全 文 ：文章编号 :100028551 (2006) 042349204
不同金属辅基和酶剂量对超氧化物歧化
酶抗氧化、促氧化作用的影响
许镇坚　田　兵　华跃进
(浙江大学原子核农业科学研究所 ,浙江 杭州　310029)
摘 　要 :研究含不同类型金属辅基 (Mn 或 Cu , Zn) 的超氧化物歧化酶 (SOD) 的抗氧化Π促氧化作用特征 ,
以及酶剂量对其抗氧化Π促氧化作用的影响。用化学发光法分析超氧化物歧化酶对由 Fenton 体系产生
的羟基自由基 (·OH)导致 DNA 氧化损伤的影响。进一步利用·OH 所致质粒 DNA 氧化后在琼脂糖凝胶
电泳中的构型改变为实验模型 ,比较不同类型金属辅基和剂量对 SOD 抗氧化Π促氧化活性的影响。Mn2
SOD 对·OH引起的 DNA 氧化损伤没有显著影响。然而 ,Cu , Zn2SOD 在较高浓度 ( > 200 UΠml) 下 ,表现
出强烈的促氧化效应 ,能够加剧 DNA 氧化损伤。研究结果表明 ,金属辅基对 SOD 的抗氧化或促氧化效
应有着重要的影响 ,这可能与金属辅基在 Fenton 反应中的氧化还原特性相关。高浓度的 Cu , Zn2SOD 对
·OH所致 DNA 氧化损伤存在显著的促氧化效应。高浓度的 Mn 辅基离子不能与 Fenton 体系中 H2O2 直
接作用 ,并且不能促进羟基自由基的形成。
关键词 :超氧化物歧化酶 ;金属辅基 ;抗氧化作用 ;促氧化作用
EFFECTS OF DIFFERENT METAL PROSTHETIC GROUPS AND CONCENTRATION ON
ANTIOXIDANT AND PROOXIDANT ACTIVITIES OF SUPEROXIDE DISMUTASE
XU Zhen2jian 　TIAN Bing 　HUA Yue2jin
( Institute of Nuclear2Agricultural Sciences , Zhejiang University , Hangzhou , Zhejiang 　310029)
Abstract :A study was carried out to make an understanding of theantioxidant or prooxidant effect of Mn2SODand Cu , Zn2
SOD ,and to analyze the effects of SOD at various concentrations on DNA oxidative damage. Effects of SOD on hydroxyl radical
induced DNA oxidative damage were measured by using chemiluminescence method. With agarose gel electrophoresis ,
antioxidant or prooxidant effect of different types of SOD (Cu , Zn2SOD and Mn2SOD) was studied by analyzing the ratio of SC
(supercoiled) form of pBR3221 Results show that Mn2SOD has no effects on hydroxyl radical2induced DNA. CAT shows
protective effect on DNA with concentration dependence. On the other hand , Cu , Zn2SOD at high concentrations ( > 200 UΠ
ml) exhibits a significant prooxidant effect on DNA ,and enhances DNA damage. Prosthetic group has important effects on
antioxidant or prooxidant activity of SOD. This maybe due to redox character of different metal ions in Fenton reaction. Cu ,
Zn2SOD at higher concentration has remarkable prooxidant effect on DNA. Mn ions of Mn2SOD at higher concentration would
not react with H2O2 in Fenton system and have no effects on DNA damage.
