全 文 ：文章编号 :100028551 (2009) 0120070205
玉米基因 sbe1 cDNA 的克隆与原核表达
张军杰1 ,2 　周　会1 　胡育峰1 　田孟良1 ,3 　刘汉梅1 ,2 　黄玉碧1 ,3
(11 四川农业大学玉米研究所 ,四川 雅安　625014 ; 21 四川农业大学生命理学院 ,四川 雅安　625014 ;
31 四川农业大学农学院 ,四川 雅安　625014)
摘 　要 :采用 RT2PCR 技术克隆了玉米基因 sbe1 全长 cDNA 序列 ,在 NCBI 上序列比对后与文献报道的
sbe1 基因序列同源性达到 99 %。同时构建了原核生物表达载体 pET32 (a + )2sbe1 ,成功表达出了 SBE Ⅰ
蛋白。为进一步体外研究 SBE Ⅰ的物理化学性质及催化机理奠定基础。
关键词 :玉米 ; sbe1 基因 ;基因表达
CLONE AND EXPRESSION OF sbe1 cDNA FROM MAIZE IN E. coil
ZHANGJun2jie1 ,2 　ZHOU Hui1 　HU Yu2feng1 　TIAN Meng2liang1 ,3 　LIU Han2mei1 ,2 　HUANG Yu2bi1 ,3
(11 Maize Research Institute , Sichuan Agricultural University , Ya’an , Sichuan 　625014 ; 21 Life Science College , Sichuan Agricultural
University , Ya’an , Sichuan 　625014 ; 31Agronomy College , Sichuan Agricultural University , Ya’an , Sichuan 　625014)
Abstract :The cDNA of sbe1 c from maize was cloned by RT2PCR and compared with the reported sequence of sbe1 cDNA in
GenBank. The results showed that the nuleotide sequence homology were 99 %. The sbe1 cDNA were inserted pET32a ( + )
vector by restriction endonuclease digestion , electrophoresis , gel reclamation DNA ligation and so on molecular biological
technologies , and that which were transformed to E. coil BL21 (DE3) . At the same time sbe1 cDNA was induced expression
in E. coil BL21 (DE3) by IPTG, and the SBE Ⅰprotein was expressed. The experimental result lay a foundation for further
study on the physical and chemical properties of SBE Ⅰ in vitro.
Key words :maize ; sbe1 ; gene expression
收稿日期 :2008204223 　接受日期 :2008206217
基金项目 :国家 863 项目 (2008AA10Z123) ,教育部长江学者和创新团队发展计划资助 ( IRT0453) ,四川省教育厅青年基金项目 (2006B010)
作者简介 :张军杰 (19742) ,男 ,山西临汾人 ,讲师 ,博士 ,从事淀粉品质生化研究。E2mail :maizestarchs @1631com
