全 文 ：文章编号 :100028551 (2007) 042413204
仿刺参体腔液补体类似物化学发光免疫检测
张　峰1 　王海峰1 　宫　晶1 　常少杰2
(11 大连水产学院生命科学与技术学院 ,辽宁 大连　116023 ; 21 大连市轻工业学校 ,辽宁 大连　116023)
摘 　要 :首次应用酶联化学发光免疫检测 (Chemiluminesent Immunoassay ,CLIA) 技术测定仿刺参体腔液补
体类似物 AjC3 和 AjC4。羊抗人 C3、C4 抗体吸附到经过紫外线处理的聚苯乙烯管内 ,采用辣根过氧化
物酶 (HRP)标记抗体。过氧化氢和鲁米诺为辣根过氧化物酶的底物。捕获抗体包被最适浓度为 1μgΠ
ml ,免疫反应 20 ℃孵育 2h 达到平衡。HRP2IgC3、IgC4 抗体复合物适宜稀释度为 1 :2000 ,HRP2IgC3、IgC4
抗体复合物 4 ℃下保存 8d 性能稳定 ,室温下 5d 内性能稳定。标准品浓度在 011～10ngΠml 范围内时与化
学发光值之间具有良好的线性相关性 ,检测灵敏度为 011ngΠml。结果表明应用酶联化学发光免疫检测
技术能够检测到仿刺参体腔液中含有补体类似物 ,AjC3 含量为 6158 ±114μgΠml ,AjC4 含量为 0167 ±
013μgΠml。
关键词 :仿刺参 ;体腔液 ;补体类似物 AjC3、AjC4 ;化学发光免疫检测
DETECTION METHOD OF COMPLEMENT ANALOGUES OF COELOMIC FLUID IN
Apostichopus japonicus BY CHEMILUMINESCENT IMMUNOASSAY
ZHANG Feng1 　WANG Hai2feng1 　GONGJing1 　CHANG Shao2jie2
(11Life Science and Technology Department of Dalian Fisheries University , Dalian , Liaoning 　116023 ;
21 Dalian Light Industry School , Dalian , Liaoning 　116023)
Abstract :A highly sensitive and specific chemiluminescent immunoassay ( CLIA) method was developed for quantitative
detection of complement analogues , AjC3 and AjC4 in Apostichopus japonicus . Sheep anti2human C3 , C4 antibodies were
absorbed inside of polystrene tubes which were treated with ultraviolet . The antibodies were labeled with horseradish peroxidase
( HRP) . Luminol solution and H2O2 were used as the substrate of HRP. The most optimum concentration of antibody coated in
the polystyrene tubes was 1μgΠml. The optimum dilution level of HRP2anti2IgC3 and HRP2anti2IgC4 was 1∶20001 The good
stabilities of HRP2anti2IgC3 and HRP2anti2IgC4 were monitored at 4 ℃during 8 days and at room temperature during 5 days.
