全 文 ：文章编号 :100028551 (2008) 042410205
EMS 诱导小麦品种烟农 15 突变体
的鉴定和 EST2SSR 分析
许云峰　蒋方山　郭　营　李瑞军　李斯深
(山东农业大学农学院 ,作物生物学国家重点实验室 ,山东 泰安　271018)
摘 　要 :用 EMS 对小麦品种烟农 15 进行诱变处理 ,以构建突变体库、创造小麦新种质 ,为小麦功能基因
研究和小麦遗传改良提供基础材料。经过M2 代筛选和M3 代鉴定 ,得到 11 个农艺性状发生明显变异的
突变系 ,其中籽粒大小和株高 2 个性状的变异幅度最大。11 个突变系均有复合性状突变出现 ,将其分
为 3 类突变表型 :8 个大粒、高秆突变系 ;2 个半矮秆突变系 ;1 个高秆、多蘖突变系。用 715 个 EST2SSR
引物对受体烟农 15 和 4 个 M3 突变系进行了分析 ,共有 14 个引物对在受体和突变系间能扩增出差异条
带。其中 12 个引物对扩增结果的差异表现为条带的有无 ;2 个引物对表现为扩增出长度不同的差异条
带。
关键词 :小麦 ;诱变 ; EMS ;突变体 ; EST2SSR
IDENTIFICATION AND EST2SSR ANALYSIS OF MUTANTS FROM
WHEAT VARIETY“YANNONG 15”INDUCED BY EMS
XU Yun2feng 　J IANG Fang2shan 　GUO Ying 　LI Rui2jun 　LI Si2shen
( College of Agronomy , Shandong Agricultural University , State Key Laboratory of Crop Biology , Tai’an , Shandong 271018)
Abstract :The wheat variety“Yannong 15”were treated by EMS (ethyl methane sulfonate) for the construction of the mutant
genebank and the creation of new germplasm , which provided the foundational materials for the study of wheat functional gene
and wheat genetic improvement . After the selection from M2 generation and the identification of M3 generation , eleven mutant
lines with the most significant variation on the traits of grain size and plant height , were obtained. All of the mutant lines are
composited trait mutants , and according to variation character , they could be divided into three types : 8 mutant lines with
large grain size and long2culm , 2 mutant lines with semidwarf , 1 mutant line with long2culm and multi2tiller. A total of 715
EST2SSR primer pairs were used to analyze“Yannong15”and 4 M3 mutant lines. Polymorphic fragments were detected from 14
primer pairs , of which 12 showed polymorphism that with or without amplified fragment and 2 with different fragment length.
Key words :wheat ; mutagenesis ; EMS ; mutant ; EST2SSR
收稿日期 :2007211207 　接受日期 :2008201204
基金项目 :国家科技支撑计划项目 (项目编号 :2006BAD13B02)
作者简介 :许云峰 (19842) ,男 ,山东费县人 ,硕士研究生 ,研究方向为植物生物技术及其在育种上的应用。
通讯作者 :李斯深 (19632) ,男 ,山东即墨人 ,博士 ,教授 ,主要从事小麦遗传育种研究。E2mail : ssli @sdau. edu. cn　　构建突变体库 ,是进行功能基因研究的基础[1 ] ,也是创造新种质、培育新品种的途径[2 ] 。构建突变体库的方法有物理诱变、化学诱变、体细胞变异、插入突变和基因沉默等。目前 ,采用插入突变和基因沉默技术构建突变体库较多 ,如 T2DNA 技术[3 ] 、AcΠDs 标签系统克隆[4 ,5 ]和 RNAi 技术[6～8 ] 等。由于上述技术均依赖于 农杆菌介导转化或内源标签系统 ,且转基因过程耗时较长和组织培养较复杂 ,目前较难作为常规方法应用于小麦研究中。化学诱变具有操作简便、突变率高、能在短时间内获得大量突变体等优点[9 ] 。甲基磺酸乙酯(ethyl methane sulfonate , EMS) 是一种稳定高效的化学诱变剂 ,其诱变作用效率高、频率高、范围广 ,诱变后产
