全 文 ：文章编号 :100028551 (2007) 012013204
花粉管通道法导入标记 DNA 在棉花胚珠内的分布
杨书华1 　倪万潮1 　葛才林2 　朱　静2 　王泽港2 　罗时石2
(11 江苏省农业科学院农业生物遗传生理研究所 ,江苏 南京　210014 ;21 扬州大学农学院 ,江苏 扬州　225009)
摘 　要 :通过花粉管通道法将[α232 P]dATP 标记的 DNA 导入科棉 1 号 ,测量标记 DNA 在胚珠内的放射性
活度并进行放射性自显影观察 ,以求获得陆地棉导入外源 DNA 的最佳时期和外源 DNA 在胚珠内的分
布情况。结果表明 ,导入的外源 DNA 能进入到胚珠中 ;棉花授粉 33h 时通过滴涂和注射法导入标记
DNA 在胚珠内的放射性活度测量值均较高 ;而滴涂法的放射性活度明显低于注射法 ;胚珠内银粒的分
布较明显 ,标记外源 DNA 的胚珠内银粒远多于对照。
关键词 :陆地棉 ;花粉管通道 ;活度测量 ;放射性自显影法
DISTRIBUTION OF EXOGENOUS DNA IN UPLAND COTTON BY POLLEN TUBE PATHWAY
YANG Shu2hua1 　NI Wan2chao2 　GE Cai2lin1 　ZHU Jing1 　WANG Ze2gang1 　LUO Shi2shi1
(11 Institute of Agrobiological Genetics and Physiology , Jiangsu Academy of Agricultural Sciences , Nanjing , Jiangsu 　210014 ;
21 College of Agriculture , Yangzhou University , Yangzhou ,Jiangsu 　225009)
Abstract :The distribution of exogenous DNA in upland cotton by pollen tube pathway was studied. The results showed that the
exogenous DNA could be transported into ovules by dripping and injection. The optimum time for treatment is at 33h after
pollination. The radioactivity in ovules by dripping exogenous DNA was lower than that by injecting. In autoradiogram , the
number of sliver grains in the treated ovules was more than that in the controls.
Key words :upland cotton ; pollen tube pathway ; radioactive measure ; radioautography
收稿日期 :2006203208
基金项目 :农业部发展棉花生产专项基金 (005032910102)
作者简介 :杨书华 (19802 ) ,男 ,江苏盱眙人 ,硕士研究生 ,现工作于江苏省农业广播电视学校 , Tel :051427979365 ; E2mail : gecailin10 @1631com ,
niwanchao2002 @yahoo. com. cn
　　棉花是我国重要的经济作物 ,关于棉花通过花粉
管通道法导入外源 DNA 的研究、育种以及创造新的种
质资源等已有多篇报道[1 ,2 ] ,但有关陆地棉花粉管通道
法导入外源 DNA 的最适宜时间以及在胚珠内的分布
情况未见报道。就目前研究现状来看 ,花粉管通道法
介导的棉花遗传转化在提高转化成功率上有很大空
间。本研究采用放射性活度测量和微观放射自显影技
术相结合 ,通过32 P 标记 DNA 研究导入棉花后在胚珠
内的吸收与分布 ,研究不同时期、不同导入法对导入效
果的影响。以期阐明陆地棉通过花粉管通道法导入外
源 DNA 的最佳时间 ,为花粉管通道法导入外源基因提
供参考。
1 　材料与方法
111 　材料
本试验所选择的棉花品种为陆地棉品种科棉 1 号
和海岛棉品种比马 S27 (扬州大学农学院陈德华教授提
供) ,其中受体为科棉 1 号 ,供体为比马 S27。种植于扬
州大学农学院实验田。选择株型较好、生长健壮及花
期一致的植株作为供试株 , 2004 年 5 月 10 日移栽到
大田 ,田间水肥管理按常规方法进行。
112 　试剂与仪器
本试验用试剂与仪器主要有 : [α232 P ] dATP (比活
性 > 3000CiΠmmol , 10μCiΠμl ) 、核24 乳胶、　机引物、
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HEPES、二硫苏糖醇 (DTT) 、未标记的 dNTP、藏红、显影
液 (D219b) 、定影液 ( Kodak F25) 、恒温水浴锅、冷冻离心
机、LS29800 型液体闪烁计数仪、Olympus 研究照相显微
