全 文 ：文章编号 :100028551 (2005) 052393204
莱克多巴胺单克隆抗体的制备与初步鉴定
曲　　　齐孟文
(中国农业大学核技术农业应用实验室 ,北京　100094)
摘 　要 :为了对莱克多巴胺进行酶联免疫法测定 ,经由混合酸酐法合成莱克多巴胺免疫原 ,免疫
BALBΠc 小鼠 ,通过杂交瘤单克隆化技术最终得到了 1 株名为 3E12C92E10的能稳定分泌抗莱克
多巴胺的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。经 ELISA 测定 ,细胞培养上清的效价为 1 ×105 ,腹水的
效价达 1 ×107 以上 ,与多巴酚丁胺有 24 %的交叉反应率 ,与沙丁胺醇、克伦特罗没有交叉反
应率。
关键词 :莱克多巴胺 ;β2肾上腺素激动剂 ;单克隆抗体
PREPARATION AND IDENTIFICATIONN OF MONOCLONAL ANTIBODIES
AGAINST RACTOPAMINE
QU Qing 　QI Meng2wen
( Laboratory of Application Nuclear Technology , China Agricultural University , Beijing , 100094)
Abstract : In order to prepare the monoclonal antibody agaist Ractopamine ( RCT) , RCT2conjugated antigen was
produced by methods of mixed acid anhydride. The spleen cells of BALBΠc mice immunized by RCT2BSA were fused
with SP2Π0 plasmacytoma cells using PEG4000. A hybridoma cell line of 3E12C92E10 was screened for specificity to
RCT and cloned by limited dilution method ,which secreted stable monoclonal antibodies against RCT with indirect
ELISA titers of 1 ×105 in supernatant , 1 ×107 in astices. The McAb of 3E12C92E10 generally had 24 % cross2
reactivity to Dobutamine , and showed little or no cross - reactivity to Salbutamol and Clenbuterol .
Key words :Ractopamine ;β2adrenergic agonist ;monoclonal antibody
收稿日期 :2004211229
作者简介 :曲　　 (1980 - ) ,女 ,吉林长春市人 ,硕士研究生 ,从事小分子化合物免疫测定方法的研究。电话 :010 62733117。
莱克多巴胺 (RCT) 3 盐酸 (Ractopamine hydrochloride) ,{ (1R 3 ,3R 3 ) (1R 3 ,3S 3 )24 羟基2a2[ [ [ 32(42
羟丙基)212甲基丙基 ]氨基 ]甲基 ]苯甲醇·盐酸} ,是一种苯酚胺类β2 肾上腺素激动剂 ,能选择性激动支
气管平滑肌的β2 受体 , 临床上普遍用于支气管哮喘治疗。动物试验同时表明 ,当用药量为治疗剂量的
5～10 倍时 ,可促使牛、猪、羊和家禽等多种动物体内的营养成分由脂肪向肌肉转移 ,表现为营养“再分
配效应”,具有调控动物体营养代谢路径 ,增强脂肪分解代谢 ,促进蛋白质合成 ,显著增加酮体瘦肉率 ,提
高饲料转化率的作用[1 ,2 ] ,因此作为一种新型促生长添加剂可能在畜产品生产中使用。但人类食用含有