014　 核 农 学 报　2008 ,22 (4) :410～414Journal of Nuclear Agricultural Sciences
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生的突变多为显性性状 ,易于突变体的筛选[10 ] 。EMS
主要诱发点突变 ,可以用来精确鉴定基因功能 ,已经应
用在水稻[9 , 11 , 12 ] 、油菜[2 ]等作物突变体库的构建。
简单重复序列 ( simple sequence repeat ,SSR) ,也称
微卫星 DNA(microsatellite DNA) ,是指 DNA 分子中 1～
5 个核苷酸的串联重复[13 ,14 ] 。SSR 具有在动植物基因
组随机分布、高信息量和多态性、共显性和孟德尔遗传
等优点[15 ] ,能够应用于功能基因标记、遗传图谱的构
建、遗传多样性分析、亲缘关系鉴定、DNA 指纹图谱构
建等方面。表达序列标签 (expression sequence tag ,EST)
是表达基因的部分序列。根据 EST 序列可设计 SSR
引物 ( EST2SSR) ,目前在小麦中设计了许多 EST2SSR 引
物 ,并已用于遗传图谱的构建、重要基因的标记等方面
的研究[16～20 ] 。
本研究用 EMS 对小麦品种烟农 15 进行诱变处
理 ,从中筛选和鉴定突变体 ,为小麦功能基因研究提供
基础材料 ,并用 EST2SSR 标记对烟农 15 及其部分突变
体进行初步分析。
1 　材料与方法
111 　材料
小麦 ( Triticum aestivum L. ) 品种烟农 15 号 ,由山东
省烟台市农业科学院育成 ,1982 年通过山东省认定。自
认定以来 ,该品种全国累计种植面积 650 万 hm2 以上 ,
每年在山东省还有大约 10 万 hm2 的种植面积。
112 　方法
11211 　诱变处理 　用 EMS 处理烟农 15 种子。先将种
子置于 011molΠL 的磷酸缓冲液中 ,摇床上震荡处理 8h
后 ,将取出种子转入 EMS2磷酸缓冲液中 ( EMS 浓度为
013 % ,磷酸缓冲液浓度为 011molΠL) ,在通风橱中摇床震
荡处理 4h ,然后倒出 EMS2磷酸缓冲液 ,用自来水冲洗 4h
以除去残留 EMS ,最后用 50mgΠL 链霉素冲洗种子。
11212 　突变体的筛选与鉴定 　2004 年 10 月将诱变处
理后的种子种植于山东农业大学试验基地。当代
(M1 )材料混播 ,成熟后按单株收获 M2 代自交种子。
M2 代于 2005 年 10 月播种成株行 ,生育期间进行田间
农艺性状的观察 ,成熟后按单株收获。M3 代种子于
2006 年 10 月播种成株行 ,共种植了 271 个株系。生育
期间进一步进行田间农艺性状的观察和鉴定 ,在 11 个
变异显著的突变系中分别随机选取 5 株进行性状调
查 ,调查的性状包括 :植株高度、株穗数、穗长、穗粒数、
籽粒长度、籽粒宽度、千粒重等。
113 　测定
11311 　EST2SSR 标记分析 　基因组 DNA 的提取按
Sharp 等人[21 ]提出的 SDS 法 ,略做调整。EST2SSR 引物
为本实验室设计并合成[20 ] ,共 715 个引物对。
11312 　PCR 反应 　反应在Biometra TGradient PCR 扩增
仪上进行。20μl 反应体系中含正、反向引物 (10μmolΠ
L)各 110μl ,210μl 10 ×Buffer ,112μl Mg2 + (25mmolΠL) ,
012μl Taq 酶 ( 5UΠμl ) , 016μl dNTP ( 215mmolΠL ) , 210μl
DNA(30ngΠμl) ,其余用 ddH2O 补足。PCR 扩增程序为 :
94 ℃预变性 7min ;94 ℃变性 30s ,50 ℃～65 ℃退火 45s ,
72 ℃延伸 60s ,34 个循环 ;72 ℃后延伸 7min ;最后 10 ℃
终止反应。
11313 　变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 　将 5μl PCR 产物
上样于 6 %聚丙烯酰胺凝胶 ,在 2000V、80W 的条件下
电泳 1h 左右 ;电泳缓冲液为下槽液 1Π2 ×TBE ,上槽液
1Π3 ×TBE。电泳结束后用 AgNO3 染色。
11314 　统计分析 　采用 DPS 数据处理系统进行数据
分析。
2 　结果与分析
211 　突变体的农艺性状表现
