全 文 ：文章编号 :100028551 (2008) 062766204
氮离子束注入诱变筛选万隆霉素高产菌株的研究
张晓勇1 　林壁润1 　高向阳2 　沈会芳1
(11 广东省农业科学院植物保护研究所 ,广东 广州　510640 ;
21 华南农业大学生命科学院 ,广东 广州　510642)
摘 　要 :为获得万隆霉素高产菌株 ,用氮离子束注入万隆霉素产生菌进行诱变处理 ,并用链霉素抗性筛选
法和抑菌圈筛选法进行突变株的筛选。结果表明 :通过能量为 20keV、剂量为 90 ×216 ×1013 N + Πcm2 的
氮离子束注入处理万隆霉素产生菌的分生孢子 ,筛选出万隆霉素高产菌株 WN939 ,其摇瓶发酵产素水
平较出发菌株提高了 82110 %。经 5 代传代培养 ,其产素水平稳定。
关键词 :氮离子束注入 ;万隆霉素产生菌 ;诱变 ;筛选
STUDY ON THE SCREENING OF HIGH2PRODUCING WANLONGMYCIN STRAIN
BY NITROGEN ION BEAM JMPLANTATION TECHNIQUE
ZHANG Xiao2yong1 　LIN Bi2run1 　GAO Xiang2yang2 　SHEN Hui2fang1
(11 Plant Protection Research Institute , Guangdong Academy of Agricultral Science , Guangdong , Guangzhou 　510640 ;
21 College of Life Science , South China Agricultural University , Guangdong , Guangzhou 　510642)
Abstract :In order to obtain a high2yield strain of wanlongmycin , the spores of wanlongmycin producing strain was mutated by
20 keV N + ions implantation with dose of 90 ×216 ×1013 N + Πcm2 implantation and streptomycin resistance screening and
inhibition zone method were applied to screen the mutants. The results showed a strain of high2yield of wanlongmycin was
obtained and named WN939. The yield of WN939 was about 82110 % higher than that of the original strain by flask
fermentation and rather stable through successive transfer of cultures.
Key words :nitrogen ion beam injection technique ; wanlongmycin producing strain ; mutagensis ; screening
收稿日期 :2008203217 　接受日期 :2008206203
基金项目 :国家自然科学基金 (30471161) ;中央级公益科研所基本科研业务费专项资金项目 ;广东省自然科学基金 (81510640001000010 ,04002077、
06025388)
作者简介 :张晓勇 (19782) ,男 ,江西泰和人 ,硕士研究生 ,研究方向为生物化学与分子生物学。1978zxy @1261com
通讯作者 :林壁润 (19632) ,男 ,广东揭阳人 ,研究员 ,从事农用抗生素的研制。Tel :020287597453 ; E2mail :linbr @1261com　　万隆霉素是由广东省农业科学院植物保护研究所筛选研制的一种新型抗生素 ,对植物病菌病害有很好的防治效果[1 ,2 ] 。万隆霉素产生菌是放线菌目(Actinomycetales)链霉菌科 (Streptomycetaceae) 链霉菌属(Streptomyces ) 中灰色变异链霉菌种 ( Streptomycesgriseovariabilis) 的一个亚种 ,将其命名为 Streptomycesgriseovariabilis subsp . Bandungensis subsp . nov. (灰色变异链霉菌万隆亚种) [3 ] 。因万隆霉素原始菌株产素水平较低 ,产素品质较差 ,生产成本较高 ,从而阻碍了其大规模生产的进程。因此诱变筛选万隆霉素高产菌株成为当前该研究工作的主要目标。然而 ,由于传统的 筛选方法是随机的、无方向性的 ,导致筛选工作量大 ,直接影响诱变育种的工作效率。根据抗生素产生菌抗性基因与抗生素合成基因以及调控基因紧密连锁而容易发生共突变的理论 ,利用链霉素抗性筛选法作为诱变育种的辅助筛选手段 ,可以大大增强育种的方向性 ,加快菌种选育进程 ,提高筛选效率[4 ] 。氮离子束注入技术 ,作为一种新的诱变方法 ,被越来越广泛应用[5 ,6 ] 。本研究第一次把氮离子束注入应用到万隆霉素产生菌的诱变育种上 ,并通过链霉素抗性筛选和抑菌圈法进行突变菌株的筛选 ,以期获得万隆霉素高产菌株。