通讯作者 :黄玉碧 (19632) ,男 ,四川西充人 ,教授 ,博士 ,从事玉米遗传育种研究。E2mail : yubihuang @sina. com　　玉米籽粒淀粉合成主要在造粉体 ,它以光合作用产生的蔗糖作为淀粉合成的碳源 ,蔗糖经水解后形成12磷酸葡萄糖 ( G1P)进入造粉体 ,再通过腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶催化其与 ATP 反应 ,生成腺苷二磷酸葡萄糖 ,参与淀粉的合成。在造粉体淀粉合成最后阶段还有 3 个关键的调控酶 : 淀粉合成酶 ( starchsynthase , SS) 、淀粉分支酶 ( starch branching enzyme ,SBE) 、淀粉脱分支酶 (starch debranching enzyme ,SDBE) 。淀粉分直链淀粉和支链淀粉 ,两类淀粉所占比例及支链淀粉的结构共同决定了淀粉结构。直链淀粉主要由粒结合淀粉合成酶 ( granule2bound starch synthase ,GBSS)负责合成 ,而支链淀粉则由可溶性淀粉合成酶 (soluble starch synthase ,SSS)以及 SBE和 SDBE 3 种酶协同催化形成[1 ] 。其中 SBE 是一个葡聚糖链转移酶 ,催化葡聚糖链中α21 ,4 糖苷键的断裂 ,并将释放出的寡葡聚糖链的还原端连接到另一葡聚糖链的一个葡萄糖残基 C6 羟基上 ,形成一个新的α2l , 6 糖苷键 ,产生 1个分支[2 ] ,因此它是支链淀粉合成中非常关键的一种酶 ,对于淀粉的品质具有重大的影响作用。由于玉米胚乳中蛋白种类繁多 ,而且相互交织在一起 ,有些蛋白在形成淀粉的过程中又和淀粉粒紧密吸附 ,并随着淀粉粒的生长而陷入淀粉粒的内部 ,因此直接从胚乳中分离纯化 SBE蛋白十分困难。本研究通过 RT2PCR 法克隆玉米基因 sbe1 的
07　 核 农 学 报　2009 ,23 (1) :70～74Journal of Nuclear Agricultural Sciences
cDNA ,并构建表达载体 ,在大肠杆菌中诱导过量表达 ,
分离纯化后可以大量获得纯化的酶蛋白 ,从而为在体
外对 SBEI的理化性质和催化机理进行研究 ,推测它们
在生物体内合成淀粉的作用机制奠定基础。
1 　材料与方法
111 　材料
试验所用玉米为高淀粉玉米自交系 41508422 ,其
籽粒淀粉含量约 70155 % ,种子由四川农业大学玉米
研究所提供 ,于 2005 年 4 月在学校农场常规载培 ,取
授粉后 18 - 30d 的胚乳为材料。
Trizol 总 RNA 抽提试剂盒、LA TaqDNA 聚合酶、
IPTG、DEPC、DNA Marker ,克隆载体 pMD182T、琼脂糖、
RT2PCR 试剂盒 ( TaKaRa RNA LA PCRTM Kit (AMV)
Ver. 111) 以及胰蛋白胨与酵母提取物均购于成都天
泰公司 (代理 Takara 公司产品) ;凝胶回收试剂盒为
promega 公司产品 ;小量制备质粒 DNA 试剂盒为 Omega
公司产品 ;限制性内切酶 EcoR Ⅴ、Xho Ⅰ、Sma Ⅰ、T4
DNA 连接酶和 pET232a 表达质粒购自 Invitrogen 公司 ;
大肠杆菌 DH5α及 BL21 (DE3) 为本实验室保存 ; PCR
引物由上海 Invitrogen 公司合成。
112 　试验方法
11211 　总 RNA 提取 　取授粉后 18 - 25d 的玉米胚乳
011～012g ,在液氮中磨成粉末 ,提取胚乳总 RNA ,提取
方法参照 TaKaRa 公司 Trizol 总 RNA 抽提试剂盒说明
书 ,提取后用 115 %的琼脂糖凝胶电泳检测 ,同时用分
光光度计定量检测 RNA 样品。
11212 　RT2PCR 法 　参照 RT2PCR 试剂盒 [ TaKaRa
RNA LA PCRTM Kit (AMV) Ver. 111 ]说明书 ,于冰上依
次向 PCR 管中加入 2μl RNA 模板、1μl oligo (dT) primer
(015μgΠμl ) 、9μl dd H2O ,混匀 ,70 ℃变性 5min ,冰上骤
冷 ,再加入 1μl RNase inhibitor (20UΠμl) 、4μl 5 ×reaction
buffer、2μl 10mmolΠL dNTP、1μl AMV 反转录酶 (200UΠ
μl) ,总体积 20μl ,42 ℃温育 1h ,70 ℃终止反应 10min ,冰
水骤冷 , - 20 ℃保存。
11213 　cDNA 的扩增 　根据 GenBank 中玉米及其他单
子叶植物 sbe1 基因的 cDNA 序列 ,使用 Primer510 软件
设 计 PCR 扩 增 引 物 : 上 游 为 5′2
CTGATATCCAATGCCTGCAGGTCGAC23′, 下 游 为 5′2
TGCTCGAGCTTCATTTGGTATCTTG23′。(画线部分分别
为 EcoR Ⅴ和 Xho Ⅰ限制性内切酶酶切位点 ,下游引物
上 TCA 为终止密码子) 。
酶切反应体系为 25μl ,依次加入 14125μl dd H2O、