该残留的畜产品会引发食物中毒事件[3 ] ,目前除了美国批准其可为猪的饲料添加剂[4 ,5 ] ,欧盟、中国等都
禁止使用 ,但常有非法使用情况的报道[6 ] 。在体育比赛中 ,RCT因可增强运动员、动物 (如马) 肌肉而提
高运动成绩 , 已被国际奥委会列为禁用药物。因此 , 研究和开发对 RCT的有效分析方法 ,对于临床药物
代谢研究以及食品安全检测和体育赛事兴奋剂检测都具有重要意义。免疫分析技术 , 尤其是酶免疫分
析技术具有操作简便快捷 ,一次检测样本多、灵敏度高、费用低廉等优点 ,而成为最常用的检测方法。本
试验用杂交瘤技术制备了抗莱克多巴胺单克隆抗体 ,以期待进一步研发 RCT 的免疫检测试剂盒。
393　核 农 学 报　2005 ,19 (5) :393～396Acta Agriculturae Nucleatae Sinica
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1 　材料与方法
111 　材料和设备
试剂牛血清白蛋白 (BSA) 、卵清蛋白 (OVA) 、琥珀酸酐和盐酸莱克多巴胺 (Ractopamine HCl) 为 Sigma
产品 ;HRP 标记的羊抗鼠 IgG为德国进口分装 ;弗氏完全佐剂 ( FCA) 、弗氏不完全佐剂 ( FIA) 、PRMI1640
细胞培养基购自北京欣经科生物工程公司 ; HAT、HT培养基和 PEG4000 均为 Gibco 产品。SP2Π0 骨髓瘤
细胞为中国农业大学核技术农业应用实验室保存 ; 实验动物 BALBΠc 小鼠购于中国科学院遗传研究所。
仪器设备 :SZ293 自动纯水蒸馏器 ,日本Nikon 公司 ;TGL216G台式高速冷冻离心机 ,北京医用离心机
厂 ;倒置生物显微镜 ,日本Nikon 公司 ;Wellscan MW23 型酶联检测仪 ,芬兰Labsystems ;3701 型 CO2 细胞培
养箱 ,日本 SANYON 公司。
112 　方法
11211 　全抗原的制备与鉴定　按参考文献[11 ]的方法先将 RCT·HCl 转变成半琥珀酸酯 ,再用混合酸酐
法分别与 BSA 和 OVA 偶联制备免疫抗原 (BSA2RCT) 和包被抗原 (OVA2RCT) 。具体过程如下 :取 34mg
RCT·HCl及 12mg 琥珀酸酐溶于 2ml 吡啶 ,室温下反应 24h ,用 TLC 跟踪反应 (展开剂 :90 %的二氯甲烷 ,
10 %的含 10 %氨水的甲醇) ,产物经旋转蒸发仪蒸干 ,溶于 4ml DMF : 1 ,4 —二氧六环 (1∶1) ,加入 2612μl
三正丁胺 ,冰浴 10min ,加入 15μl 氯甲酸异丁酯 ,冰浴 1h ,然后加入 40mgBSA 或 10mgOVA(预先溶于 3ml 1
∶1 的水和 1 ,42二氧六环 ,4 ℃预冷)室温反应 24h ,透析纯化得到偶联物 BSA2RCT和 OVA2RACT。参照文
献[12 ]分析估算偶联比。
11212 　动物免疫　以 BSA2RCT免疫 6～8 周龄雌性BALBΠc 小鼠 4 只。按剂量为 100μgΠ只 ,300μlΠ只加等
体积弗氏完全佐剂制成乳化剂 ,于小鼠颈部皮下多点注射 ,进行首次免疫。然后每隔两周 ,改用弗氏不
完全佐剂与初免同样剂量加强免疫。于四免后 10d 采血 ,用间接竞争性 ELISA 检测血清抗体效价。
11213 　杂交瘤细胞制备　选择抗血清效价高且竞争抑制强的小鼠脾脏进行细胞融合 ,融合前 3d 腹腔
免疫 1 次 ,不加佐剂。脱颈致死小鼠 ,无菌手术取出脾脏制备脾细胞 ,并与 SP2Π0 骨髓瘤细胞以 1∶5 的比
例在 5 %PEG作用下进行细胞融合 ,将融合后的细胞悬液加到细胞培养板上 ,于 37 ℃,5 %CO2 培养箱
中 ,用 HAT和 HT选择培养基培养。
11214 　融合细胞阳性杂交瘤的筛选与克隆　用 OVA2RCT 包被酶标板 ,先用间接非竞争性 ELISA 法进
