全 文 ：文章编号 :100028551 (2004) 052397205
化学因子对膜脂组分的影响与诱导抗病作用的关系
曾富华1 　吴岳轩2 　郑小林1
(11 湛江师范学院应用生命科学技术研究所 ,广东 湛江　524048 ;21 湘潭师范学院生物系 ,湖南 湘潭　411201)
摘 　要 :本研究结果表明 ,抗病品种余水糯 O2·2 含量和 MDA 含量比感病品种浙辐 802 高 ,而 CAT
活性和 POD 活性则相反。PQ 处理使两品种产生系统抗性的同时 ,也使处理叶中 CAT 活性、
POD 活性及 MDA 含量升高。这种变化从 24h 开始 ,在 48～72h 达较高水平。余水糯和浙辐
802 处理叶中平均 CAT活性分别升高 1615 %和 1113 % ,平均 POD 活性分别升高 3712 %和
2513 % ,平均 MDA 含量分别升高 3815 %和 3212 %。PQ 处理后第 3 天 ,浙辐 802 处理叶中膜
脂酸相对含量变化较大 ,饱和脂肪酸增加 1118 % , IUFA 降低 715 % , IUFA 降低主要是由亚麻
酸 (18∶3)含量减少所致。Trion 使 PQ 对处理叶中各指标的影响及对 XOO76225 的诱导抗病作
用减弱。
关键词 :活性氧 ; 诱导抗性 ; 膜脂酸 ; 水稻
RELATION BETWEEN CHANGES OF MEMBRANE LIPID COMPOSITIONS
AND DISEASE RESISTANCE INDUCED BY CHEMICAL FACTORS
ZENG Fu2hua1 　WU Yue2xuan2 　ZHENG Xiao2lin1
(11Applied Institute of Life Science , Zhanjiang Normal College , Zhanjiang , Guangdong , 　524048
21 Department of Biology , Xiangtan Normal College , Xiangtan , Hunan , 　411201)
Abstract :Two rice cultivars , Yushuinu (resistant) and Zhefu 802 (susceptible) , were used in this study. At 22leaf
stage , their second leaves were re2treated with PQ and Tiron. Activities of CAT and POD , relative contents of fatty
acid in membrane and MDA contents were determined after 3 , 24 , 48 and 72 hours respectively. At 32leaf stage ,
the third leaves were challenged with. Xanthomonas oryzae pv . oryzae 76225 (virulent) , and disease development
status was examined 15 days latter. The relation between disease resistance to XOO and peroxidation on membrane
lipid induced by paraquat and Tiron was studied. The results show that pre2treatment with PQ induces systematic
resistance to strain 76225 , and increases the activities of both CAT and POD , and MDA contents in the treated
leaves. The changes begin from 24 hours on and keep at a higher level from 48 to 72 hours after the treatment . On
the average , CAT activities increase by 1615 and 1113 percent , POD activities by 3712 and 2513 percent , MDA
contents by 3815 and 3212 percent in treated leaves of Yushuinu and Zhefu 802 respectively. The saturate fatty acid
increase by 1118 percent and IUFA decreases by 715 percent , in the leaves in Zhefu 802 treated with PQ. The
decrease of IUFA is due to the decrease of linolenic acid contents. Tiron shows a negative effect on the induced
resistance to XOO 76225 and on the changes of above tested items caused by PQ.
Key words :active oxygen species ; induced resistance ; membrane lipid composition ; Oryzae sativa L.
