全 文 ：文章编号 :100028551 (2008) 052585205
离子注入对雪松花粉粒萌发与花粉管生长的影响
黄群策1 　梁秋霞1 　李国平2
(1. 郑州大学河南省离子束生物工程重点实验室 ,河南 郑州　450052 ; 2. 莆田学院环境与生命科学系 ,福建 莆田　351100)
摘 　要 :用激光扫描共聚焦显微技术 (LSCM) 研究了低能离子注入对雪松花粉管萌发和生长的影响。结
果表明 ,低剂量 (1 ×1015 ionsΠcm2 )注入对雪松花粉粒萌发没有明显的影响 ;3 ×1015 ionsΠcm2 和 5 ×1015 ionsΠ
cm
2 离子注入可以刺激花粉粒萌发 ;高剂量 (等于或大于 7 ×1015 ionsΠcm2 ) 的离子注入会显著抑制花粉粒
萌发。离子注入对雪松花粉管的伸长和花粉管的形态特征有比较明显的影响 ,花粉管受到的损伤程度
与离子注入剂量有一定的相关性。
关键词 :雪松 ;花粉粒萌发 ;离子注入 ;损伤效应
EFFECTS OF ION BEAM IMPLANTATION ON POLLEN GERMINATION
AND POLLEN TUBE GROWTH OF Cedrus deodara
HUANG Qun2ce1 　LIANG Qiu2xia1 　LI Guo2ping2
(1. Provincial Key Laboratory of Ion Beam Bio2engineering , Zhengzhou University , Zhengzhou , Henan 450052 ;
2. Department of Environment and Life science , Putian University , Putian , Fujian 351100)
Abstract :Effects of ion beam implantation on pollen germination and pollen tube growth of Cedrus deodara were investigated
by the laser confocal microscopy technique (LSCM) . The results showed that the low dose ion implantation (1 ×1015 ionsΠcm2 )
did not affect the germination of the pollen. The doses of 3 ×1015 ionsΠcm2 and 5 ×1015 ionsΠcm2 implantation could
significantly promote the germination. But the high dose ion implantation (equal to or over 7 ×1015 ionsΠcm2 ) obviously
suppressed the pollen to germinate. The effects on elongation and morphological characters of the pollen tube caused by the ion
beam implantation were observed. The damage degree of the pollen tube increased with the increase of ion implantation dose.
Key words : Cedrus deodara ; pollen germination ; ion implantation ; damage effect
收稿日期 :2008201210 　接受日期 :2008204230
基金项目 :国家“十五”科技攻关项目 (2001BA302B)
作者简介 :黄群策 (19582) ,男 ,教授 ,博士 ,博士生导师 ,主要从事离子束生物技术的研究工作。Tel : 0371267766836 ; E2mail :quncehuang @zzu. edu. cn　　在辐射生物学研究中 ,细胞内 DNA 的损伤与修复是重要的研究内容 ,尤其是电离辐射所导致的 DNA 单链断裂和双链断裂是决定受照射细胞命运的关键因素之一。在低能离子束生物技术的实用性和对生物体遗传改良效果的普遍性已经被大量的试验结果所证实的基础上 ,迫切需要在细胞水平对离子注入后所导致的生物学效应进行更加深入的研究[1 ,2 ] 。已有的研究结果展示了离子束生物工程在未来的发展趋势 ,即由对个体所表现的生物学效应的研究为主逐步转向对群体、个体、细胞和分子等不同层次所表现的综合效应进 行深入研究[3 ,4 ] ,但由于试验材料的特异性、学科发展的阶段性和研究思路的局限性 ,前人在对低能离子注入所导致的生物学效应过程的研究中主要以生物个体(种子和植株)为材料 ,其研究结果的局限性相当明显 ,因为从种子萌发到成熟的个体发育过程涉及一系列细胞分裂和分化、组织和器官的分化和形成的生物学环节 ,离子注入后所导致的生物学效应有可能被放大或缩小。若以单细胞作为材料进行离子注入试验则可以更直接地观察到离子注入后所导致的生物学效应[5～10 ] 。由于低能离子与生物物质相互作用过程及其
