全 文 ：文章编号 :100028551 (2002) 0120045204
检测睾酮、孕酮、雌酮与雌三醇的
双抗体酶免疫分析法
郭大智
(四川农业大学核技术农业应用研究室 ,四川 雅安　625014)
摘 　要 :本文报道了自制的试剂建立了检测睾酮、孕酮、雌酮和雌三醇的双抗体酶免疫
分析法。实验表明 ,这些测定具有很高灵敏度 (最小可测量为 011～1pgΠ孔) ,标准曲
线范围为 0～40pgΠ孔 ;同相关类固醇激素 (孕酮、孕烯醇酮、睾酮、雄酮、雌酮、雌三醇
和皮质酮等)的交叉反应率一般在 011 %以下。测定的批内和批间变异系数分别在
518 %～712 %与 915 %～1015 %(n = 8) 范围内。向血中添加激素标准品后的回收率
在 94 %～110 %范围内。用自制防腐剂处理后 ,液态抗体 (包括第二抗体) 、酶标记物
和已包被第二抗体的滴定板可保持活性 5～12 个月或更久 (4 ℃～ - 20 ℃) 。此测定
可节约激素特异抗体 4～10 倍。初测人和动物的血、奶、尿样品表明所建立的 4 种测
定方法可分别用于人和动物体液中睾酮、孕酮、雌酮和雌三醇的定量检测。
关键词 :双抗体酶免疫分析 ;睾酮 ;孕酮 ;雌酮 ;雌三醇
收稿日期 :1999206225
作者简介 :郭大智 , (1930～)男 ,四川中江县人 ,四川农业大学教授 ,从事核技术与酶免疫分析技术在动物科学上的应用
和教学工作
酶免疫分析 ( EIA)技术的建立与发展已有近 30 年的历史。在测定中 ,大多数研究者首先
以能与待测物进行特异结合反应的抗体包被固相载体 ,然后使之与待测物、酶标记物等进行免
疫反应。Meyer[1 ,2 ]最先报道了一种双抗体酶免疫分析法 ,即在测定中首先以过量绵羊抗兔抗
体包被固相载体 ,然后使之与激素特异抗体 (源于免血清) 、酶标记物、待测物等进行反应。这
种方法具有精确性强、灵敏度高、节约特异抗体等优点。本研究从制备测定中所需的各种试剂
入手 ,试图建立检测孕酮、睾酮、雌三醇与雌酮的高灵敏度双抗体酶免疫分析法。
1 　材料与方法
111 　主要试剂
11111 　激素特异抗体 　抗原在本实验室制备。采用混合酐法分别将孕酮26β2OH2半琥珀酸盐、
雌三醇2C62CMO、雌酮2C62CMO(以上均购自 Steraloids Inc. ) 及睾酮2C32CMO (购自 Sigma Co. ) 与
BSA(购自 Sigma Co. )联结 ,免疫家兔 4～5 只 ,经 6～10 个月验血后收集血清 ,冻干保存于 -
30 ℃。选用的 4 种抗血清的滴度为 :孕酮 1∶210 000 ,雌三醇 1∶180 000 ,雌酮 1∶380 000 ,睾酮
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1∶36 000。使用前从抗血清中分离出 IgG。加防腐剂 (自配)保存于 - 20 ℃或 4 ℃备用。
11112 　第二抗体 　用正常家兔的 IgG免疫 2 只成年山羊 ,5 个月后获得较高滴度的抗血清 ,冻
干低温保存。使用前分离出 IgG,纯化并保存于低温备用。
11113 　酶标记物 　4 种激素的酶标方法参照 Meyer 对 trenbolone 与碱性磷酸酶的联结方法[2 ] 。
以酶标睾酮为例 ,将 2mg 睾酮2C32CMO 溶于 50μl 甲醇与 20μl 1N HCl 中 ,干燥后熔于 500μl 二甲
基甲酰胺及 5μl 42甲基吗啉 ,冷却至 - 15 ℃,作为 A 液 ;另将 5mg 辣根过氧化物酶 (购自 Sigma
Co. ,用前以自制 DEAE2琼脂醣凝胶纯化) 溶于 500μl 水 ,与 400μl 二甲基甲酰胺混合 ,作为 B
液。将 20μl 氯甲酸异丁酯加入 A 液 ,并与 B 液混合 ,在 - 15 ℃条件下搅拌 1h ,然后在 0 ℃搅拌
2h ,透析过夜 ,通过 Sephadex G225 柱纯化 ,检查滴度后低温保存。4 种激素的酶标产物经稀释
6 000～55 000倍后作为工作溶液。
112 　仪器与材料
酶促反应的测量用酶免疫测定仪 (Labsystems Multiskan plus ,英国) ;固相载体用酶标板或酶
标硬条 (康佳医化器械厂) 。
113 　测定程序
11311 　板孔包被 　用加样器将山羊抗兔 IgG(二抗) 与包被缓冲液 (50mM NaHCO3 , pH916) 的
混合液分配入酶标板孔 (100μl/ 孔) ,其中含二抗 (1μgΠ孔) 。在 0～4 ℃孵育过夜。甩弃孔内液
体后加入分析缓冲液 ( PBS 中含 011 % BSA) 250μl/ 孔 ,室温孵育 20～50min。此后如不及时使
用 ,即甩弃孔内液体密封保存于 - 18 ℃。使用时用洗液含 0105 %吐温 - 80 的蒸馏水) 洗板孔 2
次 ,每次 250μl/ 孔 ,拍干孔内液体。
11312 　免疫反应 　先后向板孔内加入 30μl 标准液或样品液、60μl 酶标记物与 60μl 抗体 ,用指
尖轻扣板孔边缘 ,混合孔内液体。在 6 ℃～35 ℃避光放置 2～3h。