收稿日期 :2003211220
基金项目 :省科技厅重点攻关项目 (2002A2070402)和广东省教育厅自然科学基金项目 (Z03062)
作者简介 :曾富华 (1952 ～) ,男 ,湖南省浏阳市人 ,理学博士 ,教授 ,从事植物生理生化的研究。E2mail :zengfuhua @tom. com活性氧 (AOS)是一类反应活性很高的含氧衍生物 ,如超氧阴离子 (O2·2 ) 、单线态氧 (1O2 ) 、羟自由基
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(·OH)和过氧化氢 (H2O2 )等。在植物中 ,O2·2 和 H2O2 等 AOS 的产生是病源微生物和激发子处理后的共
同特征[1 ] ,AOS 介导了植物的免疫反应[2 ] 。细胞内外AOS 的快速增加可导致膜脂过氧化 ,甚至直接损伤
核 DNA 和失活蛋白质 ,造成细胞丧失生活能力[3 ] ,诱导抗氧化防卫基因、植保素合成基因和与系统获得
抗性 (SAR)的有关基因的表达以及诱导程序性细胞死亡[4 ] 。百草枯 (PQ)是一种特异性的 O2·2 产生剂 ,能
专一地截获叶绿体光系统 Ⅰ光合电子传递链中的电子 ,将之交给分子氧而产生 O2·2 。Stroble 等[5 ] 指出 ,
PQ 能保护黄瓜免遭病源物的侵袭。我们的研究表明 ,PQ 在导致O2·2 产生的同时 ,也使 SOD 活性增加 ,并
诱导了对稻白叶枯菌的系统抗性。而 O2·2 清除剂钛铁试剂 (Tiron) 则使上述效果减弱[6 ] 。本文进一步探
讨了 O2·2 产生剂和清除剂对过氧化氢酶 (CAT ,E. C. 11111116) 活性、过氧化物酶 (POD ,11111117) 活性、膜
脂酸各组分相对含量及丙二醛 (MDA)含量影响的动态变化 ,以进一步探讨两因子引起的诱导抗病作用
与膜脂过氧化作用之间的关系。
1 　材料与方法
111 　化学试剂
试验所用化学试剂均为进口分装或国产分析纯试剂。PQ 由英国捷利康有限公司农药部生产 ,为百
草枯二氯盐 ,相当于 20 %百草枯水溶液。
112 　水稻试验条件
经 2 年的苗圃鉴定 ,我们筛选出对白叶枯菌强毒株 76225 高抗品种余水糯和高感品种浙辐 802 ,种
子均由湖南省水稻所提供。种子用 4 %甲醛溶液消毒 15min ,漂洗干净后浸种催芽 ,精选露白种子 ,播种
在 19cm ×14cm 的尼龙网架上 ,在光照培养箱中 (光强 6000lx ,光照 10hΠ24h ,温度 28 ℃Π20 ℃,RH80 %) 用
木村 B 溶液培养。
113 　细菌培养
稻白叶枯菌 ( Xanthomonas oryzae pv. oryzae , XOO) 76225 (强毒株) ,购自湖南农业大学植病研究室。
细菌接种在固体胁本培养基上 ,28 ℃恒温培养 4d ,用无菌水稀释备用。
114 　诱导处理
当幼苗长至第 2 叶期时进行如下处理 : ①喷施 PQ 溶液 (110mgΠL ,含 0105 %Tween280) ; ②喷 Tiron 和
PQ 混合液 (Tiron 110 mmolΠL ,PQ 110 mgΠL ,含 0105 %Tween280) ; ③喷施含 0105 %Tween280 的无菌水作对
照。每处理均设 3 次重复。处理后 3、24、48、72h 取第 2 叶测 CAT活性、POD 活性和 MDA 含量 ,72h 测处
理叶膜脂酸各组分相对含量 ,并测定了对照第 3 叶中 O2·2 含量。
115 　挑战接种及诱导效果测定
于处理后第 5d ,当幼苗第 3 叶全展后 ,用 XOO 76225 于第 3 叶进行剪叶挑战接种 (1 ×108 细菌Πml) 。
15d 后测量各处理病斑长度 ,按文献[7 ]计算相对病斑长、绝对诱导效果和相对诱导效果。
116 　生理生化指标测定
POD 活性按 Braber 的方法[8 ]进行。
CAT活性按 Dhindsa 的方法[9 ]进行。取 10～30μL 粗酶液 ,加磷酸盐缓冲液 ( PBS ,50mmol ,pH710 ,含
011 % H2O2 ) 至 3ml ,于 25 ℃条件下测 A240 ,以每分钟减少 011 A240的酶量为一个酶活性单位。
MDA 含量测定按文献[7 ]进行。
膜脂酸的抽提及甲酯化按苏维埃等提供的方法[10 ] 进行。膜脂酸各组分相对含量采用 GL2GA 型气
相色谱仪测定。
O
2·
2 含量测定 :采用电子自旋共振波谱仪 (J ES2FEIXG,日本 J EOL 公司生产) 测定。水稻叶片洗净、吸
干 ,称 5～10mg 剪成 3cm 长切段 ,在液氮温度下检测。根据ΔE = hν= gβH(h :普朗克常数 ,β:波尔磁子 ,
ν:共振频率 ,H :共振磁场 , g : 样品共振磁场位置) ,求算 g 值来描述共振信号的性质 ,根据波谱的振幅描
述信号强度 ,以 011mm 峰高Πmg(FW)为 1 个 O2·2 单位。
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2 　结果与分析