2μl 反转录产物、215μl 25mmolΠL MgCl2 、215μl 10 ×
Buffer、215μl 215mmolΠL dNTP、015μl 上游引物、015μl 下
游引物、0125μl LATaq 酶 (5UΠμl) 。PCR 反应程序 :94 ℃
预变性 5 min , 94 ℃ 35s , 53 ℃ 40s , 72 ℃ 3min , 72 ℃
7min ,34 个循环。PCR 产物 110 %琼脂糖电泳回收。
11214 　PCR 产物连接与转化 　PCR 产物与 p GEM2T
(T2easy 载体) 的连接方法根据载体的产品说明进行 ,
4 ℃连接过夜。根据参考文献[3 ] 中的方法进行感受态
细胞的制备及转化。最后在铺有 IPTG和 X2gal 的含有
Amp (氨卞青霉素)的LB 培养基平板上挑出白色菌落 ,
筛选出阳性质粒。
11215 　阳性克隆 PCR 鉴定及序列测定 　菌液 PCR 鉴
定 :待菌斑长到合适大小 ,用灭菌的牙签挑取几个白
斑 ,分别于含有 50μg Amp Πml 的LB 液体培养基中振荡
培养 12 - 16h。向 PCR 管中加入 1213μl dd H2O、2μl
25mmolΠL MgCl2 、2μl 10 ×Buffer、2μl 215mmolΠL dNTP、上
下游引物各 015μl ,015μl 菌液和 012μl LATaq 酶 (5UΠ
μl) 。PCR 反应参数同 11213 所述。目的片段测序由上
海 Invitrogen 生物公司完成。
11216 　表达载体的构建 　质粒的提取按 TaKaRa
MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver. 210 试剂盒说明书
进行。对提取的 pMD182sbe1 质粒进行 EcoR Ⅴ, Xho Ⅰ
双酶切 ,酶切体系为 20μl ,分别加入 12μl ddH2O、5μl 质
粒、2μl 10 ×buffer H、EcoR Ⅴ, Xho Ⅰ各 015μl ,37 ℃温浴
5h ,1 %琼脂糖电泳 ,回收 215kb 处DNA 片段。pET32 (a
+ ) 分别用上面两种酶酶切 ,回收 519kb 处 DNA 片段。
目的片段与双酶切后的 pET32 ( a + ) 连接 ,体系为
10μl ,依次向 PCR 管中加入 5μl sbe1 酶切片段、1μl 酶
切后 pET32 (a + ) 、1μl 10 ×buffer、1μl T4 连接酶和 2μl
dd H2O ,16 ℃连接过夜。
11217 　淀粉分支酶的诱导表达 　诱导表达方法参考
祖元刚等[4 ] 方法 ,用重组质粒 pET32 ( a + )2sbe1 和
pET32 (a + )空白质粒热击法转化大肠杆菌BL21 (作为
阴性对照) ,取 5μl 过夜连接产物和 150μl 大肠杆菌
BL21 感受态细胞冰浴混匀 , 42 ℃水浴热击 90s ,加
600μl LB 培养基 ,80～100rΠmin 摇床上震荡 40min ,涂布
于含有 Amp 固体LB 培养基上 ,过夜培养 ,16h 后挑选
阳性克隆 ,质粒经酶切鉴定正确后 ,接种于 2ml 含有
Amp (100μgΠml)的LB 培养液中过夜培养 ,将过夜培养
物按 1∶100 比例接种于 100ml 含 Amp 的LB 培养基中 ,
培养 2h 后加入 IPTG(终浓度为 1mmolΠL) 诱导表达 ,
37 ℃振荡培养 5 - 8h ,离心收集菌体 ,沉淀菌体用柠檬
酸缓冲液 (pH = 710) 清洗 1 次 ,5000rΠmin 离心 10min ,
17　1 期 玉米基因 sbe1 cDNA 的克隆与原核表达
沉淀加 100μl 柠檬酸缓冲液 ,超声波破碎 ,频率为
20KHz ,超声处理 3 - 5s ,间隙 3 - 5s ,持续 10 - 15min
后 ,离心 ,取上清 4 ℃储存备用。蛋白样品中加入等体
积的 2 ×SDS 上样缓冲液 ,混匀 ,100 ℃处理 5min 备用。
2 　结果
211 　玉米胚乳总 RNA 提取
以授粉 18d 的玉米籽粒为材料 ,其胚乳总 RNA 主
要由 rRNA (占 80 %～85 %) 、tRNA 和 mRNA 构成。如
图 1 所示 ,玉米籽粒胚乳 RNA 主要条带为 28S、18S 和
518S rRNA ,各条带清晰 ,28S rRNA 带是 18S rRNA 带亮
度的两倍左右 ,稀释 20 倍测其紫外吸光值 (A260 =