667　 核 农 学 报　2008 ,22 (6) :766～769Journal of Nuclear Agricultural Sciences
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1 　材料与方法
111 　材料
11111 　菌种 　万隆霉素产生菌株 GAAS 2507 和枯草
芽孢杆菌 MIG1122 ( Bacillus subtilis) 均由广东省农业科
学院植物保护研究所提供。
11112 　培养基　万隆霉素产生菌和其突变菌株的固
体培养基 (高氏一号培养基) :可溶性淀粉 20gΠL、KNO3
1gΠL、K2 HPO4 015gΠL、NaCl 015gΠL、FeSO4 0101gΠL、
MgSO4·7H2O 0105gΠL、琼脂 15gΠL、蒸馏水 1000ml ,pH
712。
摇瓶发酵培养基 :葡萄糖 10gΠL、玉米浆 15gΠL、蛋
白胨 5gΠL、NaCl 5gΠL、CaCO3 5gΠL、(NH4 ) 2 SO4 5gΠL、蒸馏
水 1000ml ,pH712。
枯草芽孢杆菌固体培养基 :蛋白胨 3gΠL、葡萄糖
3gΠL、K2 HPO4 4gΠL、琼脂 15gΠL、蒸馏水 1000ml ,pH 712。
上述培养基均以 121 ℃高压灭菌 30min。
112 　方法
11211 　链霉素对万隆霉素产生菌的最小抑制浓度测
定
11211. 1 　孢子悬浮液制备 　万隆霉素产生菌斜面用
无菌生理盐水制成孢子悬浮液 ,脱脂棉过滤后调整孢
子浓度为 1 ×108 个Πml。
11211. 2 　最小抑制浓度测定 　孢子悬浮液用无菌生
理盐水适当稀释后 ,取 011ml 孢子稀释液涂布于含不
同浓度链霉素 (0、012、014、016、018、110 和 112μgΠml)
的高氏一号培养基平板上 ,每个浓度做 3 个平行试验。
观察菌落的生长情况 ,计算各处理的平均菌落数 ,确定
链霉素对万隆霉素产生菌的最小抑制浓度。
11212 　氮离子束注入剂量对万隆霉素产生菌存活率
和正突变率的影响
1121211 　氮离子诱变处理 　取 011ml 孢子悬浮于平
皿内 ,用涂布棒涂均匀 ,在无菌状态下吹干 ,使其形成
一层菌膜 ;然后 ,用氮离子束诱变处理 ,诱变能量为
20keV ,注入剂量分别为 30 ×216 ×1013 、50 ×216 ×
1013 、70 ×216 ×1013 、90 ×216 ×1013和 110 ×216 ×1013
N + Πcm2 。每个注入条件下都设 1 个真空对照。
1121212 　存活率的计算 　取经氮离子束注入处理的
菌膜 ,分别用 1ml 无菌生理盐水洗脱 ,并稀释至 104 ,取
011ml 涂布于高氏一号培养基平板上 ,每个注入剂量
下做 3 个平行试验 ,28 ℃培养 10d。观察菌落生长情况
并计算菌落个数 ,存活率 ( %) = (各诱变处理条件下平
板长出的菌落个数 ÷真空对照长出的菌落个数) ×
100 %。
1121213 　链霉素抗性与抑菌圈初步筛选、摇瓶复筛和
正突变率的计算 　取经氮离子束注入处理的菌膜 ,分
别用 1ml 无菌生理盐水洗脱 ,并稀释至 104 ,取 012ml
涂布于含最小抑制浓度的链霉素的高氏一号培养基平
板上 ,28 ℃培养 10d ,待生长出链霉素抗性突变株菌落
后 ,用打孔器打出单菌盘 (每个剂量处理随机挑选 100
株左右) ,用接种针挑取单菌盘放入含枯草芽孢杆菌的
固体培养基平板上 ,两单菌落之间的距离要足够大 ,以
免抑菌圈相互重叠。将平板于 37 ℃培养 12h 至菌落边
缘出现清晰的抑菌圈 ,将抑菌圈大 (大于对照菌株抑菌
圈)的单菌盘转接至试管斜面 ,28 ℃培养 10d。经链霉
素抗性及抑菌圈初步筛选出的菌株为初筛菌株 ,初筛
菌株通过摇瓶进行复筛 ,摇瓶产素水平高于出发菌株
产素水平 10 %的为正突变菌株 ,正突变率 ( %) = (正
突变菌株个数 ÷每个剂量处理后随机挑选的菌株个
数) ×100 %。
1121214 　摇瓶发酵方法 　取万隆霉素产生菌和其突
变菌株的孢子悬浮液 1ml (浓度为 1 ×108 个Πml) 接种
至装有 100ml 发酵培养基的 500ml 三角瓶中 , 32 ℃,
200rΠmin 震荡培养 5d。
11213 　典型突变菌株的考察 　在诱变效果较好的氮
离子注入剂量的基础上 ,考察诱变处理后的典型突变