在 M2 全生育期进行初步筛选的基础上 ,将突变
单株种植成 M3 株系 ,进行变异性状的鉴定。对 11 个
M3 突变系的调查结果如表 1 所示。由表 1 可见 ,11 个
株系的株高都明显改变 ,其中 2 个株系比受体烟农 15
号显著变矮 ,9 个株系显著变高 ;仅 1 个株系的单株穗
数显著增加 ;5 个株系的主穗长显著增加 ,而 1 个株系
显著降低 ;4 个株系的穗粒数显著增加 ;11 个株系的粒
长都显著增长 ,7 个株系的粒宽和 8 个株系的千粒重
显著增加 ,其中千粒重增加最大的达 1413g ,比烟农 15
增加了 4417 % ,变异幅度较大。另外 ,由于单株穗数
受环境影响较大 ,烟农 15 和各个突变系株穗数的变异
系数都较大。
这些变异性状的出现存在一定的相关性。11 个
突变系均表现出不止 1 个性状发生显著改变 (表 1) 。
其中 ,突变系 808122、808123、808221 和 808225 在株高、
主穗长、粒长、粒宽、粒重等性状上都比受体烟农 15 有
显著增加。
根据主要突变性状的表现 ,把 11 个突变系分为 3
类 :
(1) 大粒、高秆突变体 :包括 800821、804525、80452
　　　　
114　4 期 EMS诱导小麦品种烟农 15 突变体的鉴定和 EST2SSR 分析
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表 1 　烟农 15 及其部分突变系的农艺性状
Table 1 　Agronomic traits of Yannong 15 and its mutant lines
材料
variety or line
株高
plant height
单株穗数
spike per plant
主穗长
spike length
穗粒数
grain number
per spike
粒长
grain length
粒宽
grain width
千粒重
10002grain
weight
平均值
mean
(cm)
变异系数
CV
( %)
平均值
mean
变异系数
CV
( %)
平均值
mean
(cm)
变异系数
CV
( %)
平均值
mean
变异系数
CV
( %)
平均值
mean
(cm)
变异系数
CV
( %)
平均值
mean
(cm)
变异系数
CV
( %)
平均值
mean
(g)
变异系数
CV
( %)
烟农 15
Yannong15 7315 1152 1015 30149 7188 9160 4412 2148 01576 2115 01300 3151 3210 7191
798321 6710a 5168 916 28114 8104 5117 5310a 2198 01633A 1133 01303 0153 3516 6118
7995 6810a 4188 1316 40114 8164 3189 4414 2101 01645A 1199 01285 1140 2914 3127
800821 9213A 1141 1218 23177 8128 4171 5110a 3192 01658A 1172 01357A 2181 4613A 9146
803022 8014A 5132 1918A 31162 7150 10102 4214 3158 01632A 1145 01286 2197 2918 3113
804525 8614A 4167 1210 36132 8190A 8110 4112 3160 01597a 4185 01314 6107 3712a 9185
804528 9014A 3119 1210 43170 7120a 8139 4516 6169 01610A 2169 01326A 4149 4113A 4117
806221 8915A 5133 1215 8194 7180 4144 5716A 2163 01662A 1185 01317a 2105 3812a 6198
808122 9418A 7147 1114 48168 9134A 9117 5218a 7185 01691A 2128 01337A 7170 4516A 11152
808123 9612A 4150 1310 23171 9126A 5190 4510 3151 01681A 1123 01331A 3157 4014A 8112
808221 9116A 3150 918 20191 9152A 5100 4512 3196 01691A 2148 01322A 2136 4016A 7142
808225 8414A 4178 814 38121 10122A 7110 3818 4161 01675A 2167 01320a 5174 3918A 11107
注 :a 表示该材料与烟农 15 相比达 5 %显著水平 ,A 表示达 1 %极显著水平。
Note : a and A indicate difference significant at 0105 and 0101 levels , respectively.
