全 文 ：文章编号 :100028551 (2007) 012048204
辐照对农产品中细菌 ATP 生物发光检测的干扰
高　岳1 　冯　敏2 　王泽港1 　吕海燕1 　马　飞1
史宙亮1 　葛才林1 　罗时石1
(11 扬州大学江苏省遗传生理重点实验室 ,江苏 扬州　225009 ; 21 江苏省农业科学院原子能所 ,江苏 南京　200014)
摘 　要 :ATP 生物发光技术已广泛应用于样品含菌量的快速检测 ,但在应用该方法检测农产品的辐照灭
菌效果时却出现了发光强度均高于对照的现象。本文分别从γ射线对 ATP 的影响、发光动力学以及发
光强度增高的途径等方面对上述现象进行了研究。结果表明 ,发光强度的增加并非由 ATP 所造成引起
的 ,而是由农产品中含有的细菌经辐照后引起的 ;干扰荧光素 —荧光素酶制品中存在的能引起光辐射的
物质是形成干扰的另一方面的原因。
关键词 :辐照 ;灭菌效果检测 ;ATP 生物发光 ;干扰
A PRELIMINARY STUDY OF IRRADIATION DISTURBANCE ON THE
RAPID BACTERIA ASSAY WITH ATP BIOLUMINESCENCE
TECHNIQUE FOR AGRICULTURAL PRODUCTS
GAO Yue1 　FENG Min2 　WANG Ze2gang1 　LU Hai2yan1 　MA Fei1
SHI Zhou2liang1 　GE Cai2lin1 　LUO Shi2shi1
(11 Key Laboratory of Crop Genetics and Physiology of Jiangsu Province , Yangzhou , Jiangsu 　225009 ;
21 Institute of Atomic Energy , Jiangsu Academy of Agricultural Science , Nanjing ,Jiangsu 　210014)
Abstract :ATP bioluminescence technique has been widely used as a rapid method for detection of bacteria in sample ,
however , such a phenomenon that ATP bioluminescence value of irradiated sample was higher than that of control was
observed. In order to make the phenomenon clear , effect ofγ2ray irradiation on ATP , kinetics of luminescence and possible
luminescence intensity increasing pathway were investigated. The results show that the increase of luminescence in irradiated
food was not caused by ATP , is caused by the influence of the irradiated bacteria in sample ; and probably by some materials
that cause the light irradiation in luciferin2luciferase compound.
Key words :irradiation ; sterilization determination ; ATP bioluminescence ; disturbance
收稿日期 :2006203221
作者简介 :高岳 (19792) ,男 ,江苏苏州人 ,生物物理学硕士研究生 ,E2mail :gary1979 @1631com
