目 (30470999)
作者简介 :顾可飞 (19772) ,女 ,黑龙江龙江人 ,硕士研究生 ,专业方向为致敏蛋白与食品安全。E2mail :xyz694 @hotmail . com
通讯作者 :高美须 (19652) ,女 ,副研究员 ,从事食品辐照研究和应用 ,E2mail :meixugao @21cn. com ;潘家荣 (19642) ,男 ,研究员 ,博士 ,从事食品安全
和生物物理研究。Tel :010262815875 ; E2mail :panjr @2631net
　　食物过敏作为食源性疾病的一种已引起了人们的
普遍关注。根据流行病学调查 ,美国每年约有 2 %～
215 %的人发生食物过敏 ,儿童及婴幼儿的发病率约
5 %～8 %。澳洲每年有 600 例过敏性病症发生 ,在
2004 年食品企业的召回产品中 ,过敏食品比例就达
47 %[1 ] 。据不完全统计 ,我国的发病率高于发达国
家[2 ,3 ] 。近年来 ,有关食源性虾过敏的报道屡见不
鲜[4 ,5 ] 。在联合国粮农组织提出的八大类引起过敏的
食物之中 ,虾与蟹等甲壳类动物及其制品是重要的一
类[6 ,7 ] ,因此研究过敏原对保护消费者食品安全有着积
极的意义。
研究发现分子量为 36KD 的热稳定性蛋白原肌球
蛋白 (TM) 是虾中主要过敏原[8 ] 。据 Lee 和 Myung2woo
byun 等报道辐照可降低虾致敏性[9～11 ] 。本研究以我
国对虾的原肌球蛋白为研究对象 ,分析了其辐照前后
生化性质的变化 ,以期为我国食品脱敏技术的研究提
供知识贮备。
1 　材料与方法
111 　材料与试剂
11111 　材料和设备 　对虾构自中国农业大学超市发
超市 ;虾过敏患者血清由中国海洋大学林洪教授提供。
主要实验设备有 DYY26C 型电泳仪、DYCZ224D 型垂直
电泳仪 (北京六一仪器厂) ;荣华 FS21 高速可调匀浆机
(江苏荣华仪器厂) ;TGL216A 高速冷冻离心机 (长沙平
凡仪器厂) ;F22500 荧光分光光度计 (日立) ;6300 紫外
分光光度计 (日立) ; Genesis25XL 冷冻干燥机 (美国
061　 核 农 学 报　2007 ,21 (2) :160～163Journal of Nuclear Agricultural Sciences
Virtis)等。
11112 　药品与试剂 　BSA、丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、
十二烷基磺酸钠、巯基乙醇、低分子量标准蛋白质等构
自美国 Sigma 公司。
112 　方法
11211 　虾过敏原的提取与纯化 　提取方法同 Myung2
woo byun 等的方法并略做修改[11 ] 。冷冻虾解冻 ,蒸馏
水中煮沸 10min ,去虾壳及背部黑静脉后 ,于 0115molΠL
磷酸盐缓冲液 ( PBS) 中 , 10000rmpΠmin 匀浆机匀浆 ,
11000rmpΠmin 下离心 30min ,去除沉淀。上清经硫酸铵
沉淀 (60 %)和等电点 (pH415) 沉淀 ,该沉淀过程重复 3
次后离心 ,沉淀溶于 PBS 中透析 6h ,共透析 3 次。将
提取物分成 2 份 , 1 份提取液直接冻存 ( allergen
solution) ,1 份冷冻干燥制成干粉 (allergen powder) 。
11212 　虾过敏原鉴定 　用 15 %的分离胶、5 %的浓缩
胶将蛋白质电泳分离后 ,在 290mA 下转印 1h ,取出硝
酸纤维膜 (NC膜) ,室温下在封闭液中封闭 2h ,用含有
吐温 1 %的磷酸盐缓冲溶液 (以下称 TBST) 洗 3 次 ,加
封闭液 10ml、抗血清 10μl ,37 ℃下反应 2h 后 ,用 TBST
洗 3 次 ,加入生物素标记二抗 ,37 ℃下反应 2h ,再用
TBST洗膜 3 次 ,加入辣根过氧化物酶标记的亲和素反
应 2 h ,洗后加入 DAB 底物显色 ,用水冲洗终止反应。
11213 　辐照处理 　辐照在本所半商业化钴源进行。
虾提取液 (018mgΠml)及提取蛋白干粉 (012g ) 置于试管
中 ;全虾 (真空包装) 于室温下辐照。辐照剂量分别为
0、3、5、7、10kGy ,剂量率为 7GyΠmin。每处理 3 次重复。
辐照后所有样品立即贮于 - 20 ℃冰箱中。
11214 　过敏原蛋白质浓度、浊度、疏水性的测定　过
敏原提取液直接测定 ;过敏原干粉溶于 5ml PBS 液中
测定 ;蛋白质浓度采用考马斯亮蓝 G2250 染色法 ;蛋白