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机理都相当复杂 ,迫切需要研究低能重离子对单细胞
DNA的直接损伤研究。前人曾分别以棉花[11 ,12 ] 、西
瓜[13 ]和黑松的花粉粒[14 ]为材料 ,对低能离子注入所导
致的生物学效应进行过一些探索性研究 ,其研究结果
对于进一步认识低能离子对单细胞的损伤效应有较大
的参考价值。
裸子植物中的雪松 ( Cedrus deodara) 为松科雪松
属 ,雌雄异株 ,原产于喜马拉雅山地区 ,是世界著名观
赏树 ,河南等地近年来有引种栽培 ,其花期为每年的
10 - 11 月份。雪松花粉粒具有较大的个体 ,且容易进
行人工培养 ,其携带的 2 个细胞核较大 ,在离体条件下
存活时间较长 ,是研究离子束生物效应的良好材料。
雪松发生传粉后 ,花粉粒在其珠心室萌发。在萌发时
花粉粒内壁自萌发孔处向外延伸后形成花粉管。花粉
管输送精子至胚囊内 ,精子与卵细胞融合后完成受精
作用。本试验以雪松花粉粒为试验材料 ,利用不同的
低能离子注入剂量和激光扫描共聚焦显微技术 ,研究
了低能离子注入对雪松花粉粒萌发和花粉管生长的影
响 ,试图从花粉粒萌发力和花粉管形态特征等方面揭
示低能离子注入对花粉粒的损伤效应。
1 　材料与方法
111 　供试材料
本试验中所采用的雪松成熟花粉粒取自郑州大学
校园内。取材后将其保存于 - 20 ℃条件下备用。
112 　离子注入处理
离子注入试验在本实验室进口的俄罗斯产 TITAN
离子注入机上进行。进行离子注入前 ,将待处理的花
粉粒均匀地撒布在涂有少量胶水的培养皿表面 ,将培
养皿放入真空小靶室内 ,表面与离子束发射方向垂直。
注入的氮离子能量为 30keV ,设置 8 种剂量 ,即 1 ×
1015 、3 ×1015 、5 ×1015 、7 ×1015 、9 ×1015 、11 ×1015 、13 ×
1015和 15 ×1015 ionsΠcm2 。离子注入机的真空度为 5 ×
10 - 2 Pa , 采用脉冲注入 (频率 25Hz) 方式 , 束流为
200mA。以花粉粒同样撒布在涂有少量胶水的培养皿
表面而无其他离子注入处理的材料作为非真空处理的
对照 (即 0 ×1015 ionsΠcm2 ) 。
113 　培养条件
雪松花粉粒的培养主要采用液体培养基 ,其组成
成分主要是 0101 %硼酸 + 0101 %氯化钙 + 0125 %蔗
糖。在 28 ℃±1 ℃条件下对雪松花粉粒进行 60h 的振
荡培养。除此之外 ,在培养基中添加 1000μmolΠL 秋水
仙素 ,培养条件同上 ,以便观察秋水仙素对雪松花粉粒
萌发的影响。
114 　观察与统计
经过 60h 的振荡培养后 ,在显微镜下统计雪松花
粉粒的萌发率 ,在上述试验的各个处理中随机观察 5
～10 个视野 ,所统计的花粉粒数目不少于 300 粒。以
花粉管超过花粉粒直径作为花粉粒萌发的标准[14 ] 。
萌发率 ( %) = (萌发花粉粒数Π一个视野中花粉粒
的总数) ×100 %。
对花粉管形态特征的测量是在显微镜下利用目镜
测微尺测量花粉管的长度与花粉管直径。在上述试验
的各个处理中随机观测至少 25 枚花粉管 ,重复 3 次。
自花粉粒萌发孔至花粉管顶端作为花粉管长度 ;花粉
管中部的直径作为花粉管直径 (宽度) ;花粉管顶端部
分的直径大于花粉管直径一半以上视为花粉管顶端肿
大。应用 SPSS 统计软件对试验数据进行统计分析。
115 　扫描与制图
利用配置有 Leica DMIRE2 研究型电动倒置显微
镜的 Leica TCS2SP2 型激光扫描共聚焦显微镜 ( laser
scanning confocal microscope , LSCM) 观察鉴定花粉粒和
花粉管形态结构特征。其操作程序 :经离心处理后收
集已萌发的花粉粒 ,利用 4 %戊二醛溶液对其固定 2h ,
利用 PBS 缓冲液 (pH 值 712) 清洗 3 次 ,再用 10μgΠml
DAPI(4′, 62diamidino222phenylindole , Sigma 产品 ) ( TAN
缓冲液配制)染色 ,直接制成临时玻片供观察。以不进
行荧光染色的材料作为对照。
将制备好的载玻片倒放在显微镜上 ,利用 20 倍和
40 倍镜头选取所需观察对象。启动 LSC 软件 (Leica
Confocal Software) ,选择光路参数 (Bean) : Scan Mode =
xyz ;Scan Format = 512 ×512 或 1024 ×1024 ; Scan Speed