通讯作者 :罗时石 (19492) ,男 ,江苏镇江人 ,教授 ,从事生物物理学方面的研究 ,E2mail :luoss @yzcn. net　　对辐照产品进行有效的质量跟踪是良好辐照规范( GIP)的主要特点[1 ] 。菌检是农产品、食品辐照灭菌过程中一个重要的环节 ,但目前常规的细菌学检验方法需时较长 ,已成为对产品卫生质量进行及时检验的一个制约因素 ,提供一种准确快速检验辐射灭菌效果的方法已成为辐照加工行业迫切需要解决的问题。ATP 生物发光技术已广泛应用于样品含菌量的快 速检测[2 ] ,卫生部卫监督发 (2005) 第 76 号文件已明确规定各级卫生监督机构在现场快速检测设备中 ,都应配备 ATP 发光检测仪。作者曾应用 ATP 生物发光技术检测辐照前脱水蔬菜和调味品中的含菌量 ,从取样到获取结果仅需 1～2h ,且与常规菌检的方法呈显著正相关[3 ] 。但在应用该方法检测农产品的辐照灭菌效果时 ,却出现了测试辐照后样品的数据高于对照的反
84　 核 农 学 报　2006 ,21 (1) :48～51Journal of Nuclear Agricultural Sciences
常现象。查阅有关资料 ,尚未见这方面的报道。为了
使该技术在检验辐照灭菌效果方面得以应用 ,本文报
道了对上述现象的初步研究结果。
1 　材料与方法
111 　供试材料
供试材料脱水香葱粉 (dry shallot powder) 、胡椒粉
(pepper) 由江苏省兴化市新益食品厂提供。荧光素、
荧光素酶及 ATP 标样均购自中国科学院上海植物生
理研究所。
112 　样品的辐照处理
样品的辐照处理在扬州大学辐照中心进行 ,辐照
剂量率 30GyΠmin ,每处理 3 次重复。
113 　样品中细菌 ATP的提取及测定
11311 　样品中非细菌 ATP 的清除　称取样品各 015g ,
脱水香葱按 1 :20 (mΠv) 、调味品按 1∶10 (mΠv) 的比例加
入 Tris2EDTA (20mmolΠL Tris + 2mmolΠL EDTA ,pH7175)
充分混匀、匀浆 ,加入等体积的 012 %Triton X2100 和
0115 %Apyrase 混合液 ,室温下放置 10min。
11312 　样品中细菌 ATP 的提取 　将已清除非细菌
ATP 的匀浆液在沸水浴煮沸 90s ,冰浴中冷却后立即离
心 3min ,备用于 ATP 分析。
11313 　ATP 的生物发光测定 　采用 SHG—D 生物化
学发光仪测量发光强度。测定室温 30 ℃,测量时间设
定为 6s。所有样品放入测量室后均暗适应 10min 再进
行测量。
11314 　样品 ATP 的紫外分光光度计测定 　ATP 对
260nm 波长的紫外线有最大吸收 ,吸光值越大则表示
测样中 ATP 的含量越高。参照陈钧辉等的方法[4 ] ,将
样品细菌 ATP 的提取液分别倒入石英比色杯中 ,用紫
外分光光度计 (美国 PE 公司) 测试各处理管的吸光度
(A260 ) 。
114 　电离辐射对 ATP标样生物发光的影响
将稀释后的 ATP 标样分装于试管中 ,按 0、215、
510、715 和 1010kGy 等剂量进行辐照处理 ,用荧光素 —
荧光素酶测定样品的发光强度。
115 　辐照脱水香葱粉对 ATP生物发光的影响
取经γ射线辐照处理后存放半年、并经检验无菌
的香葱粉 ,分置于包装袋中 ,按 0、215、510、715 和
1010kGy 等剂量进行辐照处理 ,再按 1∶1 分别加入等量
未进行灭菌的脱水香葱粉 ,混匀后提取样品细菌的
ATP 并应用生物发光法进行测定。
2 　结果与分析
211 　辐照农产品对细菌 ATP生物发光强度的影响
从表 1 可以看出 ,在应用 ATP 生物发光技术检验
农产品的辐照灭菌效果时 ,辐照处理样品细菌提取液
的发光强度均高于对照 ,与实际的活菌数 (CFU) 不一
致 ,这种现象在脱水香葱与调味品中均存在 ;三氯醋
酸、热水等也常用于细菌 ATP 的提取[8 ] ,换用此方法 ,
上述现象依旧出现 ;通过对辐照后农产品的连续跟踪
测定 ,我们发现这一现象具有较长的时效性可持续达
50d 左右。
表 1 　辐照农产品对细菌 ATP生物发光的影响