The immunoreaction reaches equilibrium after 2h of incubation at 20 ℃. The detection range of the method was 011～10ngΠml
and it displayed good linearity. The sensitivity of the method can be used to detect AjC3 and AjC4 concentrations as low as
011ngΠml. The results showed that the complement analogues , AjC3 and AjC4 in Apostichopus japonicus could be detected by
the method ,and the content of AjC3 was 6158 ±114μgΠml ,and AjC4 was 0167 ±013μgΠml1
Key words : Apostichopus japonicus ; coelomic fluid ; complement analogues AjC3 , AjC4 ; chemiluminescent immunoassay
(CLIA)
收稿日期 :2006210202
基金项目 :国家自然科学基金项目 (30471323)
作者简介 :张　峰 (19572) ,男 ,大连人 ,博士 ,教授 ,从事动物免疫学方面的研究。E2mail :Fengz57 @gmail . com　　近年来 ,化学发光免疫检测技术因具有灵敏度高、专一性强 ,检测时间短及无放射性污染等优点被迅速 应用到检测激素、抗体、DNA、RNA 等生物和医学研究领域。补体系统是动物体内免疫防御反应的重要组
314　核 农 学 报　2007 ,21 (4) :413～416Journal of Nuclear Agricultural Sciences
分 ,在免疫防御、免疫调控以及免疫病理中发挥重要作
用。研究证明无脊椎动物尤其是棘皮动物具有类似脊
椎动物补体系统的免疫机制。Berthuessen、Berthuessen
和 Seljelid 等 研 究 发 现 海 胆 ( Strongylocentrotus
purpuratus)体内存在补体类似物 ,并证实在海胆体腔细
胞存在着保守的 C3b ,C3bi 补体受体[1～3 ] 。Leonard 研
究 A . forbesi 的体腔液溶血活性时 ,发现一种补体样系
统在棘皮动物免疫反应中发挥作用[4 ] 。Smith 等首次
鉴定出海胆补体类似物 SpC3 和 SpBf ,证实棘皮动物的
SpC3 有 2719 %的氨基酸序列与人类 C3 相同[6 ] 。仿刺
参 ( Apostichopus japonicus)属于棘皮动物 ,是目前我国北
方沿海重要的养殖品种 ,近年来刺参养殖病害发生频
繁 ,造成巨大经济损失 ,因此开展研究仿刺参免疫机制
尤为重要。目前应用化学发光免疫测定技术检测人类
和动物补体的研究尚未见报道。本文首次应用化学发
光免疫测定技术测定仿刺参体腔液内补体类似物 ,以
期为建立检测无脊椎动物体液等免疫因子的化学发光
免疫检测提供实验方法 ,为今后开展仿刺参病害发生
免疫防治提供理论依据。
1 　材料和方法
111 　供试材料、仪器及试剂
试验用仿刺参取自大连旅顺海域 ,三龄个体 ,平均
体重为 400g ,雌雄比为 1∶1。
生物化学发光检测仪 (上海上立仪器厂) ,羊抗人
C3、C4 抗体 (伊利康生物公司 ) , 辣根过氧化物酶
(HRP) ,C3、C4 标准品 (伊利康生物公司) , 牛血清蛋白
(bovine serum albumin ,BSA) ,鲁米诺 (Luminol , Sigma) ,
对碘苯酚 ( Sigma) ,30 % 双氧水 (011molΠL) ,临用前等
比稀释 10 倍。抗原抗体稀释液 :1 %牛血清白蛋白溶
液 ;包被缓冲液 :0101molΠL 碳酸盐缓冲液 (pH 915) ,用
于包被抗体的稀释。PBS 洗涤液 :0102molΠL ,pH 714。
112 　试验方法
试验采用双抗体夹心免疫反应 ,羊抗人 C3、C4 抗
血清在 0101molΠL ,pH 915 碳酸盐缓冲液中稀释成不同
浓度用于包被聚乙烯管 ,冰箱过夜。用前 ,用 PBS 洗