菌株。并对培养皿中培养 10d 的典型菌株形态进行归
类 ,每一类型菌株取 50 株进行摇瓶发酵 ,然后计算每
一类型菌株摇培后产素水平的范围。
11214 　高产突变株产素稳定性 　将复筛出来的较高
产菌株接种于高氏一号培养基斜面做传代试验 ,传代
5 代 ,对每代菌株进行摇瓶发酵 ,测定摇瓶发酵后万隆
霉素的含量。分析比较传代前后产素能力的变化。
11215 　万隆霉素含量的测定　高效液相色谱法[7 ] ,含
量大于出发菌株 10 %的为正突变菌株。
2 　结果与讨论
211 　链霉素对万隆霉素产生菌的最小抑制浓度
链霉素对万隆霉素产生菌最小抑制浓度的测定结
果 (见表 1)表明 ,万隆霉素产生菌对链霉素非常敏感 ,
在含链霉素浓度为 110μgΠml 的培养基中生长即受到
抑制 ,其最小抑制浓度为 110μgΠml。
767　6 期 氮离子束注入诱变筛选万隆霉素高产菌株的研究
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表 1 　链霉素对万隆霉素产生菌最小抑制浓度的测定
Table 1 　The minimal inhibitory concentration of streptomycin to wanlongmycin producing strain
链霉素浓度
concentration of streptomycin (μgΠml) 0 012 014 016 018 110 112
平均菌落数
colony forming unit (CFU) 97 56 35 8 3 0 0
212 　氮离子束注入剂量对万隆霉素产生菌存活率和
正突变率的影响
本研究选择了氮离子束注入剂量为 30 ×216 ×
1013 、50 ×216 ×1013 、70 ×216 ×1013 、90 ×216 ×1013 和
110 ×216 ×1013 N + Πcm2 5 个梯度进行处理。从图 1 中
可以看出 ,当氮离子束注入剂量为 30 ×216 ×1013 N + Π
cm
2 时 , 万隆霉素产生菌的存活率迅速下降到
11111 % ,当剂量为 90 ×216 ×1013 N + Πcm2 时 ,其存活率
略有上升至 17195 % ,接着又下降到 6167 % ,对氮离子
束注入的“剂量 - 存活率”表现出典型的“马鞍”型曲
线。这与传统的物理诱变方式 ,如紫外线和 X 射线辐
照下的“剂量 - 存活率”直线型曲线明显不同 ,说明氮
离子注入与其他电离辐射的作用机制存在很大差
异[8 ] 。
对照图 1 ,从图 2 中可以看出氮离子注入剂量对
万隆霉素产生菌正突变率的影响 ,在“剂量 - 存活率”
曲线的较高位点 ,即氮离子束注入剂量为 90 ×216 ×
1013 N + Πcm2 时 ,万隆霉素产生菌的正突变率最高 ,达
到 39161 %。
图 1 　20keV N + 注入万隆霉素产生菌的存活曲线
Fig. 1 　Survival cure of Wanlongmycin producing strain
implantation with an energy 20keV treated by N+
213 　突变菌株菌落形态考察及其产素水平比较
本研究发现 ,氮离子束注入不但对万隆霉素产生
菌的产素水平有较大影响 ,而且对其诱变后的菌落形
态也有较大的影响。诱变剂量不同 ,诱变后菌落形态
的变化程度也不同 ,剂量为 90 ×216 ×1013 N + Πcm2 时 ,
图 2 　20keV N + 注入万隆霉素产生菌的正突变率
Fig. 2 　Plus mutation rate of wanlongmycin producing
strain treated by N + implantation with an energy 20keV
诱变后的菌落形态变化最大 ,有 5 种差异明显的菌落
形态 (图 3) 。从图 3 可以看出 ,出发菌株菌落较小 ,透
明上凸 ,表面光滑 ,不产色素 ,孢子较少 ;经过氮离子诱
变后的 A 型菌株菌落较大 ,草帽型 ,透明不产色素 ,不
产孢子 ;B 型菌株菌落大小一般 ,菌落扁平 ,表面粗糙 ,
产黄色色素 ,孢子较少 ;C型菌株菌落较大 ,白色上凸 ,
表面粗糙 ,不产色素 ,孢子较多 ;D 型菌株菌落较大 ,中
间上凸 ,菌落边缘白色中间黄色 ,表面粗糙 ,孢子较少 ;
E型菌株菌落较大 ,黄色上凸 ,表面粗糙 ,产黄色色素 ,
孢子较少。
图 3 　突变菌株菌落形态
Fig. 3 　The colony variation of mutant strains
by N + ion implantation (90 ×216 ×1013N + Πcm2 )
867 核　农　学　报 22 卷
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菌落形态使诱变筛选既直观又直接 ,若能将菌落