8、806221、808122、808123、808221、808225 等 8 个突变系 ,
其特点是株高、粒长、千粒重以及粒宽 (除 804525) 都有
显著增长 ,表现为大粒、高秆 (表 1) 。特别是籽粒性
状 ,各株系无论是籽粒大小还是千粒重都有非常明显
的变 化。808122 和 808221 的 粒 长 最 长 , 均 达 到
01691cm ,比烟农 15 增加了 2010 %。800821 的籽粒宽
度和千粒重增加最大 ,为 01357cm 和 4613g ,分别比烟
农 15 增加 1910 %和 4417 %。808123 的株高在各株系
中最高 ,为 9612 cm ,比烟农 15 增加 3019 %。
该类突变体的其他性状也有变异。804528 的主穗
长变短 ,800821 和 806221 的主穗长无明显变化 ,其他各
株系的主穗长均显著增加 ,其中 808225 的最长 ,且小
穗排列最疏松 ; 806221 的穗粒数不但比烟农 15 高了
3013 % ,还远高于其他各株系 ;800821 和 808122 的穗粒
数显著增加。此外 ,多数大粒突变系都伴随着不同程
度的角质率的变化 ,比如 804528、808123 和 808221 等突
变系几乎全部为角质 ,角质率比烟农 15 有明显提高。
803021 和 808225 出现顶芒。
(2) 半矮秆突变体 :798321、7995 突变系株高明显
降低 ,表现为半矮秆 ;粒长显著增长 ,但粒宽没有显著
变化 ;798321 的穗粒数增长明显。
(3)高秆、多蘖突变体 :突变系 803022 的单株穗数
达到 1918 ,比受体烟农 15 高了 8816 % ;籽粒表现为长
粒。
212 　EST2SSR 标记分析
用本实验室设计的 715 对 EST2SSR 引物对受体烟
农 15 和 4 个最具代表性的突变系进行分析 ,在烟农 15
中共扩增出 765 条清晰的条带。有 14 个引物对在各
突变系与烟农 15 间扩增出差异条带。差异条带数最
多的为 8008 ,共 13 条 ,占总条带数的 1170 % ;最少的是
8045 ,仅有 4 条 ,占总条带数的 0152 %(表 2、表 3) 。根
据差异条带的分布情况可以发现 ,大多数引物扩增的
结果为差异条带的有无。其中 ,8 个引物对 (表 2 ,1～8
号)扩增的条带在受体烟农 15 中没有出现 ,而在部分
突变体中出现 ;4 个引物对 (表 2 ,9～12 号) 在烟农 15
中出现条带 , 而在部分突变体中没有出现 ; 引物
SWES579 和 SWES921 在受体和突变体间扩增出长度
不同的差异条带 (表 2 ,13～14 号 ;图 1) 。
3 　讨论
近年来 ,利用 EMS 诱导已在水稻中获得大量突变
体。如陈忠明等[11 ] 和叶俊等[9 ] 分别利用 EMS 诱导在
水稻“93211”中获得了形态性状突变体。这些突变体
的获得为水稻功能基因组学研究提供了基础材料。许
耀奎等[22 ] 用 EMS 处理春小麦品种新曙光 1 号和 772
1017 ,获得了高秆、矮秆、特矮秆、密穗以及不育突变
体。本研究利用 EMS 处理小麦品种烟农 15 ,得到了一
些具有不同性状的突变体 ,而且出现了一些优良农艺
性状突变 ,如大粒、大穗、半矮秆等。这些在同一遗传
背景下获得的突变体 ,不仅为小麦功能基因的研究提
供了基础材料 ,还可以作为新的优良种质资源供小麦
214 核　农　学　报 22 卷
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　　　　 表 2 　突变体的 EST2SSR 分析结果
Table 2 　Results of EST2SSR analysis for mutants
序号
No.
引物名称
names of
primers
左端引物 (5′23′)
forward primer
右端引物 (5′23′)
reverse primer
扩增片段长度
fragment length
(bp)
扩增结果
results of amplification
烟农 15
Yannong 15 8008 8030 8045 8082
1 SWES251 TCTCCAGCCCCGACGACGCA AGCCCCGCACCATCCCGAAC 380 0 1 1 1 1
2 SWES340 GGAGAAGCCGAGGGTGAA GAAATGGAATGGTTGCGTAG 192 0 0 1 0 0
3 SWES342 GGTGCTTCGCCACTGTCA CGGGAGGTTGCTGCTGTT 105 0 1 1 0 0
4 SWES440 CTCCAAACCCTTGCCTCT ACTTCAGCCCGATTCCAC 320 0 1 0 0 1
5 SWES590 TTCTATCGTCCTTCGTCTTC GTACCTACATACATACGGCTTT 100 0 0 0 1 0
6 SWES604 TCTCCTTGTTGGCTATGTT AGACGACGACGCTTACTC 135 0 0 0 0 1
7 SWES626 GGCGACAGCGACTACATC AATCCACAACAGCCCACC 250 0 1 1 0 1
8 SWES911 GCAGTAAGCCGTATAGCAGC ACCACCAAATCAAAGGGA 140 0 1 1 0 1
9 SWES384 TTCTCGGGCTCAAGGAAA CACCAGCAAACCACAAACAC 260 1 0 1 1 1
10 SWES500 TGGACCTGACTGGACTGA TTGTTGCCGAACTTGTCT 155 1 0 0 1 1
11 SWES547 AAACCAGCGGCAGCACTA TTCCCGTCCAGCATCAGC 240 1 0 0 0 0
12 SWES578 CAGAAGGCAACAACAAAGTG CAGGCTGTGGACGGAGAT 150 1 0 1 1 1
13 SWES579 GCCTACACGCTGTTCCAC GTTCCTGCCCTTCCTCTT 190 1 0 0 1 1
195 0 1 1 0 0
14 SWES921 AGTCGGGCAATTCGATGC AAGATGTCCAAGCGGGTGA 147 0 1 0 1 0
140 1 0 0 1 1
注 :扩增结果中 ,1 表示有扩增条带 ,0 表示无扩增条带。
Note : In results of amplification , 1 and 0 indicate amplifying with or without polymorphic fragment or not , respectively.