Table 1 　Effect of irradiated sample on determination of ATP bioluminescence in bacteria
样品名称
sample
测试项目
determination items
辐照处理剂量 irradiation dose (kGy)
0 210 410 610 810
脱水香葱粉 发光强度 lminous intensity(RLU) 2381 ±89 3470 ±97 4502 ±111 4489 ±93 3775 ±89
dehydrated shallot powder 菌落总数 total colony(CFUΠg) 360000 27030 1850 100 < 30
胡椒粉 发光强度 lminous intensity(RLU) 2889 ±103 3667 ±123 4718 ±77 4478 ±91 3879 ±56
Pepper powder 菌落总数 total colony(CFUΠg) 430000 39000 2580 150 < 30
　　压力蒸气灭菌是目前常用的灭菌方法 ,经高压蒸
气灭菌后样品的发光值与实际的含菌量仍保持着良好
的线性关系[5 ] ;在应用 ATP 生物发光技术快速测定细
菌的药物敏感性时 ,细菌 ATP 提取物的发光值也与该
菌液活菌数 (CFU) 显著相关[6 ] 。综上所述 ,与压力蒸
气、药物灭菌有所不同 ,辐照处理已对样品细菌 ATP
生物发光的检测过程产生了影响。
212 　辐照农产品细菌 ATP生物发光过程的动力学分
析
对 ATP 生物发光过程进行动力学分析 ,将有助于
了解辐照农产品对细菌 ATP 生物发光测定过程的影
响程度。细菌 ATP 提取液的样品在加入荧光素 —荧
光素酶后极短的时间内 ,其发光值将达到最大 ,以后逐
渐减弱 ,符合于 A = A0 e - kt 。对上式直线化处理后可得
94　1 期 辐照对农产品中细菌 ATP 生物发光检测的干扰
到 lnA = ln A0 - kt ,若设 Y = lnA , Y0 = ln A0 ,则可得到
直线方程 Y= Y0 - kt , Y0 表示直线在 Y轴上的截距 ,k
表示发光强度衰减的速率常数。为了尽可能细微地反
映出发光曲线的动态变化 ,我们将测量时间定为 3s ,
每一样品连续测量 6 次 ,结果见表 2。
表 2 　辐照对农产品中细菌 ATP生物发光影响的动力学分析
Table 2 　Kinetics analysis for effect of irradiated sample on ATP bioluminescence of bacteria
辐照剂量
irradiation dose (kGy)
测量时间 determination time (s)
0 3 6 9 12 15
回归分析
regression analysis
Y= Y0 - kt (RLU)
0 7170 ±3105 7113 ±2139 6165 ±2118 5195 ±2178 5117 ±2115 4175 ±1137 Y= 7175 - 01203t
215 8110 ±3127 7130 ±2175 6180 ±2127 5161 ±2189 5113 ±2155 4123 ±1111 Y= 8113 - 01257t
510 8149 ±3145 7169 ±3113 7101 ±1198 6133 ±2131 5161 ±1178 4194 ±1134 Y= 8144 - 01235t
715 8115 ±3167 7140 ±3117 6147 ±2133 5168 ±2145 4191 ±1195 4113 ±1145 Y= 8121 - 01272t
10 8105 ±3141 7116 ±2169 6127 ±2142 5151 ±2178 4153 ±1187 3181 ±1155 Y= 8102 - 01280t
注 :表中数据为实际发光测量值的自然对数值。
Note : the data in table is the natural logic value of measured luminescence value.