11168 ,A280 = 01621 ,A230 = 01551 ,A260ΠA280 = 1189 , RNA
浓度为 018μgΠμl) ,结果表明其纯度和完整性符合试验
要求。
图 1 　胚乳总 RNA 的电泳图
Fig. 1 　Agrose electrophoresis of total RNA
from endosperm of maize
图 2 　RT2PCR 扩增产物的电泳图
Fig. 2 　The amplification fragments
of sbe1 on agrose gel
1 :marker (100～6000) ; 2、3 : sbe1 PCR 产物
1 :marker (100～6000) ; 2 :PCR production of sbe1 gene
212 　玉米胚乳 sbe1 cDNA 序列的扩增
经 RT2PCR 扩增后 ,扩增产物由 110 %琼脂糖凝胶
电泳检测 ,结果如图 2 所示。由图 2 可知 ,扩增片段特
异性强 ,无杂带 , sbe1 的带在 215kb 左右 ,与 GenBank
中的序列大小相符 ,可初步确定这些扩增片段为目的
片段 ,及时回收这些片段于 - 20 ℃保存备用。
213 　阳性克隆的菌液 PCR 鉴定
将回收的 sbe1 cDNA 片段连接到 pMD182T 载体
上 ,转化大肠杆菌 DH5α感受态细胞 ,蓝白斑筛选 ,白
色菌落为重组转化体。挑取 2 个单菌落于含有 Amp
的液体 LB 培养基过夜培养。取菌液进行 PCR 扩增 ,
经 1 %琼脂糖凝胶电泳显示有目的条带 (图 3) ,初步筛
选得到阳性克隆。
图 3 　阳性克隆的 PCR 鉴定
Fig. 3 　The PCR indentification of pMD182sbe1
1 :DNA 标准 ;2 :pMD182sbe1 质粒菌液 PCR 鉴定
1 : DNA marker (100～6000) ; 2 : PCR defication of the pMD182sbe1
214 　sbe1 cDNA 序列测定
玉米淀粉分支酶 sbe1 cDNA 测序结果已提交
Genebank ,注册号为 EF535145 , sbe1 cDNA 的 CDS 区总
长 2472bp , 编码 823 个氨基酸残基 , 分子量约为
9217kD。本试验分离的 sbe1 cDNA 序列与 Fisher 1995
年克隆的玉米 sbe1 cDNA (序列号为 U17897) [2 ] 相比有
13 处碱基突变 ,其中有 8 处造成了氨基酸变化 ,基因
序列同源性达到 99 % ,证明已克隆出了 sbe1 cDNA。
215 　sbe1 cDNA 原核生物表达载体构建
表达载体 pET32a ( + ) ,pMD182sbe1 用 EcoR Ⅴ和
Xho Ⅰ双酶切 (如图 4) ,1 %琼脂糖凝胶电泳回收约
214kb 和 519kb 处的目的片段 ,连接转化 ,然后用菌液
PCR 筛选转化子 (图 5) ,在 215kb 处有目的条带 ,提取
质粒再分别用单酶切和双酶切进行鉴定 (图 6) ,pET32
(a + )2sbe1 的单酶切比 pET32a ( + )单酶切后的条带要
大 ,pET32 (a + )2sbe1 的双酶切在 214kb 处有目的条
带 ,说明 sbe1 已插入 pET32a ( + )表达载体中。
216 　诱导表达
经鉴定 ,含有 pET32a2sbe1 质粒的阳性克隆经过夜
培养已转化到表达宿主菌 BL21 (DE3) 感受态细胞中。
含有 pET32 (a + )2sbe1 的 BL21 菌株经 1mmol 的 IPTG
诱导 ,37 ℃培养 528 h ,取 1ml 菌液离心收集菌体 ,提取
细菌总蛋白上清液 30μl , 经 12 % SDS2PAGE 电泳 (图
27 核　农　学　报 23 卷
图 4 　质粒双酶切图
Fig. 4 　Restrictive enzymes digestion of plasmids
1 :pMD182sbe1 质粒 EcoR Ⅴand Xho Ⅰ酶切结果 ;
2 :DNA marker (100～6000) ;3 :pET32 (a + )质粒
EcoR Ⅴand Xho Ⅰ酶切结果
1 : EcoR Ⅴand Xho Ⅰenzymes digestion of pMD182sbe1 ;
2 : DNA marker (100～6000) ;3 : EcoR Ⅴand Xho Ⅰenzymes
digestion of pET32a ( + )
图 5 　表达载体 PCR 鉴定