Key words :superoxide dismutase ;prosthetic group ;antioxidant effect ;prooxidant effect
收稿日期 :2005209229
基金项目 :国家重点基础研究发展规划项目 (2004CB19604) 、国家杰出青年基金项目 (30425038)和国家自然科学基金项目 (30500008)资助
作者简介 :许镇坚 (19802) ,男 ,浙江乐清人 ,博士研究生 ,主要从事 DNA 辐射损伤修复相关研究。华跃进为通讯作者 ,Email : yjhua @zju. edu. cn　　超氧化物歧化酶 ( Superoxide dismutase , SOD , EC11151111)是生物体抗氧化体系中一种重要的金属酶 , 它作为生物体内清除超氧阴离子自由基 (O·-2 ) 的重要酶类 ,和过氧化氢酶 ( Catalase , CAT) 及过氧化物酶
943　核 农 学 报　2006 ,20 (4) :349～352Journal of Nuclear Agricultural Sciences
(Peroxidase ,POD) 一起构成了生物体内重要的酶促反
应防御体系 ,担负着清除活性氧自由基和保护生物体
的重要功能[1 ] 。然而 ,研究发现 ,SOD 在某些条件下可
对机体产生负面效应 ,例如 ,过量表达 Cu , Zn2SOD 的
实验鼠的神经组织产生过氧化损伤[2 ] 。另外 ,研究发
现过 量 表 达 Cu , Zn2SOD 的 唐 氏 综 合 症 ( Down
syndrome)病人的癌症发病率也比较高[3 ] 。羟基自由基
(·OH)是已知的危害性最大的活性氧[4 ] ,大量研究结
果证实 ,·OH 对蛋白质、核酸等生物大分子的损伤与
癌症、心血管疾病、帕金森氏症、炎症等重大疾病的发
生和发展密切相关 ,SOD 在上述疾病的防治中也得到
了广泛的应用[5～7 ] ,但对于 SOD 在临床应用中可能存
在的毒副作用 ,尤其是含不同金属辅基 SOD 和过量使
用的危害及其机理尚缺乏研究报道。本文旨在通过考
察Mn 和 Cu , Zn2SOD 及其不同剂量对羟基自由基引起
的 DNA 氧化损伤 ,研究金属辅基和作用剂量 (浓度) 对
SOD 的抗氧化或促氧化效应的影响。
1 　材料与方法
111 　主要仪器和试剂
Mn2SOD(比活性 4500 UΠmg protein ,来源于大肠杆
菌)和 Cu , Zn2SOD(比活性 3000 UΠmg protein ,来源于牛
血清) ,均为 Sigma 公司产品 ;CAT(比活性 12 000 UΠmg
protein) ,购自中国科学院上海生物化学与细胞生物学
研究所 ;质粒 pBR322 , Takara 公司产品 ;低熔点琼脂
糖 ,美国 Promega 公司产品 ;其余试剂均为国产分析
纯。
BPCL 型超微弱化学发光测量仪 ,购自中国科学院
生物物理所 ;琼脂糖凝胶电泳仪 (Mini Primo EC 320) ,
E2C公司产品 ;凝胶成像系统 (Model 3000) 和 Quantity
One 图像分析系统为美国 Bio2rad 公司产品。
112 　方法
11211 　样品的准备 :样品 SOD 和 CAT 粉末用 pH 714
PBS 溶解 ,并稀释成一定浓度 ,分装不同浓度的若干个
反应管。SOD 和 CAT按 1∶1 (V∶V)配备的样品溶液。
11212 　羟基自由基所致 DNA 氧化损伤的化学发光法
分析[8 , 9 ] :羟基自由基·OH 由 Fenton 反应体系 Cu2 + 2
Vc2H2O2 产生 ,·OH 攻击 DNA ,形成产物与化学发光剂
邻菲罗林 (Phen)产生化学发光现象 ,形成发光峰 ,发光
峰值与 DNA 损伤程度成正比。反应体系由 2 ×10 - 3
molΠL 的 Phen , 2 ×10 - 3 molΠL 的 Vc , 2 ×10 - 4 molΠL
CuSO4 , 011 molΠL 醋酸盐缓冲液 (pH 515)和 50μgΠml 小
牛胸腺DNA 组成 ,在样品池中加入样品 100μl (空白对
照加双蒸水) ,先测定本底发光强度 10 s 后 ,加入 3 %
H2O2 100μl , 启动反应 ,反应总体积为 1ml ,反应温度
40 ℃。间隔 5s 记录发光值 (单位为发光数 Counts) ,并