形态与突变菌株产素水平有效联系起来 ,则可在筛选
过程中获得更高的效率。本研究主要考察了氮离子注
入剂量为 90 ×216 ×1013 N + Πcm2 诱变后产生的 5 种菌
落形态差异明显的突变株的产素水平。从表 2 可以看
出 ,A、B、C型菌株经摇瓶发酵产素水平皆高于出发菌
株 ;其中 A 型菌株产素水平最高 ,在 A 型菌株中筛选
到 1 株较高产菌株 WN939 ,其摇瓶的产素水平达到了
271124μgΠml , 较 出 发 菌 株 摇 瓶 发 酵 产 素 水 平
(148195μgΠml)提高了 82110 %。而 D、E 型菌株摇瓶发
酵产素水平都比出发型菌株低。在突变菌株的 5 种类
型中 ,高产菌株 A 型与其他菌型明显不同的是该菌株
不产孢子 ,但其菌丝相对较多 ,其传代培养只能利用菌
丝进行 ,而其他菌型的传代则可直接刮取孢子进行培
养。
表 2 　不同类型的突变菌株产素水平比较
Table 2 　The wanlongmycin concentration in different
kinds of mutant strains
菌株型号
the kind of colony
万隆霉素含量
wanlongmycin concentration
(μgΠml)
出发型菌株 original strain 125167～148195
A 型菌株 kind A strain 162114～271124
B 型菌株 kind B strain 155168～238198
C型菌株 kind C strain 146126～196128
D 型菌株 kind D strain 105160～148112
E型菌株 kind E strain 67187～126135
214 　菌株 WN939 的稳定性
较高产菌株 WN939 的稳定性试验结果 (见表 3)表
明 ,经过 5 代传代后 ,菌株 WN939 摇瓶发酵的万隆霉
素含量在第 2、3 代时略有下降 ,但到第 4、5 代趋于稳
定 ,第 5 代摇瓶发酵的万隆霉素含量为239165μgΠml ,是
第一代产素水平的 88136 % ,表明该菌株遗传性能基
本趋于稳定。
表 3 　菌株 WN939 的遗传稳定性
Table 3 　The inheritance stability of strain WN939
传代数
generation
万隆霉素含量
wanlongmycin concentration
(μgΠml)
第一代 the first generation 271124 ±2114
第二代 the second generation 243152 ±1196
第三代 the third generation 226171 ±1178
第四代 the fourth generation 231148 ±2125
第五代 the fifth generation 239165 ±2110
3 　讨论
氮离子束注入抗生素产生菌诱变筛选高产菌株是
一种非常有效的诱变手段 ,近年来应用广泛[9 ] ,其“剂
量 - 存活率”曲线为马鞍型[10 ] 。它用于诱变育种是一
种集物理化学效应为一体的综合诱变技术 ,能引起染
色体的畸变 ,导致 DNA 链碱基的损伤、断裂 ,从而使遗
传物质在基因水平或分子水平上发生改变或缺失 ,大
幅度提高变异的频率[11 ] 。离子注入具有诱变谱广、变
异幅度大、正突变率高等特点[12 ] ,在微生物和植物诱
变育种中已经取得了很大的进展[12～16 ] ,其过程包括质
量沉积、动量传递、能量传递和电荷交换 ,这些过程几
乎是在 10 - 19 S～10 - 16 S 间同时完成的[17 ] 。
对于农用抗生素产生菌来说 ,大部分是由链霉菌
产生的 ,利用链霉菌产抗生素能力与链霉素抗性基因
之间的对应关系来定向筛选正向突变株是目前农用抗
生素科研领域的研究热点[18 ] ,链霉素抗性基因同抗生
素结构基因或调控基因可能存在着一定的连锁关系 ,
它可以快速、有效地获得理想高产突变株。
本研究将氮离子束诱变处理和链霉素抗性菌株筛
选结合起来 ,不但减少了筛选的工作量 ,而且增加了筛
选的效率 ,并成功地诱变筛选出了较原始菌株产素水
平高 82110 %的高产菌株 WN939 ;通过考察氮离子诱
变后突变菌株的菌落形态和产素水平的关系来确定今
后更深入研究的诱变筛选模式 ,该模式就是就是氮离
子束诱变处理万隆霉素产生菌 ,结合链霉素抗性菌株
和菌落形态筛选出高产菌株。其意义就在于该诱变筛
选模式的高效性和快速性 ,能为今后万隆霉素的工业
化生产提供高产稳定的菌株起一定的促进作用。
致谢 :本试验诱变处理是在中国科学院等离子束
物理研究所完成的 ,试验过程中得到吴跃进研究员及
其实验室所有老师和学生的大力支持与帮助 ,谨此感
谢。
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