全 文 ：文章编号 :100028551 (2008) 062856204
抗对硫磷基因工程抗体 ScFv 的制备
及其初步鉴定
宋丽敏1 　张　维2 　林　敏2 　潘家荣1
(11 中国农业科学院农产品加工研究所 ,北京　100094 ; 21 中国农业科学院生物技术研究所 ,北京　100081)
摘 　要 :用一段 45 个核苷酸的片段连接抗对硫磷抗体重链和轻链可变区基因片段 VH 和 VL ,获得了抗对
硫磷单链抗体 (single chain variable fragment , scFv)基因 ,构建了抗对硫磷 scFv 基因原核表达载体。SDS2
PAGE 和 Western blot 分析显示 ,该单链抗体基因能在大肠杆菌 Origami 2 中特异性表达 ,融合蛋白分子量
约为 28kD。用 Ni2NTA 金属亲和层析法对可溶性表达产物进行纯化 ,得到目的蛋白纯度为 7418 % ;
ELISA 反应结果证明 ,该单链抗体可以与对硫磷发生特异性反应。
关键词 :对硫磷 ;单链抗体 ;原核表达
PREPARATION AND PRIMARY IDENTIFICATION OF SCFV AGAINST PARATHION
SONGLi2min1 　ZHANG Wei2 　LIN Min2 　PAN Jia2rong1
(11 Institute of Agro2food Science and Technology , Chinese Academy of Agricultural Sciences , Beijing 　100094 ;
21Biotechnology Research Institute , Chinese Academy of Agricultural Sciences , Beijing 　100081)
Abstract :VH gene and VL gene of antibody against parathion were linked by a linker of 45nt to construct scFv gene and a
recombinant plasmid. The recombinant plasmid was transformed into E. coli Origami 2 and then induced to be expressed by
IPTG. SDS2PAGE and Western Blot analysis confirmed the expression of scFv gene , a recombinant protein of about 28kD was
obtained. It was purified by metal affinity chromatography using Ni2NTA , and the purity reached 7418 %. ELISA assay
revealed that the recombinant protein could specifically react with parathion.
Key words :parathion ;single chain variable fragment (scFv) ;prokaryotic expression
收稿日期 :2008204201 　接受日期 :2008205223
基金项目 :“十一五”国家高技术研究发展计划课题 (2006AA10Z449)
作者简介 :宋丽敏 (19802) ,女 ,博士研究生 ,研究方向为食品安全检测技术。E2mail : caas06a101 @yahoo. com. cn
通讯作者 :潘家荣 (19642) ,男 ,广东高州人 ,研究员 ,博士生导师 ,研究方向为农产品质量与食物安全。E2mail : panjr @2631net　　对硫磷为有机磷类广谱杀虫、杀螨剂 ,具有强烈的触杀与胃毒作用 ,并有一定的薰蒸作用[1 ,2 ] ,常被应用于果树及粮食作物的害虫防治上 ,因不合理使用而常常造成对食品、环境的污染及人畜、动物的危害。虽然它已经被限制或禁止使用 ,但仍然是国际食品贸易中的必检项目。目前 ,对有机磷类农药残留的检测方法多为液相色谱法[3 ] 、气相色谱法[4 ] ,这些方法前处理复杂 ,未能满足快速检测的需要 ,而免疫分析法具有简便、快速、灵敏等优点[5～7 ] ,近年来受到越来越多的重视 ,但对于农药等小分子半抗原类物质 ,其单克隆抗体的制备过程复杂 ,并且难以获得高特异性、高亲和力的 抗体。本文以对硫磷为研究对象 ,探索已知抗体基因的半抗原单链抗体 (single chian variable fragment , scFv)的工程构建 ,以为制备半抗原多价高亲和力抗体提供新的技术途径。1 　材料和方法111 　材料表达载体 pET28a ( + ) 和大肠杆菌 JM109 由中国农业科学院生物技术研究所实验室保存。大肠杆菌Origami 2 购自 Novagen 公司。ExTaq、T4 DNA 连接酶和