记录发光强度 (Luminosity , 发光峰积分面积) 和出峰时
间 ,每个样品重复测量 3 次。
11213 　羟基自由基 (·OH) 所致质粒 DNA 断裂损伤的
琼脂糖凝胶电泳分析[10 ] :取一系列 Eppendorf 管 (200
μl) ,作为对照和样品的反应管 ,依次加入质粒 pBR322
(015 gΠL) 110μl、磷酸盐缓冲液 (PBS ,pH 714 ,50mmolΠL)
210μl、不同浓度的样品溶液 210μl (对照用相同体积的
PBS代替样品溶液) 、CuSO4 溶液 (25μmolΠL) 310μl、VC
(214mmolΠL) 110μl、最后加入 H2O2 (110 %) 310μl ,混匀 ,
置 37 ℃水浴温育 30 min。将上述保温反应液与 115μl
上样缓冲液 (0105 %溴酚蓝 ,110 %十二烷基磺酸纳 ,
50 %甘油)混合 ,每管取 1010μl 上样 ,琼脂糖凝胶浓度
为 018 % ,恒压 80V ,电泳 1 h 后取出凝胶 ,置 015mgΠL
溴化乙锭 ( EB)溶液中染色 20min ,再用水洗去染色液 ,
转移到凝胶成像系统中拍照成像 ,凝胶中电泳条带的
荧光强度用 Quantity One 图像分析软件 (Bio2rad 公司)
进行扫描分析 ,并以样品的超螺旋构型 ( Supercoiled ,
SC)含量与对照的 SC含量 (定义为 100 %) 的比值表示
DNA 氧化断裂程度 ( %) 。
113 　数据处理
所有试验数据测定均重复 3 次 ,数据以平均值表
示。数据分析用 Origin 610 软件 (Microcal Software ,
Inc. , USA)处理。
2 　结果与分析
211 　不同辅基的 SOD 对·OH所致 DNA 氧化作用的影
响
利用化学发光法分析 Mn2SOD 和 Cu , Zn2SOD 在
自由基氧化 DNA 体系中的作用 ,结果见表 1。体系中
的·OH攻击并造成 DNA 损伤 ,与化学发光剂产生化学
发光现象 ,发光强度与损伤 DNA 的量成正比。当体系
中加入 Mn2SOD 时 ,发光峰强度和出峰时间均没有显
著变化 ,表明含锰的 SOD 对 DNA 氧化损伤没有影响。
但是 ,当体系中加入 Cu , Zn2SOD 时 ,发光峰强度
随酶浓度的增加而逐渐增加 ,并且出峰时间逐渐前移 ,
在 Cu , Zn2SOD 浓度为 90UΠml 条件下 ,DNA 发光峰出
现在 545s 处 ,比对照提前了 45s ,同时发光强度也有提
高。当 SOD 浓度达到 3000UΠml ,DNA 发光峰出现在
90s 处 ,提前了 500s ,发光强度也增加了 56 %。这表
明 ,Cu , Zn2SOD 能够促进体系中 DNA 的氧化损伤 ,而
053 核　农　学　报 20 卷
Mn2SOD 体系中 DNA 的氧化损伤没有影响 ,这可能是
辅基的作用机制不同引起的差异。
表 1 　Mn2SOD 和 Cu , Zn2SOD 对自由基所致
DNA 损伤作用的影响
浓度
(UΠml) Mn2SOD Cu , Zn2SOD发光强度 出峰时间 (s) 发光强度 出峰时间 (s)
0 (CK) 4325910 ±29970 635 1414240 ±10900 590
90 4334150 ±10926 615 1433330 ±22408 545
180 4369660 ±19824 605 1454920 ±33012 440
750 4357460 ±25805 598 1789200 ±35357a 245
1500 4374790 ±16522 640 2025350 ±56034a 165
3000 4382680 ±20764 615 2212370 ±15223a 90
注 :a. 在相同条件下 ,与对照 (SOD 浓度 = 0 UΠml)比较 ,发光强度具有显
著性差异 ( P < 0105) 。
212 　不同辅基和剂量的 SOD 对·OH所致质粒 DNA 断
裂损伤作用的影响
质粒 pBR322 为闭合环状双链 DNA ,呈超螺旋构
型 (Supercoiled ,SC) ,在受·OH 攻击后发生损伤而致链
断裂 ,可转变为开环 (Open circular ,OC) 或线性 (Linear)
形式。3 种不同构型的质粒 DNA ,在凝胶电泳中表现
不同的迁移率 ,SC 最快 ,OC 最慢 ,而线性分子介于两