质浊度于 280nm 下直接测定消光值[10 ] 。
利用 ANS 做荧光探针法测定疏水性 :在 4ml 的蛋
白质液中加入 30μl 的 ANS 液混匀 ,室温下放置 2h ,在
激发波长 385nm 做发射波长在 420～550nm 范围内荧
光强度扫描。
11215 　过敏原分子量测定 　虾过敏原提取液及干粉
经 15 %分离胶、5 %浓缩胶 SDS2PAGE 电泳分离。辐照
后全虾提取方法同 11211 ,提取后。
11216 　数据分析　采用 DPS(3101 版)进行数据分析。
2 　结果与分析
211 　过敏原蛋白质的鉴定
粗提后虾过敏原蛋白质免疫转印图谱见图 1。从
图 1 　虾蛋白质抽提物免疫转印图谱
Fig. 1 　SDS2PAGEΠimmunoblotting profiles of
shrimp protein extracts
1 :粗提后过敏原 ;M:标准蛋白
1 :crude ouergen extract ;M:marker
图中可以看出 ,在 36KD 处出现一条蛋白质带 ,并且此
蛋白质与过敏患者阳性血清有强亲和反应 ,证明为过
敏原。这与前人报道的虾中主要蛋白质过敏原为 Pen
a 1 相符[12～13 ] 。
212 　辐照对过敏原分子量的影响
图 2 　过敏原的电泳图谱
Fig. 2 　SDS2PAGE profiles of shrimp protein extracts
1 和 M同上 ;2 :纯化后过敏原 (提取后冻干)
1 and M same to Fig. 1 ; 2 :purified extract (extract powder)
图 2 为不同提纯程度过敏原的电泳图谱。从图 2
中可以看出 ,过敏原粗提液经电泳分离后 ,提取纯化后
出现 2 条带 ,分别为 36KD 过敏原蛋白质和约 20KD 未
知蛋白 ,再经硫酸盐分级沉淀及等电点法纯化后 ,
20KD 蛋白质被去除 ,图上仅存 36KD 过敏原蛋白质。
辐照处理后过敏源的电泳图谱见图 3。从图 3 可
见 ,辐射处理后 ,过敏原溶液中的致敏蛋白消失 ,并出
现了大分子量的蛋白质带。而过敏原冻干粉在大于
3kGy 剂量时 ,才出现了高分子量 ( > 36KD) 和低分子量
( < 36KD)的蛋白质 ,且过敏原的蛋白质量随着辐照剂
量的增加而减少。全虾辐照后的提取液 ,其变化程度
161　2 期 辐照对虾过敏原生化性质的影响
　　　
图 3 　辐射处理后过敏原的电泳结果
Fig. 3 　SDS2PAGE profiles of irradiation shrimp protein extract
A :致敏蛋白 ;B :未知蛋白 ;0、3、5、7、10kGg 辐照处理
A :allergen protein ; B :unknow protein ;irradiation treatment at 0 ,3 ,5 ,7 ,10kGg
不大 ,在 7kGy 以上剂量处理时 ,才依稀可见高、低分子
量的蛋白质 ,表明过敏原以溶液状态存在比全虾状态
及固体状态对辐照处理更为敏感。
212 　辐照对过敏原蛋白质浓度及浊度的影响
表 1 为辐射后过敏原浓度的变化。过敏原提取液
经辐照处理后 ,浓度有显著的变化。而冻干过敏原的
浓度差异不显著 ,可能因为辐照处理使蛋白质浊度增
加 ,影响了测定的结果。
表 2 表明 ,过敏原提取液浊度随剂量的增加而增
加 ,且各处理之间、处理与对照之间均有显著性差异。
冻干过敏原浊度除 3kGy 与对照无显著性差异 ,其余各
处理与对照均有显著性差异 ,且各处理之间也存在着
显著性差异。
比较这两种不同存在状态的过敏原浓度和浊度的
变化情况 ,发现冻干过敏原浊度和浓度变化程度均小
于溶液状态的变化程度。
表 1 　辐射对过敏原浓度的影响
Table 1 　Effect of irradiation on allergen concentration
处理样品
allergen
辐射剂量 irradiation dose (kGy)
0 3 5 7 10
提取液 solution 01472 A 01495 B 01522 B 01525 C 01586 D
冻干粉 powder 01414 A 01425 AB 01427 AB 01425 AB 01428 B
　　注 :数据后带有相同大写字母表示在 0101 水平差异不显著。下表
同。
Note :The data followed by same capital letters indicated no significant at 0101
level . The same as following Table.