行阳性细胞株初筛 ,再用间接竞争性 ELISA 进一步筛选 ,对强阳性、抑制率好、细胞生长旺盛的孔进行 3
次有限稀释克隆化。
11215 　细胞冻存和复苏　取处于对数生长期的杂交瘤细胞 ,用冻存液 (9 份含犊牛血清 200mlΠL 的完全
RPMI1640 培养液和 1 份二甲基亚砜混合而成)制成 1 ×106～5 ×106 个Πml 的细胞悬液 ,分装于冻存管并
封口 ,置 - 50 ℃冰箱 1h 后立即浸入液氮中保存。复苏时将冻存管取出 ,立即放入 37 ℃水浴中 ,速融后离
心去除冻存液 ,移入培养瓶内培养。
11216 　单克隆抗体的制备　体外培养 :将克隆化的细胞株扩大培养至细胞浓度达 5 ×105 个Πml 时停止
换液 ,直至细胞全部死亡 ,收集培养液 ,测定其 ELISA 效价。腹水制备 :给腹腔注射灭菌液体石蜡
015mlΠ只 ,10d 后腹腔注射克隆化细胞株 015mlΠ只 (1 ×106～2 ×106 个) ,再 10d 后抽取腹水 ,离心除去油
脂和沉淀 ,即得小鼠腹水单克隆抗体。
11217 　单克隆抗体效价及工作浓度的测定　以倍比稀释的 RCT2OVA 包被 96 孔酶标板 ,同时倍比稀释
单克隆抗体 ,按间接 ELISA 操作程序进行测定 : 每孔加包被抗原 100μl ,4 ℃过夜 , 弃去孔内的液体 ;加封
闭液 100μl ,37 ℃湿盒保持 1h 后 ,用洗涤缓冲液洗 3 次 ;将 100μl 倍比稀释的培养上清液顺序加入各孔
内 ;37 ℃水浴 1h ,加 100μl 适当浓度 HRP2 羊抗鼠 ( IgG) ,置 37 ℃水浴 1h ;加 100μl 新鲜配制的 TMB 底物
液 ,37 ℃水浴 10～30min ;加终止液 50μl。每块板同时设空白、阴性对照和阳性对照各 2 孔。OD 值大于
或等于阴性对照孔的 211 倍且吸光值 110 左右的待测孔判定为阳性 ,阳性孔的最高稀释倍数判定为终
点效价。以单抗的最大稀释倍数作为单抗的间接 ELISA 效价和工作浓度。试验重复 3 次。
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11218 　单克隆抗体的交叉反应性 　用于抗体交叉反应性研究的竞争物为β2 激动剂 ,参照 Shelver 和
Smith 的方法[11 ] ,以单抗对 RCT的 50 %抑制浓度 ( IC50 )与对竞争物的 IC50之比的百分数为其交叉反应率
(CR %) 。用竞争性 ELISA 测定各竞争物在 5～1280ngΠml 时的吸光度 ,拟合竞争曲线 ,并计算 RCT及各
类竞争物的 IC50和 CR %。
11219 　单克隆抗体类及亚类的鉴定　采用 ELISA 法 ,在包被好抗原的聚苯乙烯板中依次加入单克隆细
胞培养上清 ,羊抗鼠 IgG亚类的二抗及 HRP 标记的兔抗羊三抗 ,温育后洗涤显色。酶标读取 OD 值 ,以
阳性孔判定抗血清的 IgG。
2 　结果
表 1 　小鼠抗血清对 RCT的 IC50值的间接
竞争性 ELISA 测定( OD 值)
Table 1 　IC50 of mouse serum toward RCT by indirectly2
competed2ELISA(OD value)
标准品浓度
standard sample (ngΠml ) 小鼠 1mouse 1 小鼠 2mouse 2 小鼠 3mouse 3 小鼠 4mouse 41∶6000a 1∶3000 1∶3000 1∶6000
0 11383 01965 11001 11086
116 11301 01936 01989 01987
8 11215 01903 01962 01904
40 11117 01817 01862 01788
200 01868 01709 01706 01572
1000 01498 01596 01559 01354
IC50 451 2054 960 246
　　注 :a :抗血清的稀释倍数。Note :a :diluted times of serum.
