全 文 ：　文章编号 :100028551 (2002) 0520305205
木霉诱变菌株发酵条件研究
陈建爱1 ,2 　肖　敏1 　王未名2 　陈为京2 　孙永堂2
(11 山东大学微生物技术国家重点实验室 ,山东 济南　250100 ; 2. 山东省农业科学院
原子能农业应用研究所 ,山东 济南　250100)
摘 　要 :本文以木霉诱变菌株 T5、T0803、T1010、T1003 为实验对象 ,利用正交实验优化
组合其生长的环境条件 ,方差分析表明各处理间差异显著 ,每个因素的设计差异都显
著。最佳组合是菌株 T1010 ,培养菌丝最适温度 30 ℃,pH值 6 ,高温培养 3d 转入低温
20 ℃培养 ,农药组合为代森锰。T1010 液体振荡培养 ,在正常的生长范围内氧气对生
长量的影响不大。
关键词 :木霉 ;发酵条件
收稿日期 :2000209204
作者简介 :陈建爱 (1968～) ,女 ,山东寿光人 ,山东农业科学院副研究员 ,从事辐照微生物防治病虫害研究
木霉是一种有益微生物 ,广泛存在于土壤及其他基质中 ,其生存能力强 ,适应性广 ,具有对
植物病原真菌的拮抗作用和强烈分解纤维素的能力 ,作为一种具有重要开发价值的自然资源 ,
引起人们极大的关注。对于木霉防治植物病害的研究有很多报道[1～7 ] ,近几年已经深入到分
子水平[8～10 ] ,并且已有商品化木霉问世[9 ,10 ] 。如何控制和调节各种环境因素 ,促进木霉生长 ,
发挥其有益作用是大量生产和田间应用的关键环节。本文通过室内实验分析木霉生长与环境
条件的关系。
1 　材料和方法
111 　材料
菌株 T5、T0803、T1010、T1003 系通过60 Coγ射线诱变所得[11 ] 。
112 　方法
11211 　木霉培养 　(1)固体培养 :PDA 培养基 ,011MPa 蒸汽灭菌 20min ,按正交表 L16 (45 ) 进行
实验组合[12 ] ,不同条件下平板培养 ; (2) 液体培养 : PD 液体培养基 ,011MPa 蒸汽灭菌 20min ,共
设 5 种处理 ,包括不同体积 4 种 :25、50、75 和 100ml 液体培养基 ,分别用 250ml 三角瓶盛装 ,每
处理 18 瓶 ,转速 180rΠmin ;另一处理 ,250ml 三角瓶盛 50ml 培养基 ,共 18 瓶 ,转速 90rΠmin。将培
养好的木霉菌株 T1010 液体以 6 %的比例移入三角瓶 ,25 ℃下摇床培养。
1. 2. 2 　数据记录 　(1)固体培养 :生长过程中测定菌落直径等 ,最后统一测定每皿的孢子量 ;
(2)液体培养 :将培养不同时间的木霉烘干 ,并测量干重。
503　核 农 学 报　2002 ,16 (5) :305～309Acta Agriculturae Nucleatae Sinica
11213 　统计分析 　依据数理统计正交实验法对固体培养的木霉孢子量进行统计分析 ,比较其
差异性[2 ] 。
2 　结果与分析
211 　木霉生长环境的主次因素
微生物生长受温度、湿度、光照、pH值、氧气等诸多因素的影响。本实验选用不同菌株、温
度、pH值、培养菌丝时间、农药 (各 4 种)进行正交组合 (表 1) 。在培养过程中 ,不同组合的木霉
生长菌落及产孢时间有差异 ,有的菌落整齐 ,生长快 ,孢子均匀 ;有的菌落生长慢 ,边缘不整齐 ,
孢子不均匀 (图版 Ⅰ) 。培养 11d 后对木霉孢子量进行统计 ,利用极差法表明相应因素作用的
大小。极差大 ,说明该因素活泼 ;极差小 ,说明该因素保守。表 1 显示菌株 (A) 是影响孢子量
形成的最大因素 ,其次是培养菌丝温度 (B) 、pH 值 (C) 、农药 ( E) 的影响 ,从培养菌丝不同温度
转入低温培养孢子所需的时间 (D)影响较小。方差分析表明 (表 2) ,每个处理间及各个因素间
差异显著 ,菌株 (A)之间差异最显著 ,是主要因素 ,其次是培养菌丝的温度 (B) 、pH 值 (C) 、转入
低温前的培养时间 (D)及农药 ( E) 。F 检验进一步说明了各个处理之间及各因素之间的差异。
表 1 　5 因素 4 水平正交表 L16 ( 45 )
Tabel 1 　The analysis of 5 factors and 4 levels
因素处理号
treated factor No.