镜等。
113 　试验方法
11311 　供体 DNA 的提取与纯化 　称取棉花鲜叶样品
10g ,参照孙志栋等[3 ] 的 SDS 法提取 DNA。将提取的
DNA分别用 70 %和 100 %的乙醇洗沉淀 1 次 ,风干后
加 100μl TE于 - 20 ℃保存备用。
11312 　随机引物标记法标记供体 DNA 　将提取比马
S27 品种的棉花 DNA 作为标记供体 ,用随机引物法将
带有放射性的 [α232 P ] dATP 标记到供体上。参照温贤
芳[4 ]的方法 ,将标记 DNA 保存在 - 20 ℃下保存备用。
11313 　人工去雄与授粉 　人工去雄与授粉参照王落
霞[5 ]的方法进行 ,在盛花期的 8 :00 或 17 :00 前后 ,当
母本花冠呈黄绿色或花瓣已经张开但雄蕊还未散粉时
去雄 ,把花冠连同雄蕊剥下 (按情况需要套上麦管) ,并
挂上标识牌。当日或次日 8 :00 左右 ,待花药开裂后 ,
开始授粉 ,将花粉涂抹在已去雄的雌蕊柱头上。授粉
后立即计时。
11314 　花粉管通道导入时间和方法 　分别在授粉后
18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、48h 后剪去柱头 ,用
微量注射器在棉花子房顶部正中部滴涂和注射 5μl 标
记的外源 DNA 溶液。注射导入操作按倪万潮[6 ] 的方
法进行 ,使用 5μl 医用微量进样器作为转基因微注射
的工具 ,每次使用前和使用后 ,用淡洗涤剂清洗 ,再用
蒸馏水漂清。注射时 ,摘除或剥去花瓣 ,抹平花柱。在
剥除花瓣时 ,注意不能损伤子房的表皮层 ,以免增加脱
落率。右手持微量注射器 ,左手轻扶摘除花瓣后的幼
子房 ,从抹平花柱处沿子房的纵轴方向进针至子房长
度的约 2Π3 处 (约 7mm 左右) ,并后退至约 1Π3 处。轻
轻操作微量注射器 ,将供体 DNA 溶液推入受精子房之
中。滴涂法先将授粉后一定时间的柱头切除 ,在切除
处花粉管孔上滴加供体 DNA 溶液。其他操作同注射
法。每个子房都在授粉 72h 后取样 ,每处理 3 个重复。
11315 　放射性活度测量 　将每个时间段的样品分别
切开子房 ,挑出子房内的所有胚珠 ,放进塑料闪烁瓶
内 ,在LS29800 型液体闪烁计数仪上用契伦科夫计数
法测定其放射性活度值 (cpm) ,分析导入外源 DNA 的
吸收情况。
11316 　放射性自显影 　将用 FAA 固定液[7 ] 固定 24h
以上的每个时间段样品采用石蜡法制片 ,切片厚度
10um ,用 1 %藏红酒精溶液染色 ,将脱腊的切片再进行
水化。然后进行放射性自显影 ,参照王福钧[8 ] 的方法
先配制成核24 乳胶工作液 ,然后用玻璃棒沾取少量工
作液 ,滴于载玻片的一端 ,再用玻璃棒均匀涂布乳胶于
切片表面 ,置于片架上 ,在室温下晾干后置于暗盒内 ,
盒外用黑纸包妥 ,置于塑料袋内 ,放入少量干燥剂封口
防潮 ,移至 4 ℃冰箱内曝光 ,其中滴涂标记液的曝光
30d ,注射标记液的曝光 15d。将经过曝光的切片在显
影液中显影 5min ,转入定影液中定影 10min ,再用蒸馏
水洗 20min。晾干后用光学树脂胶粘上盖玻片。用
Olympus 研究显微镜观察组织切片细胞内的感光银粒
分布情况 ,记录观察结果并照相。
2 　结果与分析
211 　标记 DNA 的放射性活度
将标记 DNA 加 500μl 的注射液稀释 ,取其中 5μl
加 5ml 的水 , 测定其放射性活度 , 测得结果为
73424cpm。不同方法和不同时间段导入外源标记 DNA
后 ,棉花胚珠内的放射性活度值进行衰变校正 ,并列于
表 1。
表 1 　导入外源标记 DNA 后棉花子房内胚珠的放射性活度
Table 1 　Radioactivity in ovule of upland cotton after introduction of labeled DNA (cpm)
导入 DNA 时间 inducing time (h) CK 18 21 24 27 30 33 36 39 42 45 48
方法 method 滴涂 drip 112 956 1395 2307 2623 1512 4631 1216 1633 407 266 486
注射 injection 148 7556 1061 6897 6452 10791 12264 10309 6779 13077 12163 8075
　　表 1 结果表明 ,导入外源 DNA 的胚珠内放射性活
度显著高于对照 ,表明导入的 DNA 已进入胚珠中。在
相同时间内滴涂法导入的放射性活度明显低于注射
法 ,说明注射法导入外源 DNA 的效率高于滴涂法。同
时也观察到 ,滴涂法的放射性活度值有 3 个峰值 ,分别
在 27、33、39h ,出现这种现象的原因 ,可能是由于花粉
管通道接受外源 DNA 是个相对长的时间 ,在 27、39h
处出现峰值说明此时花粉管通道接受外源 DNA 是一
段适宜期。而 33h 处的峰值显著高于其他两个 ,说明
此时是最佳时期。注射法的活度值在 33 和 42h 处有 2
个峰值 ,说明用注射法胚珠在授粉后 42h 接受外源