表 3 　突变系与烟农 15 差异条带数比较
Table 3 　Differences of Yannong 15
and the mutant lines
突变系
mutant lines
总条带数 3
No. of total
fragments
差异带数
No. of
polymorphic
fragments
条带比率
rate of the
fragments( %)
8008 765 13 1170
8030 765 10 1131
8045 765 4 0152
8082 765 6 0178
注 : 3 ,烟农 15 的总条带数。
Note : 3 ,the number of the total fragments amplified from Yannong 15.
图 1 　EST2SSR 引物 SWES579 的扩增结果
Fig. 1 　Amplification results of the EST2SSR
primer pair SWES579
M:marker (pBR322 DNAΠMsp Ⅰ) ;1 :烟农 15 ;2～5 :
分别为突变体 8008、8030、8045、8082。
M: marker (pBR322 DNAΠMsp Ⅰ) ; 1 : Yannong 15 ; 2～5 : mutants ,
of 8008 , 8030 , 8045 , 8082 , respectively.
育种利用。在突变群体中还发现了复合性状突变体 ,
其突变机理有待进一步分析。从突变的表型性状来
看 ,在 M2 株系中 ,突变性状以单株形式出现 ,未见整
个株系变异性状一致的情况。而少数 M3 株系变异性
状表现一致 ,在这些 M3 株系中 ,同一株系内株间的变
异性状一致 ,株系之间突变性状表现出明显的差异。
说明这些变异不是由环境因素造成的 ,而是 EMS 诱变
的结果。
EST2SSR 是近年发展起来的新型分子标记 ,它反
映了基因的编码部分 ,可以直接获得基因表达的信息 ,
为功能基因提供“绝对”的标记 ,这有可能对决定重要
表型性状的等位基因进行直接鉴定[16～18 ] 。本研究用
EST2SSR 标记在烟农 15 及其突变体间扩增出差异条
带 ,这些差异条带可分为两类 :一类是片段有无的差
异 ,另一类是片段长度的差异。根据 EMS 的作用机
理[10 ]可知 ,前一种情况有可能是 EMS 诱发的点突变造
成碱基转换或颠换的结果。而后一种情况可能是 EMS
诱变的另外一种机理 :与核苷结构的磷酸反应 ,形成磷
酸酯而发生糖2磷酸骨架断裂 ,从而引起缺失、插入等
突变 ,导致 DNA 链长度的变化 ,最终表现为差异条带
长度的不同。EST2SSR 分析结果表明 ,烟农 15 及其突
变体之间存在功能基因的差异 ,而且这些差异不仅仅
是由点突变引起的 ,还有可能是 DNA 链断裂所引起的
部分序列缺失或插入的结果。这些差异条带的获得 ,
314　4 期 EMS诱导小麦品种烟农 15 突变体的鉴定和 EST2SSR 分析
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为有关基因的精细定位和基因分离提供了基础。
在我们构建的小麦分子标记连锁图谱中[20 ] ,引物
对 SWES579 (195bp ) 被定位于 1B 染色体上 ,与小麦
SSR 标记 Xwmc419 b、Xwmc128、Xgwm264 a 的遗传距离
分别为 1619、2215 和 3818cM。Xgwm264 a 与抗小麦条
锈病基因 YrH52 的遗传距离为 210cM[23 ] , Xwmc419 与
硬粒小麦2粗山羊草人工合成小麦 CI108 的抗条锈病
基因 YrC108 的遗传距离为 118cM[24 ] ,但没有发现与这
些标记紧密连锁并且与本文所涉及的突变性状存在一
致性的基因或 QTL 位点。
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