= 400Hz ; Bean Exp = 6 ; Pinhole = 1 ; Scan Direction =
Uni。分别利用 UV 激光器、ArΠArKr 激光器的激光作为
光源进行预扫描处理。UV 激光器激发波长为 405nm ,
检测发射光波长为 410～550nm。ArΠArKr 激光器激发
波长为 488nm ,激发值为 80 %～100 % ,检测发射光波
长为 492～632nm ,伪彩色均采用绿色。在试验中分别
调整 PMT、Zoom 和 Position 数值的大小 ,直至获取高质
量的图像。通过单次扫描 ( Single scan) 和连续扫描
(Series scan)方式进行图像采集。连续扫描时 ,调节光
切片步距参数、初始切片位和终止切片位 ,对所需观察
区域进行连续光切片。利用 LCS 操作系统中 View、
3d、Process、Quantify 程序 ,对所取系列光切片进行动态
图像显示、三维重建和图像分析等处理 ,选取部分图像
制成图版。
685 核　农　学　报 22 卷
2 　结果与分析
211 　不同剂量离子注入对花粉粒萌发的影响
通过对观察鉴定结果进行比较分析后可以看出 ,
低能氮离子注入对雪松花粉粒萌发和花粉管生长有一
定的效应 ,但其效应的明显程度与离子注入的剂量密
切相关。如图 1 所示 ,真空处理对雪松花粉粒萌发没
有明显的影响 (即经过真空处理的雪松花粉粒和没有
经过真空处理的雪松花粉粒的萌发率均为 75 %左右 ,
没有表现出统计学上的差异 , p > 0105) ,这说明真空处
理对雪松花粉粒的萌发没有明显的效应。然而 ,经过
氮离子注入处理后花粉粒的萌发状态产生了很大的变
化。在不同离子注入剂量下 ,雪松花粉粒的正常萌发
状态所受到的影响明显不同。当离子注入剂量为 0 ×
105 ionsΠcm2 时 ,花粉粒的平均萌发率为 74167 % ±
1147 % ;剂量为 1 ×1015 ionsΠcm2 时的花粉粒萌发率与
对照组的萌发率没有显著差异 ( p > 0105) 。随着离子
注入剂量的增加 ,花粉粒的萌发状态受到显著影响 ( p
< 0105) ,当剂量分别为 3 ×1015 ionsΠcm2 和 5 ×1015 ionsΠ
cm
2 时 ,离子注入显著促进花粉粒的萌发 ,3 次重复的
花粉粒平均萌发率分别为 80 %和 85 %。当剂量达到 7
×1015 ionsΠcm2 时的花粉粒萌发率较对照表现为显著
下降 ;而注入剂量高达 15 ×1015 ionsΠcm2 时则导致大部
分花粉粒失去活力 ,仅有 1 %可以萌发。由此可见 ,低
剂量 (1 ×1015 ionsΠcm2 ) 的离子注入对雪松花粉粒萌发
没有影响 ,在一定剂量 (3 ×1015 ionsΠcm2 和 5 ×1015 ionsΠ
cm
2)时离子注入可以刺激花粉粒萌发 ,而高剂量 ( ≥7
×1015 ionsΠcm2 )的离子注入则显著抑制花粉粒萌发。
图 1 　离子注入对雪松花粉粒萌发的影响
Fig. 1 　The effect of ion implantation on pollen
germination of Cedrus deodara
212 　不同剂量离子注入对花粉管生长的影响
从植物学结构特征来看 ,雪松的花粉粒原来包含
着 5 个细胞 ,由于 2 个原叶细胞在花粉粒发育过程中
退化消失或仅残留线状结构 ,因而在其成熟的花粉粒
内只可以见到 3 个细胞 ,即柄细胞、体细胞和管细胞
(图 221 ,222) 。观察鉴定结果表明 ,对照的花粉粒在萌
发后所形成的花粉管比较细长 ,其直径大致相等 ,约为
2617μm(图 223) 。在萌发后管细胞核优先进入花粉管
内 ,而体细胞和柄细胞尚留在花粉粒内 (图 224) 。离子
注入后 ,花粉管的生长状态因注入剂量不同而表现不
同。真空处理和低剂量 (1 ×1015 ionsΠcm2 和 3 ×1015
ionsΠcm2 )的离子注入对花粉管的形态结构无显著损伤
(图 225) 。但与对照相比 ,低能离子注入对雪松花粉管
的伸长和花粉管的形态特征有比较明显的影响 ( p <
0105) ,并且花粉管受到的损伤程度与离子注入剂量有
一定的相关性。当离子注入剂量为 5 ×1015 ionsΠcm2
时 ,花粉管平均直径 (3714μm) 显著大于对照花粉管的
直径 (2617μm) (图 226) ,且有少数花粉粒伸出两条花粉
管 (图 321) ,在被观察的 310 枚花粉粒中有 21 枚花粉
粒表现出这种异常的生物学现象 ,异常率为 6177 %。
离子注入剂量为 7 ×1015 ionsΠcm2 和 9 ×1015 ionsΠcm2 时 ,
分别有约 20 %和 24 %的花粉管出现顶端肿胀现象 (图
322 ,323) 。离子注入剂量大于 7 ×1015 ionsΠcm2 时 ,对花
粉粒的损伤程度比较严重 ,如在剂量为 9 ×1015 ionsΠcm2