A 菌株
hyphae
B 培养温度
temparature
C
pH
D 培养菌丝时间
time (d)
E农药
funicide 40ppm
孢子量 (亿Π皿)
spore (billionΠdish)
1 1 1 1 1 1 23. 4
2 1 2 2 2 2 26. 0
3 1 3 3 3 3 17. 2
4 1 4 4 4 4 22. 6
5 2 1 2 3 4 29. 8
6 2 2 1 4 3 24. 6
7 2 3 4 1 2 23. 2
8 2 4 3 2 1 31. 8
9 3 1 3 4 2 28. 2
10 3 2 4 3 1 58. 2
11 3 3 1 2 4 42. 6
12 3 4 2 1 3 67. 2
13 4 1 4 2 3 8. 6
14 4 2 3 1 4 35. 6
15 4 3 2 4 1 37. 6
16 4 4 1 3 2 31. 2
T1 356. 8 360. 0 486. 2 597. 6 604. 0
T2 436. 6 576. 6 642. 4 436. 0 434. 4
T3 784. 8 482. 4 451. 2 545. 6 469. 4
T4 452. 0 611. 2 450. 4 451. 0 522. 4
极差 R 107. 0 62. 8 48. 0 40. 4 42. 4
　　注 :A :1 T5 ,2 T0803 ,3 T1010 ,4 T1003 ;B :1 15 ,2 20 ,3 25 ,4 30 ;C :1 5 ,2 6 ,3 7 ,4 8 ;D :1 3 ,2 4 ,3 5 ,4 6 ; E:1 CK;2 灰霉克 ;3 新
万生 ;4 克露 ;灰霉克 (速克灵 + 百菌清) ,新万生 (代森锰) ,克露 (霜霉克)
Note :1 CK;2 Huimeike ; 3 Mancozeb ; 4 Curzate ; Huimeike (procymidone + chlorothaloni) ,Mancozeb(maneb) ,Curzate (phosehyl2Al) .
603 核　农　学　报 16 卷
表 2 　方差分析表
Tabel 2 　Variance analysis
变异来源
variation
自由度 f
freedom
平方和 SS
sum of squares
均方 MS
mean square
F0
区组 region 3 1. 73 　 0. 58 　 1. 24 　
处理 treatment 15 12807. 06 853. 80 40. 85 3 3
A 3 6732. 05 2244. 02 4831. 75 3 3
B 3 2369. 17 789. 89 1700. 77 3 3
C 3 1567. 61 522. 54 1125. 11 3 3
D 3 1117. 13 372. 35 801. 79 3 3
E 3 1020. 59 340. 19 732. 50 3 3
误差 error 45 20. 90 0. 46
总变异 total variation 63 12829. 69
　　注 :α(5 %) :2181 ;α(1 %) :4124
图版 Ⅰ　正交组合木霉生长菌落
Plate Ⅰ　The growth of Trichoderma
212 　木霉生长环境的优化条件
将正交组合数据利用新复极差法统计分析 (表 3) ,结果表明组合 A3B4 C2D1 E3 最好 ,即
T1010 菌株在 pH6、高温 30 ℃培养 3d 后转入低温 20 ℃培养 ,农药组合为代森锰 ,大多数组合之
间差异显著 ,组合 A2B4 C3D2 E1 和 A4B4 C1D3 E2 之间 ,A1B4 C4D4 E4 和 A2B3 C4D1 E2 之间差异较显
著 (大于 R0105 (2 ,40) = 0148) ,A1B1 C1D1 E1 和 A2B3 C4D1 E2 差异不显著。每个因素之间通过新复极
差法比较分析 ,菌株之间差异显著 ,A3 即 T1010 最好 ,其次是 A4 、A2 、A1 ;培养温度 (B)之间差异
显著 ,其中 30 ℃最好 ;因素 C中 ,除 pH = 7 和 pH = 8 时差异不显著外 ,其余均差异显著 ;培养菌
丝的不同时间 (D)对产孢的影响差异显著 ;不同杀菌剂型的农药 ,有的不影响木霉生长 ,有的
阻碍木霉生长 ,差异显著。
703　5 期 木霉诱变菌株发酵条件研究
表 3 　最小显著极差表
Tabel 3 　Duncan’s table
处理号
treatment No.