658　 核 农 学 报　2008 ,22 (6) :856～859Journal of Nuclear Agricultural Sciences
限制性内切酶购自 TaKaRa 公司 ;鼠抗 His 抗体购自
Novagen 公司 ;羊抗鼠 IgG2HRP 购于天根公司。对硫磷
抗体重链可变区 VH 和轻链可变区 VL 基因序列来自
NCBI数据库检索。
112 　方法
11211 　抗对硫磷 scFv 基因的设计 　根据对硫磷抗体
重链可变区 VH 和轻链可变区 VL 基因序列[8 ] ,在 360nt
的对硫磷抗体 VH 基因和 324nt 的 VL 基因之间通过加
上 45nt 的核苷酸序列将二者连接在一起 ,抗对硫磷
scFv 基因两端分别设计有 Nde Ⅰ和 Xho Ⅰ酶切位点及
保护碱基。抗对硫磷 scFv 基因序列见图 1。由上海生
工生物工程技术服务有限公司合成 ,所设计的抗对硫
磷 scFv 基因在公司提供的质粒 HF392 上。
图 1 　抗对硫磷 scFv 核苷酸序列
Fig. 1 　Sequence of scFv gene against parathion
11212 　抗对硫磷 scFv 表达质粒的构建 　根据合成的
序列设计并合成两条引物 , PA5F : 5′2GGG AAT TCC
ATA TGC AGG TGC AAC TGC AGGAGT C 23′;PA3R :5′2
GGT CTC GAG TTA CCG TTT GAT TTC CAG CTT23′(下
划线部分分别为 Nde Ⅰ和 Xho Ⅰ酶切位点) 。以质粒
HF392 为模板 ,以 PA5F 和 PA3R 为引物扩增 , PCR 产
物经 1 %的琼脂糖凝胶电泳后用胶回收试剂盒回收。
将回收的 PCR 产物和表达载体 pET28a 用 Nde Ⅰ和
Xho Ⅰ分别酶切后连接 ,产生的质粒 DNA 转化到大肠
杆菌 JM109。用碱裂解法提取质粒 ,进行酶切和 PCR
验证 ,并将筛选出的阳性重组子送交公司测序。
11213 　抗对硫磷 scFv 基因的表达及 SDS2PAGE 分析
　将经测序验证无误的重组质粒转化大肠杆菌
Origami 2 ,挑取单菌落于 3ml LB 液体培养基中 37 ℃培
养过夜后 ,按 1∶100 稀释到新鲜的 LB 液体培养基中 ,
振荡培养至 OD600 达 014～110 ,加 IPTG 至终浓度为
011mmolΠL ,继续于 17 ℃培养过夜。离心收集菌体 ,加
入 1Π10 体积样品缓冲液 ,振荡悬浮然后加入等体积的
2 ×SDS 凝胶加样缓冲液 ,100 ℃煮沸 5min 后进行 SDS2
PAGE分析 (浓缩胶为 5 % ,分离胶为 12 %) 。
11214 　scFv 的 Western Blot 检测及其纯化 　表达产物 的 Western Blot 检测参照 Towin 的方法[9 ] ,将转化的大肠杆菌 Origami 2 诱导表达后 ,离心收集菌体 ,超声波处理破碎细胞。SDS2PAGE并转膜后 ,以鼠抗 His 抗体为一抗 ,羊抗鼠 IgG2HRP 为二抗 ,最后用 TMB 底物显色。用 Ni2NTA 对可溶性表达产物进行回收 ,并且用BandScan 软件计算回收的可溶性目的蛋白纯度。11215 　scFv 的 ELISA 反应活性初步鉴定 　以回收的目的蛋白包被酶联板 , (每孔 100μl ,每个样品设 3 个重复) 37 ℃孵育 2h , PBST 洗涤 6 次 ,用 2 %的 BSA 封闭1h ,PBST洗涤后加对硫磷2HRP 孵育 2h , PBST 洗板后加底物于 37 ℃显色 15min ,用 2molΠL 的硫酸终止显色。于酶标仪 450nm 波长测定各孔吸光值。2 　结果与分析211 　抗对硫磷 scFv 表达载体的构建及鉴定以 PA5F 和 PA3R 为引物 ,质粒 HF392 为模板 ,经PCR 扩增 ,得到大小约为 750bp 的 1 条片段 ,将回收的片段与 pET228a 分别用 Nde Ⅰ和 Xho Ⅰ酶切、连接后转化大肠杆菌 JM109。所构建的质粒大小比 pET228a 大约 750bp (图 22A) ,双酶切结果 (图 22B) 以及 PCR 验证
758　6 期 抗对硫磷基因工程抗体 ScFv 的制备及其初步鉴定
筛选出的阳性重组子命名为 pET2AP ,进一步对 scFv 基
因进行测序 ,表明该 scFv 基因全长 732nt ,包括预期的
VH 、VL 和Linker 序列 ( GGGGS) 3 ,其阅读框架正确。
图 2 　抗对硫磷 scFv 重组质粒 (A)及其酶切 (B)电泳图
Fig. 2 　Electrophorisis of the recombinant plasmid
of scFv against parathion (A) and
its enzymatic digestion (B)