者之间 (有时不出现) 。SC 和 OC 比例的变化可反映
DNA 受损程度 ,SC所占的比例大 ,说明损伤轻 ;反之则
表明损伤加剧。
图 1 为质粒 DNA 受·OH损伤及不同浓度 Mn2SOD
对 DNA 氧化损伤产生的影响。试验结果表明 , Mn2
SOD 既没有保护 DNA 免受羟基自由基氧化的作用 ,
也没有高浓度下对 DNA 的促氧化作用。图 2 为不同
浓度 Cu , Zn2SOD 对 DNA 氧化损伤的影响 ,图中 DNA
条带的强度变化表明 ,与 DNA 损伤对照管 (Lane 2) 比
较 ,较高浓度 ( ≥250 UΠml)的 Cu , Zn2SOD 加剧了 DNA
氧化损伤 ,表现出较强的促氧化作用 ;浓度为 500 UΠml
时 ,促氧化作用最为明显 ,与对照比较 ,实验组的 SC减
少了 4712 % ,表明 DNA 氧化损伤增加了。与之相反 ,
在浓度低于 125 UΠml 时 ,质粒的 SC 构型比例增加 ,说
明损伤程度减轻 ,即表明低浓度的 SOD 对DNA 损伤有
一定的抑制作用 ,可能是蛋白质本身对自由基的淬灭
作用。
213 　CAT浓度对 DNA 氧化损伤的影响及与 SOD
的协同作用
过氧化氢酶 (CAT)也是生物体内清除活性氧自由
基的一种重要抗氧化酶 ,它催化 H2O2 的降解反应。图
3 的结果是不同浓度的 CAT对 DNA 氧化损伤的影响 ,
在试验的各个浓度下 ,CAT对 DNA 的氧化损伤均表现
出防护作用 ,并没有出现类似 Cu , Zn2SOD 的促氧化作
图 1 　Mn2SOD 浓度对·OH所致质粒
DNA 断裂损伤作用的影响
1 为空白对照 ;2 为 DNA 损伤对照 ;3211 为 Mn2SOD 存在下的
CuSO4 和 H2O2 处理 ,SOD 浓度从左到右依次为 :500 ,250 ,125 ,
6215 ,31125 ,15163 ,7181 ,3191 ,1196 UΠml。下图同。
图 2 　Cu , Zn2SOD 浓度对·OH所致质粒 DNA
断裂损伤作用的影响
用。在高浓度条件 (500 UΠml 和 250 UΠml ) 下 ,它对
DNA 损伤的抑制作用最明显 ,与对照比较 ,实验组的
SC分别增加了 101 %和 89 % (见图 4) ,表明 DNA 氧化
损伤显著减少了。CAT的这种防护作用与之前的研究
报道是一致的[12 ] 。SOD 和 CAT 是机体中两种关键的
抗氧化酶 ,SOD 歧化反应的产物过氧化氢是 CAT 的催
化反应底物 ,因此我们分析了不同浓度的 Cu , Zn2SOD
和 CAT 混合物对 DNA 氧化损伤的影响 ,以确定 Cu ,
Zn2SOD 和 CAT两者之间是否存在一定的协同作用关
系。图 4 表明。即使在 CAT 存在的条件下 ,高浓度
( > 250 UΠml )的 Cu , Zn2SOD 仍然表现出对 DNA 的促
氧化作用 ,与对照比较 ,实验组的 SC 减少了大约
20 %。随着浓度的降低 ,促氧化效应逐渐减弱 ,但是
SOD 与 CAT协同防护作用并不显著。
153　4 期 不同金属辅基和酶剂量对超氧化物歧化酶抗氧化、促氧化作用的影响
图 3 　CAT浓度对·OH所致质粒 DNA 断裂损伤作用的影响
3 　讨论
SOD 作为药用酶 ,它对机体的防护和抗衰老、抗肿
瘤、抗炎症及抗自身免疫性疾病等均有积极的意义 ,在
临床实践上有着广泛的应用[1 ] 。过量使用 SOD 模拟
物 ———二十员大环双核铜和线性二氧四胺铜可能在生
物体内产生毒副作用[10 ] 。因此 ,对 SOD 毒副作用机理
的研究是应当引起重视的问题。
图 4 　CAT 和 SOD对·OH所致质粒DNA断裂损伤作用的影响
与对照比较 ,测定样品中超螺旋构型 DNA 所占的比例来
表示不同金属辅基 SOD 的抗Π促氧化效应
研究结果表明 ,DNA 在·OH 攻击下产生损伤时 ,
加入高浓度的 Cu , Zn2SOD 并没有使 DNA 损伤减轻 ,
相反 ,Cu , Zn2SOD 加剧了 DNA 的损伤程度 ,表现出强
烈的促氧化效应。但是 ,Mn2SOD 却对 DNA 损伤没有
显著性的影响。Cu , Zn2SOD 促进 DNA 氧化损伤的可
能机理是高浓度 Cu , Zn2SOD 的加入 ,SOD 的金属辅基
　　　　
Cu( Ⅱ) 直接增加了 Fenton 反应体系中二价铜离子
(Cu2 + ) 的浓度 ,而 Cu2 + 在还原剂 Vc 存在条件下被还