211 　两个品种幼苗叶片中活性氧及其代谢的比较
2 个对 XOO 抗性不同的水稻品种 ,取第 2 叶或第 3 叶 ,分别测定有关指标。结果表明 (表 1) 抗性品
种余水糯幼苗叶片中 O2·2 含量和 MDA 含量分别比感病品种浙辐 802 高 918 %和 417 % ,而 CAT活性和
POD 活性则相反 ,浙辐 802 分别比余水糯高 3513 %和 415 %。推测抗病品种较高的 AOS 含量和脂质过
氧化水平可能有利于植物与病源物互作时 AOS 的升高和脂质过氧化的启动。
表 1 　2 个水稻品种幼苗抗病性和活性氧代谢的比较
Table 1 　The comparison of two cultivars on AOS metabolism and resistance to XOO
品 种
cultivars
CAT活性
CAT activities
(U·g - 1ΠFW) POD 活性POD activities(U·g - 1ΠFW) O2·2 含量O2·2 content(U·g - 1ΠFW) MDA 含量MDA content(mol·g - 1ΠFW) 病斑长度lesionlengthΠ(mm) 相对病斑长relative lesionlength ( %)
余水糯 Yushuinuo 24013 ±217 15614 ±611 7153 7101 ±0128 1193 ±0130 3150 ±0168
浙辐 802 ZheFu802 32512 ±1112 16314 ±215 6179 6188 ±0133 2819 ±5173 4012 ±611
212 　PQ 和 Tiron 的处理对挑战接种后发病情况的影响
图 1　PQ和 Tiron的诱导对诱导叶中 CAT 活性影响的动态变化
Fig. 1 　The dynamic changes of CAT activity in
leaves induced by PQ and Tiron
○、△、□分别代表余水糯 CK、PQ 和 PQ + Tiron ; ●、▲、■分别代
表浙辐 802 CK、PQ 和 PQ + Tiron. 下图同。
○、△、□present Yushuinuo CK, PQ and PQ + Tiron ,respectively ; ●、
▲、■present Zhefu 802 CK,PQ and PQ + Tiron ,respectively. The same as
following figures.
PQ 处理后 ,余水糯和浙辐 802 第 3 叶挑战接
种后病斑长度分别是对照的 5013 %和 4712 % ,相
对诱导效果分别为 4912 %和 5218 % ,说明 PQ 处理
的稻苗产生了系统抗性。Tiron 使 PQ 的诱导效果
减弱 ,病斑长度是对照的 11816 %和 7719 % ,相对诱
导效果为 - 1819 %和 2211 %[6 ] 。这表明 O2·2 在系统
诱导抗性中起重要作用。
213 　PQ 及 Tiron 的处理对处理叶中膜脂过氧化作
用的影响
PQ 处理后 ,2 品种幼苗处理叶中 CAT 活性、
POD活性和 MDA 含量在处理后 24h 即开始升高 ,
处理后 48h～72h 增至较高水平。在余水糯和浙辐
802 的处理叶中 ,平均 CAT 活性增加 1615 %和
1113 % ,最高达 2519 %和 2010 % ,平均 POD 活性升
高 3712 %和 2513 % ,最高达 4715 %和 3818 % ,平均
MDA 含量升高 3815 %和 3213 % ,最高达 11216 %
和 8113 %(图 123) 。PQ 处理后第 3 天 ,感病品种
浙辐 802 诱导叶中饱和脂肪酸相对含量增加 1118
% ,不饱和脂肪酸指数 ( IUFA)降低 715 %。IUFA 降低主要是由亚麻酸 (18∶3) 减少所致。18∶3 相对分子
数减少 715 % ,相对含量减少 1114 % ,而油酸 (18∶1)和亚油酸 (18∶2)却有所增加 (表 2) 。Tiron 使 PQ 对
诱导叶中上述各指标的影响减弱 ,对 CAT 活力的影响均减小 516 % (余水糯) 和 510 % (浙辐 802) ,对
POD 活力的影响平均减小 1611 %(余水糯)和 1018 % (浙辐 802) ,对MDA 含量的影响平均减小 3411 %
(余水糯) 和 2713 %(浙辐 802) ; 使 PQ 浙辐 802 处理叶中饱和脂肪酸相对含量减少 1212 % ,使 IUFA 增
加 215 %(表 2) 。
3 　讨论
PQ 是一种广谱性的除草剂 ,能特异将光系统 Ⅰ的电子转移到分子氧中而产生O2·2 ,是一种很好的O2·2
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产生剂。前文[6 ]报道了 PQ 导致处理叶中O2·2 产生速率增加的同时 ,也诱导了稻株对 XOO 的系统抗性和
SOD 活性增加。本文进一步研究了 PQ 和 Tiron 对诱导叶中膜脂过氧化作用的影响与对 XOO 系统抗性