Fig. 5 　The PCR indification of plasmids
1 :DNA marker (100～6000) ;2、3 :pET32a2sbe1 质粒菌液 PCR 鉴定
1 :DNA marker (100～6000) ;2 , 3 : The PCR production of pET32a2sbe1
图 6 　质粒酶切鉴定图
Fig. 6 　Restrictive enzymes digestion
indification of plasmids
1 :DNA marker (100～6000) ;2 :pET32 (a + )质粒 EcoR Ⅴ酶切 ;
3 :pET32a2sbe1 质粒 EcoR Ⅴ酶切 ;
4 :pET32a2sbe1 质粒 EcoR Ⅴ和 Xho Ⅰ双酶切
1 :DNA marker (100～6000) ; 2 : EcoR Ⅴenzyme digestion
of pET32 (a + ) ; 3 : EcoR Ⅴenzymes digestion of pET32a2sbe1 ;
4 : EcoR Ⅴand Xho Ⅰenzyme digestion of pET32a2sbe1
7) ,在 90～93kd 处发现目的条带 ,而对照没有 ,说明
pET32 (a + )2sbe1 质粒能在 BL21 中正确表达出融合蛋
白。
图 7 　pET32 (a + )2sbe1 质粒表达蛋白 SDS2PAGE电泳图
Fig. 7 　SDS2PAGE of protein expressed
by engineering bacteria
3 　讨论
淀粉分支酶 (SBE) 通过在线性的α21 ,4 糖苷键连
接的葡萄糖链中引入α21 ,6 糖苷键分支点催化支链淀
粉的形成。在淀粉的合成过程中 ,SBE 通过增加非还
原端的数量而为淀粉合成酶提供增加葡萄糖的位点 ,
所以 SBE对于决定植物淀粉的数量和质量是十分重
要的[2 ] 。事实上 ,玉米和水稻中的 sbe 基因突变使淀
粉总量大幅度减少 ,显著改变了直链淀粉与支链淀粉
酶之间的比例[2 , 5 ] 。但我们对淀粉分支酶的蛋白质结
构和作用机理知之甚少。SBE既可以与淀粉粒结合存
在 ,也可以以游离态存在于基质中 ,因此分离纯化 SBE
相当困难 ,从而不利于对 SBE 的蛋白质结构与功能进
行深入研究 ,而利用基因工程手段来产生 SBE 是一个
很好的选择 ,采用大肠杆菌融合表达策略能使两种蛋
白在基因水平融合在一起 ,使重组蛋白的检测和纯化
变的更为容易 ,研究结果对于通过生物技术改良淀粉
具有重要意义[6 ] 。
本试验采用 pET32 (a + ) 融合蛋白表达系统表达
外源蛋白质 ,表达出来的融合蛋白含有 6 ×His·Tag ,可
用特异性强的亲合层析技术 ,即 Ni2NTA 技术对融合表
达蛋白进行纯化。PET32a ( + ) 含 T7 启动子和转录终
止信号 ,其特点除了能够编码 6 个组氨酸残基外 ,还带
有大肠杆菌 TrxA 基因 , TrxA 基因编码 109 个氨基酸的
硫氧还蛋白 ,外源基因经多克隆位点插入后与 TrxA 一
起融合表达 ,外源蛋白与硫氧还蛋白融合表达提高了
37　1 期 玉米基因 sbe1 cDNA 的克隆与原核表达
表达产物的稳定性。此外 ,外源蛋白与硫氧还蛋白之
间具有肠激酶和凝血酶的识别位点 ,从而使外源蛋白
与硫氧还蛋白的分离也非常方便。本试验成功构建玉
米 sbe1 基因的原核表达质粒 ,转化到受体菌 BL21 后 ,
经 IPTG诱导 ,表达出了 SBE Ⅰ蛋白 ,但试验检测酶活
性很低 ,这可能是由于原核细胞没有翻译后修饰、缺乏
将蛋白质有效释放到培养基中的分泌机制和充分形成
二硫键的能力 ;另一方面 ,由于这个基因比较大 ,因此
翻译后的多肽链在细胞的折叠和高级结构的形成不如
在真核细胞中效率高 ;第三 ,原核细胞中表达后 ,极易
形成包涵体 ,影响多肽链的折叠和一些氨基酸残基翻
译后修饰 ,这也可能是造成原核细胞融合表达的 SBE
Ⅰ蛋白活性比较低的原因 ;第四 ,许多研究表明细胞生
长速率严重影响外源蛋白的表达 ,接种菌量、诱导前细
胞生长时间和诱导后细胞密度等都会影响外源基因的
表达 ,细胞生长过度或过速都会加重细菌合成系统的
负担 ,导致形成包涵体。因此融合表达的酶蛋白活性
与表达系统、培养条件及融合蛋白的分离条件有很大
关系 ,需要进一步优化 sbe1 基因表达及蛋白提取条
件。
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