组合
combination
Xi. Xi. - x13 Xi. - x3 Xi. - x4 Xi. - x7 Xi. - x1 Xi. - x6 Xi. - x2
12 A3B4C2D1E3 6712 5816 33 5010 33 4416 33 4410 33 4318 33 4216 33 4112 33
10 A3B2C4D3E1 58. 2 49. 6 33 41. 0 33 35. 6 33 35. 0 33 34. 8 33 33. 6 33 32. 2 33
11 A3B3C1D2E4 42. 6 34. 0 33 25. 4 33 20. 0 33 19. 4 33 19. 2 33 18. 0 33 16. 6 33
15 A4B3C2D4E1 37. 6 28. 8 33 20. 4 33 15. 0 33 14. 4 33 14. 2 33 13. 0 33 11. 6 33
14 A4B2C3D1E4 35. 6 26. 8 33 18. 4 33 13. 0 33 12. 4 33 12. 2 33 11. 0 33 9. 6 33
8 A2B4C3D2E1 31. 8 23. 2 33 14. 2 33 9. 2 33 8. 6 33 8. 4 33 7. 2 33 5. 8 33
16 A4B4C1D3E2 31. 2 22. 6 33 14. 0 33 8. 6 33 8. 0 33 7. 8 33 6. 6 33 5. 2 33
5 A2B1C2D3E4 29. 8 21. 2 33 12. 6 33 7. 2 33 6. 6 33 6. 4 33 5. 2 33 3. 8 33
9 A3B1C3D4E2 28. 2 19. 6 33 11. 0 33 5. 6 33 5. 0 33 4. 8 33 3. 6 33 2. 2 33
2 A1B2C2D2E2 26. 0 17. 4 33 8. 8 33 3. 4 33 2. 8 33 2. 6 33 1. 4 33
6 A2V2C1D4E3 24. 6 16. 0 33 7. 4 33 2. 0 33 1. 4 33 1. 2 33
1 A1B1C1D1E1 23. 4 14. 8 33 6. 2 33 0. 8 33 0. 2
7 A2B3C4D1E2 23. 2 14. 6 33 6. 0 33 0. 6 3
4 A1B3C4D3E4 22. 6 14. 0 33 5. 4 33
3 A1B3C3D3E3 17. 2 8. 6 33
13 A4B1C4D2E3 8. 6
处理号
treatment No.