的关系。发现 PQ 使诱导叶中 CAT活性、POD 活性、MDA 含量和膜脂中饱和脂肪酸相对含量增加 , IUFA
降低。表明膜结构受到了攻击 ,导致膜脂过氧化。PQ 首先使 O2·2 增加 ,继而诱导 SOD 活性增加[6 ] ,后者
促进 O2·2 的歧化 ,使细胞内 H2O2 增加。H2O2 又可与 Fe2 + ΠCu2 + 反应 ,产生攻击力更强的·OH[2 ] 。这样 ,
O
2·
2 、H2O2和·OH共同作用于膜系统 ,引发脂质过氧化 ,产生类似于非亲和性互作时的过敏性反应 ( HR) ,
进而通过内源激发子或 AOS 本身诱导防卫基因表达 ,使植株产生 SAR。
表 2 　PQ 和 Trion 的处理对浙辐 802 处理叶中膜脂酸相对分子数的影响
Table 2 　The effect induced by PQ and Trion on relative molecular numbers of fatty acid compositions in
membrane in the leaves of Zhefu 802
处 理
treatments
膜脂酸相对分子数
relative molecular numbers of fatty acid membrane ( %ΠFW)
16∶0 16∶1 18∶0 18∶1 18∶2 18∶3 Total
饱和脂肪酸相对分子数
relative molecular numbers of
saturate fatty acid ( %ΠFw) 不饱和脂肪酸指数IUFA 3
CK 19170 2110 1110 1110 10110 65190 100100 20180 (10010 %) 22111
PQ 21120 2110 2106 1191 12170 58140 98137 23126 (11118 %) 20416
PQ + Tiron 18150 2138 1193 3101 12150 59190 98122 20143 (9812 %) 21011
　　3 IUFA = [18∶1 ] + [18∶2 ] ×2 + [18∶3 ] ×3
图 2 　PQ 和 Tiron 的诱导对诱导叶中 POD
活性影响的动态变化
Fig. 2 　The dynamic changes of POD activity in
leaves induced by PQ and Tiron
图 3 　PQ 和 Tiron 的诱导对诱导叶中
MDA 含量影响的动态变化
Fig. 3 　The dynamic changes of MDA content in
leaves induced by PQ and Tiron
　　CAT和 POD 是细胞内 AOS 清除系统的重要成员。当叶片中 H2O2 增加时 ,H2O2 作为底物可直接激
活或者通过诱导基因表达的方式增加这两种酶活力。这与 Higa 等[12 ] 在研究 AOS 诱导水稻旗叶中的
POD 活性相一致。因此 ,CAT和 POD 及 SOD 活力的增加是细胞对 PQ 胁迫的一种保护性反应。Inturbe2
Ormaetxe 等[13 ]在研究豌豆植株受 PQ 氧化损害时发现 ,PQ 使 CAT 等保护性酶活性大幅度降低 ,上述结
果与此相矛盾 ,其原因尚不清楚。
膜脂酸各组分相对含量的变化可反映膜脂受氧化攻击的情况。水稻叶片膜脂酸中 ,不饱和脂肪酸
约占 79 % ,不饱和脂肪酸中又以 18∶3 为主 ,约占膜脂酸的 66 %。PQ 处理后 ,膜脂酸各组分的比例发生
了较大的变化 ,使饱和脂肪酸增加 , IUFA 降低。IUFA 降低主要是由 18∶3 减少引起的。因为 AOS 攻击
膜结构时 ,首先攻击不饱和脂肪酸。18∶3 含双键多 ,不饱和程度高 ,所占比例大 ,故首先受到攻击而使
其比例减小。膜结构中 18∶3 的减少 ,部分可被细胞液中新合成的脂肪酸所补充。因 18∶3 的合成需要
经过软脂酸 (16∶0) 、硬脂酸 (18∶0) 、油酸 (18∶1)和亚油酸 (18∶2)阶段 ,而 18∶1 和 18∶2 对 AOS 的敏感性不
如 18∶3 ,故而膜脂中 16∶0、18∶0、18∶1 和 18∶2 相对增加。
XOO 7521 (弱毒株)诱导的 AOS 代谢变化与 PQ 引起的 AOS 代谢变化不同。7521 使 O2·2 增加应来自
004 核　农　学　报 18 卷
两个方面 ,即产生增加和因 SOD 活性降低所致的歧化作用减少[6 ,7 ] 。7521 还诱导 CAT 活性降低[7 ] ,使
H2O2 分解减少。而 PQ 则主要是由 O2·2 产生增加 ,依次诱导 SOD 活性、CAT活性和 POD 活性增加。尽管
两者诱导 AOS 代谢变化不同 ,但最终都导致诱导叶中 AOS 增加 ,都诱导产生了 SAR。我们推测 ,凡能使
植物组织快速产生 AOS、导致膜脂过氧化和类似于 HR 的物质 ,均有可能充当激发子而诱导 SAR ,Tiron
使 7521[6 ]和 PQ 诱导的系统抗性减弱也证明了这一点。
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