M: Marker ; 1 : pET228a ; 2 :重组质粒 pET2PA ;
3 :pET2PA 的 Nde Ⅰ和 Xho Ⅰ双酶切
2 :recombinant pET2AP ;
3 :enzymatic digestion of pET2PA by Nde Ⅰand Xho Ⅰ
212 　抗对硫磷 scFv 基因的表达和融合蛋白的纯化
含有重组质粒 pET2PA 的大肠杆菌 Origami 2 ,经培
养和 IPTG 的诱导后 ,其细胞粗蛋白提取液的 SDS2
PAGE检测结果显示该大肠杆菌特异性表达出 1 条大
小约为 28kD 的蛋白 ,与预测的抗对硫磷 scFv 蛋白大
小相当。而含空表达质粒 pET228a 的菌株蛋白粗提液
中没有相应的蛋白条带 (图 32A) 。Western Blot 检测鼠
抗 His 抗体仅与此 28kD 的诱导表达产物反应 ,而与其
他条带均无反应 (图 32B) ,证明此蛋白即为目的蛋白。
用 Ni2NTA 金属亲和层析法对可溶性表达产物进行回
收 ,经 BandScan 软件计算 ,回收到的目的蛋白纯度为
7418 %。
213 　scFv 的 ELISA 反应活性初步鉴定
通过 ELISA 方法检测表达的单链抗体的抗原识别
特性 ,以非相关抗体作阴性对照。结果 scFv 与对硫磷
呈阳性反应 ,在 450nm 波长下其抗原抗体反应的吸光
值为 01425 ±01005 ;而加非相关抗体的对照孔均呈阴
性反应 ,其 OD450 值仅为 01051 ±01002 ,表明该单链抗
体能与对硫磷发生特异性结合。
3 　讨论
目前 ,在农药残留分析方面 ,免疫分析法与气相色
谱、液相色谱一起被列为三大支柱技术[10 ] 。对于农药
残留的免疫分析法来说 ,最关键的就是要有高特异性
图 3 　抗对硫磷 scFv 的 SDS2PAGE(A) and
Western blot (B)结果
Fig. 3 　SDS2PAGE(A) and Western blot
analyses(B) of anti2parathion scFv
M: Marker ; CK:含 pET228a 的 Origami 2 细胞裂解液 ;
1 :含 pET2AP 的 Origami 2 细胞裂解液 ; 2 :纯化的 scFv
CK:Origami 2 crude lysate containing the pET228a ;
1 :Origami 2 crude lysate containing the pET2A
的抗体[11 ] 。但单克隆抗体的制备过程相对较复杂 ,尤
其是对于农药类小分子半抗原 ,因其不具备免疫原性 ,
要制备其抗体 ,必须先合成其人工抗原后才能免疫动
物。这就需要对农药的化学结构、稳定性、生产工艺和
稳定性有较全面的了解 ,这些都在一定程度上为单克
隆抗体的制备增加了困难。基因工程技术在抗体制备
方面的应用为获取高亲和力、高特异性抗体提供了一
种新的思路。通过分子生物学方法对抗体进行人工设
计 ,去除或减少其无关结构 ,保留或增加其生物学活性
和特异性 ,从而得到高特异性、高亲和力的重组抗体。
该方法不仅具有生产简单 ,价格低廉 ,容易获得稀有抗
体的优点 ,而且可以对抗体进行改造而制备多价或多
特异性抗体 ,而得到的重组抗体分子量较完整抗体分
子小 ,抗原结合位点数目却等于或多于一般完整抗体 ,
因此在固有亲和性不变的情况下提高了功能亲和性。
同时多价微抗与抗原结合形成的抗原 - 抗体复合物也
比较稳定 ,故应用多价微抗的策略可以使一些亲和力
一般的抗体会变得非常有用。近年来抗体库技术的发
展免除了杂交瘤技术繁杂的筛选过程 ,进一步拓宽了
抗体的应用范围 ,大大推进了抗体工程的发展。
本研究选择 GenBank 中对硫磷抗体序列为研究对
象 ,对其进行分析后在 VH 和 VL 之间加上了 45 个核
苷酸作为连接肽序列 ,由公司合成。构建单链抗体表
达载体 ,经过原核表达得到的目的蛋白可以特异性识
别对硫磷。为进一步制备多价高亲和力抗体备奠定了
基础 ,并且为基因工程抗体在农药检测方面的应用提
供依据。
858 核　农　学　报 22 卷
外源蛋白在大肠杆菌中高表达时往往形成包涵
体 ,因此探索重组蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达是
抗体工程研究的一项重要任务。本研究选用 Origami 2
菌株进行 scFv 的表达 ,该菌株硫氧还蛋白还原酶和谷
胱甘肽还原酶均被突变 ,因而有利于胞浆内二硫键的
形成 ,可促进蛋白的正确折叠。另有研究表明即使总
体表达水平相似 ,Origami (DE3) 表达的活性蛋白比其
它宿主菌高 10 倍以上。本研究胞浆中的 scFv 经过纯
化后 ,经 ELISA 检测 ,发现其能够与对硫磷结合 ,说明
该单链抗体在胞浆中获得了正确折叠 ,具有特异的抗
原识别能力。
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