　　从表 2 可以看出 ,辐照处理后样品的 Y0 均高于对
照样品 ,经统计分析显示 ,处理与对照之间的 Y0 值均
达到显著差异。处理样品的 k 值都比未辐照的样品
大 ,说明辐照处理后样品的发光值衰减得较快。
213 　辐照处理对细菌 ATP的影响
ATP 生物发光技术完全依赖于荧光素 —荧光素酶
对 ATP 测定的高灵敏度和高特异性。依据 ATP 生物
发光原理[2 ] ,发光强度的变化与 ATP 有关 ,所以辐照
后农产品发光强度的增加可能是由于γ射线对细菌体
内的 ATP 产生影响造成的。
图 1 　紫外分光光度计对样品中 ATP含量的检测结果
Fig. 1 　ATP content in sample determined with
UV2spectrophotometer
试用紫外分光光度计检测辐照脱水香葱样品中细
菌 ATP 的动态变化 ,尽管测量结果的灵敏度较差 ,但
图 1 结果表明辐照处理并未增加样品中 ATP 的含量。
电离辐射产生的直接和间接作用 ,常会使物质分子发
生激发和电离[7 ] 。但电离辐射能否使 ATP 分子激发
和电离并由此引起发光强度的升高 ,目前尚无该方面
图 2 　γ射线辐照对 ATP标样生物发光的影响
Fig. 2 　Effect ofγ2ray irradiation on bioluminescence
of standard ATP
的报道。对 ATP 标样溶液进行辐照处理 ,测定样品的
发光强度 ,由图 2 可以看出 ,γ射线的辐照处理也并未
增加 ATP 生物发光的强度。通过上面的试验可以认
定 ,在细菌 ATP 生物发光过程中发光强度的增加并非
ATP 所造成 ,而是由其他途径的干扰所致。
214 　辐照农产品对细菌 ATP 生物发光过程的干扰来
源研究
脱水香葱、调味品及其所含有的细菌均是γ射线
照射的对象 ,辐照后都有可能对 ATP 生物发光的过程
产生干扰 ,分别研究它们对 ATP 生物发光过程的影
响 ,将有助于进一步探明干扰的形成机理。
对无菌脱水香葱粉进行辐照处理 ,并测试其对
ATP生物发光的影响 ,结果见图 3 ,经统计分析 ,各处
理之间并无显著差异 ,说明干扰的产生与脱水香葱粉
的辐照与否无关。
用 5 %生理盐水洗脱未经灭菌处理的脱水香葱粉
的细菌 ,将菌液置于 25 ℃培养箱中培养 3d 后进行辐
05 核　农　学　报 21 卷
照处理 ,对细菌的 ATP 提取液进行生物发光测定 ,其
测试结果却出现了如图 4 所示的变化 ,即辐照样品的
发光强度大大高于对照 ,且在 4kGy 时达到最大值。以
上的研究结果表明 ,在细菌 ATP 生物发光过程中的干
扰可能是由细菌辐照后引起的。
图 3 　辐照脱水香葱粉对 ATP生物发光的影响
Fig. 3 　Effect of irradiated dehydrated shallot powder on
ATP bioluminescence
图 4 　辐照细菌对 ATP生物发光的影响
Fig. 4 　Effect of irradiated bacteria on ATP
bioluminescence
215 　荧光素酶反应液与干扰的形成分析
以测试样品在未加入荧光素 —荧光素酶反应液时
的发光值为本底计数 ,我们测试了所有样品的本底值 ,
发现样品的本底计数均较低 ,而荧光素 —荧光素酶的
　　　
加入导致了干扰的出现。生物发光源于化学机制 ,依
据荧光素 —荧光素酶对 ATP 测定的特异性分析 ,在荧
光素 —荧光素酶反应液中还存在能引起光辐射的其他
物质 ,这些物质是形成干扰的另一个原因。目前市售
的荧光素酶多为粗酶制品 ,李立人就曾报道荧光素 —
荧光素酶制品中的肌酸激酶对 ATP 生物发光的影
响[8 ] ,这也可能是引起结果异常的原因。
3 　小结与讨论
ATP 生物发光技术已在细菌的快速检测方面得到
了广泛应用 ,但我们在应用该技术检测农产品的辐照
灭菌效果时 ,却出现了发光强度超过对照、发光强度与
实际含菌量不一致的现象。本研究结果表明 ,发光强
度的升高并非由细菌中的 ATP 所造成 ,而是来自于其
他途径的干扰。辐照后产品中的细菌是引起干扰的主
要原因 ;荧光素酶制品中存在的可引起光辐射的其他
物质 ,可能是形成干扰的另一方面的原因。
本研究目前还处于初步阶段 ,有关辐照农产品对
ATP 生物发光过程干扰的机理 ,以及如何消除干扰等
方面尚有待于进一步研究。
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