涤聚乙烯管 3 次 ,1 %BSA 封闭室温 1h ,洗涤 3 次 ,加入
标准品 C3、C4 ,室温孵育 2h ,洗涤 3 次 ,加入标记抗体 ,
孵育 2h ,洗涤 3 次 ,加入发光液测定每管每秒化学发
光值 (CPS) 。
11211 　HRP2C3、C4 抗体复合物制备 　取 1mg HRP 溶
于 2ml 双蒸水中 ,加入 011ml 新配 011molΠL NaIO4 震荡
30min ,用 pH 414 ,01001molΠL 的乙酸盐缓冲液透析 4 ℃
过夜 ,用 012molΠL ,pH 915 碳酸盐缓冲液将醛基 HRP
调 pH 915 , 加入 100μl C3、C4 抗体稀释液 ,室温搅拌
2h ,加入 011ml 新配 4mgΠml NaBH4 , 4 ℃反应 2h ,用 pH
414 ,01001molΠL 的乙酸盐缓冲液透析 4 ℃过夜 ,得到
1ml 的 HRP2C3 和 C4 抗体复合物[1 ] 。
11212 　固相抗体的制备 　C3、C4 抗血清与等体积磷
酸盐缓冲液 (011molΠL ,pH 714 ,0115molΠL NaCl) 混合后
加入无水硫酸钠 (180mgΠml) ,搅拌直到溶解。30min 后
离心收集沉淀 ,再溶于磷酸盐缓冲液中 (011molΠL ,pH
714) 。制得的免疫球蛋白溶液 pH 414 ,01001molΠL 的
乙酸盐缓冲液透析 4 ℃过夜。
聚乙烯管浸泡于蒸馏水中 ,蒸馏水洗涤 2 次 ,磷酸
盐缓冲液 (011molΠL ,pH 714)洗涤 1 次 ,浸泡于 5 %的戊
二醛磷酸盐缓冲液中 ,室温搅动 2h 后 ,用磷酸盐缓冲
液洗涤 ,直至无戊二醛的气味。在无菌操作台上强风
条件下 ,紫外线直接照射干燥聚乙烯管 1h ,用于抗体
的包被。
C3、C4、免疫球蛋白溶液 (1μgΠml) 以 100μl 加入两
组小试管中 ,室温孵育 2h ,在 4 ℃冰箱过夜 ,取出用含
有 1molΠL NaCl 的缓冲液洗涤 3 次。得到抗体包被聚
乙烯管 ,4 ℃冰箱中保存待用。
11213 　仿刺参体腔液补体类似物 AjC3、AjC4 的检测
　　分别取 10 头仿刺参体腔液 ,离心后上清液稀释
1000 倍用于检测。第 1 组聚乙烯管为不同浓度的 C3、
C4 标准品 100μl ,第 2 组聚乙烯管中加入待测仿刺参
体腔液 100μl ,室温孵育 2h ,吸干 ,洗涤 3 次。各管分别
加入标记 C3、C4 抗体稀释液 (1 :2000) 100μl ,室温孵育
2h ,洗涤 3 次 ,用双蒸水洗涤 2 次 ,迅速加入 100μl 发光
底物液 ,测量化学发光 ,记录发光最强值 ,用第 1 组试
管的发光峰值绘制标准曲线 ,在曲线上查得第 2 组试
管中补体类似物 AjC3、AjC4 的含量。
2 　结果与分析
211 　HRP2C3、C4 抗体复合物最适检测浓度
按表 1 将 HRP2C3、C4 抗体复合物稀释后加入用
115μg/ ml 抗体包被的聚乙烯管 ,分别加入 100μl 标准
补体和 100μl 标记补体检测 CPS。结果显示 HRP2C3、
C4 抗体复合物检测最适稀释浓度为 1∶2000。
212 　聚乙烯管抗体包被最适浓度
经 1、215、5μgΠml 抗体包被的聚乙烯管中加入 1∶
2000 稀释的 HRP2C3、C4 ,测定 CPS。表 2 表明 1μgΠml
为抗体包被最适浓度。
213 　样品孵育时间
414 核　农　学　报 21 卷
表 1 　HRP2C3、C4 抗体最适检测浓度
Table 1 　The best concentrations of HRP2C3、C4
antibody for CLIA (CPS)
HRP2C3、C4
抗体复合物
(ngΠml) 稀释比例 dilution time1∶1000 1∶2000 1∶4000C3 C4 C3 C4 C3 C4
0 　512 　501 　520 　516 　509 　511
011 85632 85396 86214 85983 80118 79839
10 165583 167892 162935 163219 112968 109985
100 185234 186349 185234 186342 115263 112438
注 :表中数据为化学发光值。下图表同。
Note :The figures above are CPS. The same as following Table.