11313 　底物反应与测量 　甩弃板孔液体 ,用洗液洗孔 4 次 ,每孔加入 150μl 底物液 (100mM 醋
酸钠2柠檬酸液中含 0101 %四甲基联苯胺与 01004 %H2O2 ,pH515) ,室温避光放置 30～40min 后
加终止液 (4N H2 SO4 ) 50μl/ 孔 ,用酶免疫测定仪在 450nm 处测吸光率。
114 　试剂保存试验
为能使抗体、酶标记物长期保持活性 ,通常将其冻干 ,使用时解冻、稀释。但稀释后这些试
剂易于变性。反复冻融也易变性。因此将自配防腐剂加入这些液态蛋白质试剂中 ,观察它们
在不同温度条件下维持活性的期限。
2 　结果与分析
211 　方法学鉴定
21111 　睾酮 EIA 　(1)灵敏度 :最小可测量 015pgΠ孔 ;标准曲线范围 0～32pgΠ孔 (可调整) 。(2)
特异性 :与不同类固醇激素的交叉反应率 ,睾酮为 100 % ,雄酮为 011 % ,孕酮、孕烯醇酮、雌酮、
雌二醇、雌三醇及皮质酮均小于 011 %。(3)精密度 :测定的批内和批间变异系数分别为 518 %
(n = 8)和 915 %(n = 8) 。(4)准确性 :向血或奶中添加标准睾酮后的回收率为 98 %～110 %。
21112 　孕酮 EIA 　(1) 灵敏度 :最小可测量为 015pgΠ孔 ;标准曲线范围为 0～32pgΠ孔 (可调) 。
(2)特异性 :同相关类固醇激素的交叉反应率孕酮为 100 % ,孕烯醇酮为 8 % ,睾酮、雄酮、雌酮、
雌二醇、雌三醇或皮质酮均小于 011 %。(3)精密度 :测定的批内和批间变异系数分别为 615 %
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(n = 8)和 917 %(n = 8) 。(4)准确性 :回收率为 94 %～108 %。
21113 　雌三醇 EIA 　(1)灵敏度 :最小可测量 1pgΠ孔 ;标准曲线范围 0～40pgΠ孔 (可调) 。(2) 特
异性 :与不同类固醇激素的交叉反应率雌三醇为 100 % ,睾酮为 012 % ,雌酮、雌二醇、孕酮、孕
烯醇酮、雄酮与皮质酮均小于 011 %。(3)精密度 :测定的批内与批间变异系数分别为 712 %(n
= 8)和 910 %(n = 8) 。(4)准确性 :回收率为 96 %～109 %。
21114 　雌酮 EIA 　(1)灵敏度 :最小可测量 1pgΠ孔 ;标准曲线范围 0～40pgΠ孔 (可调) 。(2) 特异
性 :与不同类固醇激素的交叉反应率雌酮为 100 % ,孕酮为 116 % ,孕烯醇酮为 112 % ,雌二醇与
雌三醇为 018 % ,睾酮、雌酮及皮质酮均小于 011 %。(3) 精密度 :测定的批内与批间变异系数
分别为 616 %(n = 8)与 1015 %(n = 8) . (4)准确性 :回收率为 95 %～105 %。
212 　样品试测
应用所建立的方法初步测定了孕妇 (60 人)血清中的孕酮、睾酮、雌酮与雌三醇的含量 ,黑
白花奶牛 4 头在发情周期中的孕酮含量变化 ,雌大熊猫 5 头在孕和未孕情况下尿中孕酮、雌三
醇的含量变化 ,梅山母猪 8 头妊娠期尿液孕酮、雌三醇含量的变化 ,罗曼公鸡 23 只在 16～25
周龄期间的血清睾酮含量等 ,获得了有意义的数据。将检测孕酮的方法调整简化为可在现场
对奶牛进行快速早孕诊断的方法 ,正在四川、宁夏、北京、福建等地的一些县市应用。
213 　试剂保存
经观察 ,添加自制防腐剂后 ,液态激素特异抗体、第二抗体与酶标记物 ,在 - 20 ℃和 4 ℃条
件下可分别维持活性 270d 和 150d 以上 ,在此期间因取用而多次短暂拿出与返回冰箱 ,不影响
其有效性。在 23 ℃～26 ℃(夜)和 26 ℃～32 ℃(昼)条件下可维持活性 20d。滴定板在用第二抗
体包被和自制稳定剂处理后 ,在 - 20 ℃条件下可维持活性 1 年以上 ;使用期即使短暂拿出和返
回冰箱 ,亦不影响其活性。在 4 ℃条件下可保存 150d。在 23 ℃～26 ℃(夜) 和 26 ℃～32 ℃(昼)
的条件下可维持活性 60d。底物液在 1 ℃～5 ℃可保持 150d 以上 , - 20 ℃可保持 1 年以上。
此外 ,将激素特异抗体包板与第二抗体包板后的本底测数作了比较。用特异抗体包板后 ,
以 1 %BSA 封闭 ;用二抗包板后仅用 011 %BSA 封闭。前者的本底测数 (吸光率) 一般在 0108～
0115 ,而二抗包板后的本底测数一般在 0104～0108 ,表明这种方法有助于降低本底测数。
3 　讨 　论
实验表明 ,这种第二抗体包板测定程度的优点 : (1) 灵敏度比已报道的同种用途的放射免
疫分析与酶免疫分析法约高出数倍至百倍[3～9 ] ;各测定的标准曲线范围可按样品中激素浓度
高低而调整。(2) 4 种测定的批内与批间变异系数一般分别在 518 %～712 %与 915 %～1015 %
之间 ,具有较好的重复性。(3)在激素特异抗体的用量方面 ,二抗包板法仅为特异抗体包板法
的 10 %～25 % ,节约了这一较珍贵的试剂。虽此测定程序需用相对较多的二抗 ,但二抗较易