的处理中可以观察到一些花粉粒的管细胞受到比较大
的破坏 (图 324) , 其异常率高达 14189 %。在离子注入
剂量为 11 ×1015 ionsΠcm2 的处理中 ,花粉管的伸长受到
显著的抑制 ,花粉管内细胞原生质体有“漏出”花粉粒
的趋势 (图 325 ,图 326) , 其异常率高达 10151 %。当离
子注入剂量为 15 ×1015 ionsΠcm2 时 ,大部分花粉粒的结
构受到损坏或破裂 ,花粉粒的萌发力很低。
3 　讨论
Ren Haiyun 等曾报道 ,低能离子注入会促进百合
花粉粒的萌发 ,并认为其促进作用与离子注入后改变
花粉粒内微丝骨架的排列密切相关 [15 ] 。Zelles 和
Seibold 曾报道 ,X 射线、γ射线和 UV 紫外线辐照会促
进 Pinus silvestris 花粉粒的萌发 ,认为辐照激活了与萌
发有关的蛋白质和核酸物质[16 ] 。
在离子束生物工程的发展初期 ,离子注入所导致
的“马鞍型”剂量效应曲线已经引起了研究者的关注。
“马鞍型”剂量效应所涉及到的生物体性状主要有植物
　　　
785　5 期 离子注入对雪松花粉粒萌发与花粉管生长的影响
图 2 　雪松花粉粒与花粉管的 LSCM图像
Fig. 2 　LSCM images of the structure and morphology of Cedrus deodara. pollen and pollen tube
221 :成熟花粉粒 ; 222 : TN 为管细胞核 ,BN 为体细胞核 ,SN 为柄细胞核 ; 223 :正常生长的雪松花粉管 ;
224 :花粉管中 3 个细胞核的位置 ; 225 :低剂量 N + 离子注入处理 ;226 :5 ×1015ionsΠcm2 的剂量处理
221 :Mature pollen ; 222 : TN means nucleus of tube cell , BN means nucleus of body cell , SN means nucleus of stalk cell ; 223 Normal pollen tubes ;
224 : The place of three nuclei in one pollen tube ; 225 : N + implantation with low dose ; 226 : Implantation at dose of 5 ×10 15ionsΠcm2
图 3 　雪松异常花粉与花粉管 LSCM图像
Fig. 3 　LSCM images of abnormal Cedrus deodara. pollen and pollen tube
321 :5 ×1015ionsΠcm2 的剂量处理 ; 322 :7 ×1015ionsΠcm2 的剂量处理 ;323 ,324 :9 ×1015ionsΠcm2 的剂量处理 ;325 ,326 :11 ×1015ionsΠcm2 的剂量处理
321 : Treatment at dose of 5 ×1015ionsΠcm2 ; 322 : Treatment at dose of 7 ×1015ionsΠcm2 ; 323、324 :Treatment at the dose of
9 ×1015ionsΠcm2 ;325、326 :Treatments at the dose of 11 ×1015ionsΠcm2
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种子萌发率、DNA 单双链断裂和酶活性等[17 ] ,也有文
献分析了“马鞍型”曲线的产生原因[18 ] 。在本研究中 ,
虽然离子注入雪松花粉粒的效应曲线没有呈现出“马
鞍型”状态 ,但也存在着明显的“鞍点”,即当离子注入
剂量为 5 ×1015 ionsΠcm2 时所表现的花粉粒萌发状态。
基于这一观察结果 ,我们推测 ,在离子注入剂量效应曲
线中“鞍点”的产生主要归因于注入离子后细胞内的电
子阻止效应、细胞核阻止效应以及花粉粒内损伤与生
化修复机制的综合作用。根据现有的研究资料 ,在生
物体细胞内和组织中存在着特定的防御机制 ,特别是
当生物体处于不利于生长发育的逆境条件时其自我保
护功能就会显现出来[19 ] 。
本研究的结果表明 ,离子注入对雪松花粉管的生
长和花粉管形态特征有比较大的影响。从花粉管的生
长速率和花粉管畸形状态来看 ,离子注入对花粉管的
生长有明显的效应 ,即在一定生长时间内花粉管平均
长度显著低于对照组的平均长度 ;离子注入损伤花粉
粒还表现在引起花粉管畸形 ,主要是花粉管变宽和
(或)花粉管顶端肿胀。虽然在雪松花粉内包含有多个
细胞 ,但花粉粒萌发后所形成的花粉管是 1 个细胞 ,所
以 ,本研究结果在细胞水平上揭示了离子注入对植物
细胞的损伤效应。
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