表 2 　RCT单克隆抗体与肾上腺素激动剂的交叉反应性
Table 2 　The cross2reactivity of RCT monoclonal
antibodies and adrenergic agonists
化合物 compound IC50 (ngΠml ) CR( %)
莱克多巴胺 ractopamine 14. 1 100
多巴酚丁胺 dobutamine 59 24
沙丁胺醇 salbutamol > 100000 < 0. 01
克伦特罗 clenbuterol > 100000 < 0. 01
表 3 　抗体亚类鉴定
Table 3 　Identification of antibody subtypes
IgG1 IgG2a IgG2b IgG3
A 值 A value 21217 01098 01102 01105
211 　偶联比的测定
经紫外分光光度法测定 ,偶联物 RCT2
BSA 和 RCT2OVA 的浓度分别为 3216 和
713mgΠml。RCT与BSA 和OVA 的偶联比分
别为 1∶21 和 1∶16 ,比值适中。
212 　融合鼠选择
三免后采血 ,用间接竞争性 ELISA 测
定小鼠抗血清的 IC50值 ,结果见表 1。选择
表 1 中 IC50最小的 4 号小鼠做融合。
213 　融合杂交瘤细胞筛选
融合杂交瘤细胞培养的镜检及间接非
竞争性 ELISA 法测定表明 ,融合率为 86 %
(克隆生长孔数Π融合孔数为 576Π672) ,阳性
克隆率为 917 % (阳性克隆孔数∶克隆生长
孔数为 56Π576) 。选择阳性且有抑制的孔
进行有限稀释克隆 ,采用竞争性 ELISA 筛
选 ,经过 4 次克隆后发现3E12C92E10细胞株
IC50最小 ,经多次传代 ,冻存及复苏 ,杂交瘤
细胞分泌抗体稳定。ELISA 法测定杂交瘤
培养上清和腹水的效价 ,OD 值大于阴性对
照 211 倍判定为阳性 ,以阳性株抗体的最
大稀释为效价 ,杂交瘤培养上清和腹水的
效价分别为 1 ×105 和 1 ×107 。
214 　与结构类似物的交叉反应
将莱克多巴胺及其结构类似物梯度稀
释 ,与包被 RCT2OVA 做间接竞争性 ELISA
,结果见图 1。由各物质的 IC50 与 RCT 的
IC50之比计算交叉反应率 ,结果见表 2。莱克多巴胺的单克隆抗体与β2 肾上腺素激动剂多巴酚丁胺交叉
反应率为 24 % ,与沙丁胺醇、克伦特罗没有交叉反应性。
215 　3E12C92E10细胞株分泌的单克隆抗亚类的鉴定
ELISA 法检测 3E12C92E10细胞株分泌的抗体亚类为 IgG1 (表 3) 。
593　5 期 莱克多巴胺单克隆抗体的制备与初步鉴定
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3 　讨论
311 　RCT的抗原性
图 1 　莱克多巴胺单克隆抗体与几种肾上
腺素激动剂的交叉反应性
Fig. 1 　The cross reactivity of RCT monoclonal
antibodies and adrenergic agonists
能作为完全抗原物质 ,其结构必须同时具备 T
细胞表位和 B 细胞表位。RCT 作为小分子物质因其
结构简单难以同时拥有两种表位 ,必须将其连接到
一些大分子蛋白质载体上 ,借助载体蛋白的 T 细胞
表位间接诱导 B 细胞激活 ,分化增殖 ,产生针对半抗
原小分子的特异性抗体。合成 RCT2BSA 是制备 RCT
单抗的关键 ,因 RCT 的两个苯环都连有酚羟基 ,在
RCT转化为半琥珀酸酐酯时 ,控制试验条件只让具
有免疫活性的酚羟基转化为酯 ,是合成完全抗原的
关键。
312 　莱克多巴胺的免疫活性基团
多巴酚丁胺和莱克多巴胺的结构类似 ,都是双
苯烷基胺化合物 ,但与莱克多巴胺相比 ,其儿茶酚基
团替代了莱克多巴胺的苯羟基基团 ,较高的交叉反
应说明莱克多巴胺中的苯羟基基团在与抗体发生特异性反应时起到很小的作用 ,为非免疫活性基团。
在克伦特罗和沙丁胺醇的结构中 ,氮端的苯酚基被其他基团取代 ,这两个化合物和莱克多巴胺基本上没
有交叉反应 ,所以 ,可以推断出 42羟基苯异丁基胺基团才是莱克多巴胺的免疫活性基团 ,在合成全抗原
时偶联应避免接到该基团 ,使其遭到破坏 ,这是制备特异抗体的关健。
由交叉反应检验本研究制备的 3E12C92E10单抗针对莱克多巴胺的特征基团是特异的 ,由此建立了间
接竞争性抑制 ELISA 方法 ,该方法对 RCT的 IC50为 1411ngΠml ,RCT最低检出量为 2ng ,尿及饲料添加回
收率为 80 %到 105 %。但该方法要在实际中应用 ,其灵敏度、回收率等指标还有待于进一步提高。
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