表 2 　聚乙烯管抗体包被最适浓度
Table 2 　The best concentrations of C3、C4 antibody
for coating polystyrene tubes (CPS)
HRP2C3、C4
抗体复合物
(ngΠml) 抗体包被浓度concentration of antibody for coating(μgΠml)1 215 5
C3 C4 C3 C4 C3 C4
0 　514 　512 　513 　514 　512 　511
011 86948 86234 90174 90542 92703 91689
10 164949 165235 169849 169252 173219 169827
100 185428 185324 189956 189356 187736 182546
标准品C3 稀释为 0、011、10、100ngΠml 与包被抗体聚乙烯
管 (1μgΠml)室温孵育 015、1、2、4、6、8h ,加入 HRP2C3 抗体
测定 CPS ,图 1 显示标准品 C3 与包被抗体标记反应达
到平衡需要 2h ,因此理想的孵育时间为 2h。
图 1 　标准品 C3 与包被抗体孵育时间
Fig. 1 　Incubation time of standard
C3 with coating antibody
214 　HRP2C3、C4 抗体复合物稳定性
标记抗体以 1∶100 稀释并分别在室温和 4 ℃条件
下存放 ,检测 8d 内的稳定性 ,标准品为 011ng/ ml ,检测
稀释度为 1∶2000。图 2 表明 HRP2C3、C4 抗体复合物
4 ℃条件下贮存 8d 内性能稳定 ;室温 5d 内稳定性无显
著性差异。
图 2 　HRP2C3、C4 抗体复合物稳定性
Fig. 2 　The stabilities of HRP2C3、C4 antibody complexes
215 　标准曲线
标准品稀释为 0、011、2、4、6、8、10、20、40、80、100、
200ngΠml ,然后标准品和标记物各 100μl 加入聚乙烯管
(抗体包被浓度 1μg/ ml) 检测 CPS ,查出样品中 C3、C4
含量 (图 3、4) 。标准曲线显示补体含量在 10～011ngΠ
ml ,具有很好的线性相关 ( C3 : y = 24583Ln ( x ) +
139225 , R2 = 019803 ; C4 : y = 16434Ln ( x ) + 136212 , R2
= 019714) ,可以检测到浓度为 011ngΠml 的补体 , 一周
内标准曲线相当稳定。
图 3 　标准品 C3 浓度
Fig. 3 　The concentration of standard C3
图 4 　标准品 C4 浓度
Fig. 4 　The concentration of standard C4
514　4 期 仿刺参体腔液补体类似物化学发光免疫检测
216 　仿刺参体腔液补体类似物 AjC3、AjC4
仿刺参体腔液补体类似物 AjC3 和 AjC4 的测定结
果见表 3。结果表明仿刺参体腔液内确实含有 C3、C4
补体类似物 ,AjC3 含量检测平均值为 6158μgΠml ,AjC4
含量检测平均值为 0167μgΠml ,统计分析样品体腔液中
AjC3、AjC4 含量个体间无显著性差异 ( P > 0105 ) 。
表 3 　仿刺参体腔液补体类似物 AjC3、AjC4 含量
Table 3 　The content of AjC3 , AjC4 in the coelomic
fluid of Apostichopus japonicus
样品
sample
No.
AjC3 AjC4
发光值
CPS
含量
content (μgΠml) 发光值CPS 含量content (μgΠml)
1 175224 516 133948 019
2 177096 612 131920 018
3 172789 419 139294 112
4 181965 8 126574 016
5 181403 718 106296 012
6 173538 511 119016 014
7 185710 918 131920 018
8 177845 614 133948 019
9 176160 519 123256 015
10 176909 611 119016 014
平均值±
标准差
Mean ±SD
177864 ±4038 6158 ±1. 4 126519 ±9798 0167 ±0. 3
3 　讨论
有关应用化学发光免疫技术检测仿刺参补体类似
物研究以及方法的建立还未见有报道 ,本文首次尝试
了应用该技术建立检测仿刺参补体类似物的方法和应
用该技术的最佳条件 ,结果表明仿刺参体内存在补体
类似物。在测试条件等因素中测定用 HRP2C3、C4 抗
体复合物最适检测稀释度为 1∶2000 ;聚乙烯管抗体包
被最适浓度为 1μgΠml。标记抗体的稳定性决定了检测
结果的可靠性 ,标记抗体在室温 5d 内稳定 ,能够保证
检测要求 ,HRP2C3、C4 抗体复合物在冰箱 4 ℃中稳定 ,