DNA。根据胚珠发育状况 ,授粉后 42h 胚已分裂或即
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将分裂 ,外源 DNA 的导入效果不及 33h。两种方法比
较 ,并考虑实验中可能存在的误差 ,舍去授粉后 42h 这
个放射性活度最高值。由此我们认为 ,授粉后 33h 是
两种方法经花粉管通道导入外源 DNA 的最佳时期。
212 　放射性自显影结果
对照图片是未导入外源 DNA ,也未进行放射自显
影的曝光处理 ,没有银粒出现 (图 121) 。未导入外源
DNA ,但进行放射自显影的曝光 ,图片上出现了少许分
散的银颗粒 (图 122) ,显示了由于天然本底的存在 ,导
致部分银颗粒在未导入放射标记的胚珠中出现。
图 1 中的 3、4、5 是分别在授粉后 18、33 和 48h 采
用滴涂方法导入外源 DNA 的放射自显影图片。结果
显示 ,银颗粒的分布明显比对照广且多 ,在胚珠的珠
柄、珠孔、胚囊以及胚珠的合点端都有分布。其中在珠
柄和珠孔处明显较多 ,在胚囊内也有一些分布。说明
有部分外源标记 DNA 可能参与了胚囊的生理生化或
遗传活动。
图 6、7、8 是通过注射法分别在授粉后 24、33、48h
导入外源标记 DNA 的放射自显影图片。从图中 ,可以
看出注射与滴涂的结果相似 ,但较之滴涂 ,注射的银粒
数更多 ,在胚囊内分布更广一些。
图 1 　放射性自显影照片
Fig. 1 　Autoradiagrams of the ovule dripped exogenous DNA
11 对照棉花胚珠切片 ;21 未导入外源 DNA ,涂布核乳胶的放射性自显影 ;31 32 P 标记 DNA 在授粉后 18h 滴涂子房的放射性自显影 ;41 32P 标记
DNA 在授粉后 33h 滴涂子房的放射性自显影 ;51 32 P 标记 DNA 在授粉后 48h 滴涂子房的放射性自显影 ;61 32 P 标记 DNA 在授粉后
24h 注入子房的放射性自显影 ;71 32P 标记在授粉后 33h 注入子房的放射性自显影 ;81 32 P 标记 DNA 在授粉后 48h 注入子房的放射性自显影
11The control slice of the ovule on upland cotton ; 21Autoradiagram of the ovule without introduced exogenous DNA ; 3 ,4 and 5 : Autoradiagram
of the ovules dripped exogenous DNA after 18h , 33h and 33h of pollination , respectively ; 6 ,7 and 8 : Autoradiagram of the ovules
injected exogenous DNA after 24h , 33h and 48h of pollination , respectively
3 　讨论
在分子生物学技术中 ,放射性测量主要有两种方
法 ,一是放射性活度测量法 ,另一种是放射性自显影 ,
本试验同时采用两种方法。探索导入32 P 标记的供体
DNA 后胚珠的吸收情况。显然 ,放射性活度越高 ,导
入外源 DNA 被吸收就多 ,导入成功率也就大。放射性
活度测定结果从一个侧面指导了外源 DNA 导入的最
佳时期。放射性自显影法能够明确反映供体 DNA 在
胚珠内分布情况 ,掌握供体 DNA 是否进入胚囊内以及
进入的量。本试验放射性自显影的重要特点是具有很
强的定性、定位能力 ,适于论证用放射性核素标记的
DNA 在胚珠内分布状态。自显影银粒分布 ,定性地说
明外源性 DNA 已进入胚珠和胚囊内 ,并显示在其中的
分布情况。
根据放射性活度测量 ,无论使用注射法还是滴涂
法导入 ,最终在棉花胚珠中测量到的放射性活度都明
显低于相同的导入液 ,说明外源 DNA 有相当一部分流
失 ,只有一部分被胚珠所吸收。由于注射法的放射性
51　1 期 花粉管通道法导入标记 DNA 在棉花胚珠内的分布
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活度值明显高于滴涂法 ,说明在导入效率上注射法优
于滴涂法 ,我们认为 ,其主要原因是注射导入克服了
DNA到达胚珠的渗透阻力 ,特别是中轴胎座对外源
DNA 渗透到胚珠的阻碍。
在放射性自显影观察中 ,胚珠的绝大部分都有银
颗粒分布 ,其中在珠孔端和胚珠合点端有较多的银粒 ,
表明珠孔是外源 DNA 渗透到珠孔处并进入胚囊的唯
一通道 ,大量标记物汇积于此处 ,所以此处自显影银颗
粒较多。此结果与龚蓁蓁等[9 ]观察到的结果一致。另
外发现合点端也有银粒 ,经分析 ,认为合点是胚珠的营
养输送中心 ,DNA 在此集中 ,显示了外源 DNA 可能一
部分被当作营养物质参与生物合成代谢。针对外源
DNA 导入子房后在胚珠的珠孔处和合点端出现较多
的问题 ,以上两种解释只是一部分 ,更多更深的原因还
有待于进一步研究。
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