表 2 　辐射对过敏原浊度的影响
Table 2 　Effect of irradiation on allergen turbidity
处理样品
allergen
辐射剂量 irradiation dose (kGy)
0 3 5 7 10
提取液 solution 31517 A 31764 B 31811 C 31835 D 31865 E
冻干粉 powder 31184 A 31225 A 31237 B 31257 C 31261 D
214 　辐射对过敏原蛋白质疏水性的影响
ANS(八苯氨基萘磺酸) 荧光探针在水溶液中基本
不发光 ,而与蛋白质结合时会发出很强的荧光 ,其
470nm 时荧光强度与蛋白质的疏水性成正相关性。辐
照处理过敏原溶液及冻干粉疏水性的测定结果如图 4
所示。
图 4 　辐照对冻干粉疏水性的影响
Fig. 4 　Effect of irradiation on allergen hydrophobicity
A :过敏原溶液 ;B :过敏原冻干粉 ;
1、2、3、4、5 为 0、3、5、7 和 10kGy 辐照处理
A :allergen solution ; B :allergen powder ; 1 ,2 ,3 ,4 ,5 mean irradiation
treatment at the dose of 0 ,3 ,5 ,7 and 10kGy , respectively
从图 42A 可以看出 ,经辐照处理的过敏原溶液疏
水性随辐射剂量增加而增大 ,并在 7kGy 剂量下出现最
大值 ,这可能是随着辐照剂量增加 ,过敏原蛋白质首先
261 核　农　学　报 21 卷
发生空间结构的改变 ,疏水基团暴露 ,疏水性增加 ,当
达到一定剂量 (7kGy) 时 ,蛋白质则发生分解、交联、聚
合等变化 ,使蛋白质的部分疏水基团破坏或受到掩盖
而致。
图 42B 表明冻干粉溶液疏水性同样随辐射剂量增
加而增大。统计分析表明 ,过敏原溶液各处理的疏水
性均与对照有显著性差异。冻干粉除 3kGy 与对照无
显著性差异 ,其余处理与对照和 3kGy 也均有显著性差
异 ,这说明辐照处理使蛋白质分子空间结构发生变化 ,
疏水性基团发生不同程度外露。
3 　讨论
原肌球蛋白是由二条肽链互相缠绕成α2螺旋结
构 ,每条链含 284 个氨基酸残基 ,长约 41nm[14 ] 。这是
一种在肌原纤维中最稳定的蛋白质 ,沸水处理后仍具
很强的致敏性。本研究发现辐照处理的 Pen a 1 (为对
虾过敏原蛋白) ,溶液的浊度、疏水性均随着辐照剂量
的增加而增加 ,出现了高分子量及低分子量的蛋白质。
这一结果表明 ,辐照处理使 Pen a 1 分子首先发生分子
空间构象的改变 ,双螺旋解聚 ,双链打开 ,疏水基团外
露 ,使其溶解性降低。当辐照剂量继续增加时 ,其疏水
性则有所减弱 ,说明蛋白质肽链发生聚合、交联、解聚、
断裂等一系列的变化 ,出现大、小分子量的蛋白质 ,Pen
a 1 分子完整的一级结构遭到破坏 ,丧失生物活性。过
敏原引起过敏反应 ,必须具备免疫原性 ,也即过敏原分
子必须具备抗原表位。抗原表位一般有两种 :线性表
位和构象表位 ,并以线性表位为主。线性表位一般由
蛋白质的一级结构约 16～18 个氨基酸残基组成。过
敏原蛋白质的上述改变如果发生在抗原表位所在氨基
酸序列 ,则可破坏其抗原表位或使其受到掩盖 ,而使其
丧失致敏性 ,这也证实了前人的研究结果 ,即辐照可降
低虾过敏原致敏性。
另外 ,本研究还发现处于不同状态的过敏原对辐
照处理敏感性不同 ,处理溶液状态较固态和全虾状态
对辐照敏感 ,这结果也给未来的脱敏技术的应用带来
新的问题 ,如何达到较佳的脱敏效果 ,仍需做进一步努
力。
致谢 :中国海洋大学林洪教授和李振兴博士提供
实验所用的血清 ,并帮助完成免疫印迹实验 ,在此表示
感谢。
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