可以延长保存期。
对比标准品 C3 和 C4 标准曲线 ,显示检测补体类
似物含量在 10～011ngΠml 范围具有很好的线性相关 ,
相关系数分别为 019803 和 019714 ,此方法可以检测到
浓度为 011ngΠml 的补体。采用固相双抗体夹心法进
行发光免疫检测 ,其标记抗体有效包被的量决定能够
捕捉到的抗原量。当 HRP 标记抗体质量均一时 ,在一
定程度内提高抗体的包被密度 ,可提高检测管结合抗
原的容量 ,从而增加发光信号。固相捕获抗体的有效
包被密度直接关系到检测灵敏度和线性范围 ,因此抗
体的包被是整个免疫检测的关键。本检测使用了经过
戊二醛浸泡和紫外线处理一定时间后的聚乙烯管进行
C3、C4 抗体的包被 ,保证了检测的稳定性 ,检测灵敏度
达到了 10～011ngΠml。
Bertheussen 研究海胆体腔液发现有补体样活性存
在[3 ,4 ] ,用人的补体 C3 调理红细胞 (RBCs) 能够明显增
强海胆 ( S . droebachiensis) 体腔吞噬细胞吞噬 RBCs 的
作用[4 ] ,表明海胆体腔细胞具有 C3b 或 C3bi 的受体 ,
进一步研究发现哺乳动物的补体抑制因子同样能够降
低或阻止海胆吞噬细胞对 RBCs 的吞噬作用。Al2Sharif
研究证实海胆补体类似物 SpC3 是脊椎动物补体 C3 的
同系物 ,包括硫酯位点、αβ结合点、C3 转换酶位点、两
种因子 I 裂解酶位点及参与联内二硫键形成的保守位
置的半胱氨酸等[7 ] 。本研究应用化学发光免疫检测技
术首次证实了仿刺参体内有脊椎动物补体类似物
AjC3 和 AjC4。证明仿刺参同海胆等棘皮动物一样具
有补体系统抗病免疫机制。人体血清中 C3 含量高达
1300μgΠml ,C4 含量约为 C3 含量的 1Π3 ,仿刺参体腔液
补体类似物 AjC3 和 AjC4 的含量分别为 6158μgΠml 和
0167μgΠml ,明显低于人类补体含量 ,但 AjC3 含量高于
AjC4 现象与人类同。有关 C4 补体类似物在棘皮动物
研究中还未见报道 ,本研究用人类 C4 补体抗体检测到
仿刺参体腔液内存在有 C4 补体类似物 ,其准确性和功
能还有待进一步研究证实。
参考文献 :
[ 1 ] 　Bertheussen K. Complement2like activity in sea urchin coelomic fluid.
Dev Comp Immunol ,1983 ,7 (1) :21～31
[ 2 ] 　Berthuessen K, Seljelid R. Receptors for complement on echinoid
phagocytes. Purified human complement mediates echinoid phagocytosis.
Dev Comp Immunol ,1982 ,6 :635～642
[ 3 ] 　Berthuessen K, Seljelid R. Receptors for complement on echinoid
phagocytes. The opsonnic effect of vertebrate sera on echinoid
phagocytosis. Dev Comp Immunol ,1982 ,6 :423～431
[ 4 ] 　Leonard L A , Strandberg J D , Winkelstein J A. Complement2like
activity in the sea star , Asterias forbesi . Dev Comp Immunol , 1990 ,14
(1) :19～30
[ 5 ] 　焦　奎 ,张书圣. 酶联免疫分析技术及应用. 北京 :化学工业出版
社 ,2004 ,142～164
[ 6 ] 　Smith L G, Chang L , Britten R J , et al . Sea urchin genes expressed in
activated coelomocytes are identified by expressed sequence tags.
Complement homologues and other putative immune response genes
suggest immune system homology within the deuterostomes. J Immunol ,
1996 ,156 ;593～6021
[ 7 ] 　Al2Sharif WZ ,Sunyer J O ,Lambris J D ,et al . Sea urchin coelomocytes
specifically express a homologue of complement component C31 J
Immunol ,1998 ,106 :2983～97
614 Journal of Nuclear Agricultural Sciences
2007 ,21 (4) :413～416