组合
combination
Xi. - x9 Xi. - x5 Xi. - x16 Xi. - x8 Xi. - x14 Xi. - x15 Xi. - x11 Xi. - x10
12 A3B4C2D1E3 3910 33 3714 33 3610 33 3514 33 3116 33 2916 33 2416 33 910 33
10 A3B2C4D3E1 30. 0 33 28. 4 33 27. 0 33 26. 4 33 22. 6 33 20. 6 33 15. 6 33
11 A3B3C1D2E4 14. 4 33 12. 8 33 11. 4 33 10. 8 33 7. 0 33 5. 0 33
15 A4B3C2D4E1 9. 4 33 7. 8 33 6. 4 33 5. 8 33 2. 0 33
14 A4B2C3D1E4 7. 4 33 5. 8 33 4. 4 33 3. 8 33
8 A2B4C3D2E1 3. 6 33 2. 0 33 0. 6 33
16 A4B4C1D3E2 3. 0 33 1. 4 33
5 A2B1C2D3E4 1. 6 33
　　注 :P = 2 ,R0105(2 ,40) = 0148 ,R0101(2 ,40) = 0165 ,P = 16 ,R0105(2 ,40) = 0159 ,R0101(2 ,40) = 0177
图 1 　不同容量不同转速木霉的生长量
Fig. 1 　The growth of Trichoderma
in diver rotional speed
A21 :25ml ;A22 :50ml ;A23 :75ml ;A24 :A:100ml ,180rΠmin ;
B :50ml ,90rΠmin213 　氧气条件分析木霉是需氧型真菌 ,通过对木霉 T1010 液体培养 ,测定其生长与通气量的关系。摇床培养不同时间 ,分别测量菌丝干重 ,进行生长量分析。等同浓度的菌丝量在不同的液体体积内培养 ,即加入氧气量不同 ,其差异不显著 ;在不同的转速下 ,其生长量干重也区别不大 ,说明在正常的自然氧气压力下 ,即自然生长条件范围内 ,氧气的多少对木霉的生长影响不大。3 　讨　论微生物的生长受温度、湿度、光照、pH值、
氧气等物理化学因素影响。木霉生存能力强 ,
803 核　农　学　报 16 卷
适应性广 ,其生长条件同大多数真菌一样 ,多数发酵工艺研究强调真菌生长条件的范围。本实验探
讨了木霉生长的最佳条件组合 ,生长菌丝的最佳温度为 30 ℃,pH值为 6。温度高 ,木霉生长快 ,减少
杂菌的污染机会 ,3d 后转入低温培养 ,利于孢子的产生 ,增加孢子产量 ;同时 ,温度低阻止一些高温
生长杂菌的污染。部分农药不影响木霉生长 ,进一步说明木霉广泛的适应性。木霉对氧气的需求
不是很严格 ,木霉液体培养的最佳通气量还需进一步探讨。
参考文献 :
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STUDY ON GROWTH CONDITION OF Trichoderma MUTANTS
CHEN Jian2ai1 ,2 　XIAO Min1 　WANG Wei2ming2 　CHEN Wei2jing2 　SUN Yong2tang2
(11State Key Laboratory of Microbial Technology ,Shandong University ,Jinan ,Shandong prov. 　250100 ;
2. Institute for Application of Atomic Energy ,Shandong Academy of Agricultural Sicneces ,Jinan ,Shandong prov. 　250100)
ABSTRACT :Some Trichoderma mutants were cultured under different conditions. 4 strains ,T5 ,T0803 ,
T1010 ,T1003 were selected with different mediums and every medium was mixed with fungicide of
40ppm. The fungicides were procymidone + chlorothalonil ,maneb and phosethyl2A1. The pH of medium
were 5 ,6 ,7 and 8 ,respectively. The growing temperatures were 15 ,20 ,25 and 30 ℃,respectively. After
the hyphae growing for some days under natural high temperature ,they were put in low temperature
for producing spores. The growing times for these hyphae were 3 ,4 ,5 and 6 days ,respectively. All dates
were anlyzed on statistics with the orthogonal array and ranges( R) were different with different factor
and levels( R = 4014 ,4214 ,4810 ,6218 ,10710) . The results showed that the strain was the most influent
condition( R= 10710)and the changed temperature time from high to low was the least influent condi2
tion( R= 4014) . Each factor variance was significant and A3 b4 C2D1 E3 was the optimum combined condi2
tion ,under which T1010 grew more quickly and produced the most spores.
Key words :Trichoderma ; growing condition
903Acta Agriculturae Nucleatae Sinica
2002 ,16(5) :305～309