原为 Cu + ,过量 Cu + 与过氧化氢反应导致·OH 的大
量产生 ,它是加剧 DNA 损伤的根本原因。但是 ,Mn 离
子却不能够参与 Fenton 反应和增加羟基自由基 ,因此 ,
Mn2SOD 对自由基所致 DNA 氧化损伤没有显著影响 ,
这也说明 SOD 的促氧化作用主要是由于其辅基金属
离子催化 Fenton 反应形成的羟基自由基引起的。对于
Cu , Zn2SOD 的促氧化效应的研究将有益于对 SOD 制
品应用安全性的分析和控制。关于 SOD 及其类似物
所具有的促氧化效应的体内作用机制还有待于更进一
步的研究。
参考文献 :
[ 1 ] 　Fridovich I. Superoxide dismutase . Ann Rev Biochem ,1975 ,44 : 147～
159
[ 2 ] 　Takuji Igarashi , Ting2Ting Huangand Linda J . Noble. Regional
Vulnerabilityafter Traumatic Brain Injury : Gender Differences in Mice
That Overexpress Human Copper , Zinc Superoxide Dismutase.
Experimental Neurology , 2001 , 172 (2) : 332～341
[ 3 ] 　Hasle H , Clemmensen IH , Mikkelsen M. Risks of leukaemiaand solid
tumours in individuals with Down’s syndrome. Lancet , 2000 , 355
(9199) : 165～169
[ 4 ] 　Fridovich I. Thebiology of oxygen radicals. Science , 1978 , 201 : 875～
880
[ 5 ] 　王关林 ,田　兵 ,方宏筠 ,等. 芦荟抗氧化物质活性及对红细胞的
保护作用. 营养学报 ,2002 ,24 (4) : 380～384
[ 6 ] 　Rice2Evance C Aand Diplock A T. Current status ofantioxidant therapy .
Free Radicaland Medicine , 1993 , 15 : 77～96
[ 7 ] 　方允中 ,李文杰. 自由基与酶———基础理论及其在生物学和医学
中的应用. 北京 : 科学出版社 ,1989 , 156～204
[ 8 ] 　郑荣梁. 自由基生命科学进展 ,第 5 集. 北京 : 原子能出版社 ,
19971 67
[ 9 ] 　Wenjian Ma , En2Hua Cao , Jian Zhang , Jing2FenQin. Phenanthroline2
Cu complex2mediated chemiluminescence of DNAand its potential use
inantioxidation evaluation. Journal of Photochemistryand Photobiology ,
1998 , 44 : 63～68
[10 ] 　田亚平 ,吕　星 ,方允中 ,等. 两种 SOD 模拟物对氧自由基所致质
粒 pBR322 DNA 损伤的防护作用. 军事医学科学院院刊 ,1994 ,18
(4) : 271～275
[11 ] 　Daly M J , Gaidamakova E K, Matrosova Y, Vasilenko A , Zhai M ,
Venkateswaran A , etal . Accumulation of Mn ( Ⅱ) in Deinococcus
radiodurans Facilitates Gamma2Radiation Resistance. Science , 2004 ,
306 (5) : 1025～1028
[12 ] 　隋建丽 ,吕　星 ,周平坤 ,等. H2O2 - Fe3 + 所致人淋巴细胞 DNA
双链断裂损伤. 生物化学与生物物理进展 ,1996 ,23 (1) :59～62
253 Journal of Nuclear Agricultural Sciences
2006 ,20 (4) :349～352