制备且价廉 ,自制一批抗血清后 ,可测大量样品。(4) 测定本底较低 ,减少了干扰因素。(5) 使
用自制防腐剂后 ,可使液态抗体、酶标记物、已包被二抗的滴定板保存较长时间 ,为测定的稳定
性创造了条件。而作定量测定的滴定板以激素特异抗体包板后 ,仅能保存 7d～90d。
致谢 :刘显义研究员、陈发菊副研究员参加了 4 种激素抗体的生产 ,张旭助教作了孕妇血清和梅山猪尿液激素检测 ,何
廷美、胡大明同志参加了大熊猫尿液激素检测 ,吴素琼实验师参加了部分实验工作 ,特此致谢。
74　1 期 检测睾酮、孕酮、雌酮与雌三醇的双抗体酶免疫分析法
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DEVELOPMENT OF DOUBLE2ANTIBODY ELISAs FOR TESTOSTERONE ,
PROGESTERONE , ESTRONE AND ESTRIOL DETERMINATION
GUO Da2zhi
( Sichuan Agricultural University , Yaan , Sichuan prov. 　625014)
ABSTRACT:Sensitive ELISAs for testosterone , progesterone , estrone and estriol measurement
using second2antibody techniquqe were developed. The key reagents used in the assays including
hormone specif ic antibodies , goat IgG anti2rabbit IgG and enzyme2steroid conjugates were self2
prepared. The detecting limits of these assays were 015～110pgΠwell ; the calibration curves were
sensitive in the range of 0～40pgΠwell . The intra2and interassay coeff icients of variation were in
the range of 518 %～712 %and 915 %～1015 %( n = 8) , respectively. The cross2reactivities with
progesterone , pregnenolone , testosterone , androsterone , estrone , estradiol , estriol and cortico2
sterone were mostly below 011 %. Recovery rate of the 4 steroids added to human serum ranged
94 %～110 %. The liquid antibodies( including second2antibodies) , enzyme conjugates and second
antibody coated plates remained workable for 150 to 360 days or more ( 4～20 ℃) after treatment
with the conservative self2prepared. The quantity of the hormone2specif ic antibody needed in the
present assays was only 1/ 4 to 1/ 10 of the previous ELISA , in which the plate was coated with
hormone2specif ic antibody. Preliminary tests for the 4 steroids in sera , milk or urine in pregnant
women , pigs , dairy cows , chickens and giant pandas showed that these ELISAs with high sensi2
tivity , reproducibility , specif icity and long storage life can be used for progesterone , testosterone ,
estrone and estriol determination in human and animal body liquid.
Key words :D2antibody ELISA ; progesterone ; testosterone ; estrone ; estriol
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2002 ,16 (1) :45～48