全 文 ：© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
文章编号 :100028551 (2000) 0220072204
抗大麦黄矮病小麦新品系选育
及其 RAPD 分子验证
孙光祖　李忠杰　李希臣　王广金　唐凤兰
张月学　闫文义　孙德全　孙　岩
(黑龙江省农业科学院作物育种研究所　黑龙江 哈尔滨　150086)
摘 　要 :利用辐射与外源 DNA 花粉管导入技术相结合的方法 ,选出了抗大麦黄矮病
(B YDV)的小麦新品系龙辐 97 K1099。经多年自然发病和两年接毒蚜鉴定 ,该品系
不仅高产 ,而且抗大麦黄矮病。RAPD 分子验证表明 ,在所用的 75 个随机引物中只
有 OPF15具有多态性。OPF15的扩增产物在 880bp、650bp 和 500bp 处出现 3 条供体
与龙辐 97 K1099 共有的特异谱带。可以认为这些谱带与大麦黄矮病抗性有关。
关键词 :辐射 　外源 DNA 导入 　小麦抗大麦黄矮病品系 　RAPD 技术 　高分子量麦
谷蛋白亚基
收稿日期 :1999211203
基金项目 :国家自然科学基金 (39370439)
作者简介 :孙光祖 (1939 —) ,男 ,甘肃武威人 ,黑龙江省农业科学院作物育种研究所研究员 ,研究方向为核技术与生物技
术育种。
大麦黄矮病是以蚜虫为传媒由大麦黄矮病毒 (barley yellow dwarf virus , B YDV)引起的小
麦重要病害之一。防治大麦黄矮病的有效途径是抗病育种。小麦近缘种属中的中间偃麦草是
大麦黄矮病的重要抗源 ,许多学者用它育成了抗大麦黄矮病的双二倍体、二体附加系和易位
系[1 ,10 ,11 ] 。但由于这些材料具有许多偃麦草的不良农艺性状 ,直接用于生产较为困难。通过
花粉管通道介导含有抗病基因的外源 DNA ,选育农艺性状优异的抗病品种的研究已获得初步
成功[2 - 4 ] 。从 1990 年起我们采用辐射与外源 DNA 花粉管通道介导技术相结合的方法 ,进行
了选育抗大麦黄矮病的小麦新品种 (系)的研究 ,现已取得阶段性成果。
1 　材料与方法
111 　抗 BYDV品系龙辐 97 K1099 的获得
中 5 是 B YDV 抗源中间偃麦草与小麦杂交选出的双二倍体材料 ,是目前国内广泛应用的
抗B YDV 种质。以它为供体提取叶片的总 DNA ,并用不同剂量的γ射线照射 ,使其 DNA 分
子降解 ;然后通过花粉管通道导入高产受体品种新克旱 9。D1 代种在温室 ,以后各代种于田
间 ,在自然发病条件下进行抗病性鉴定并按育种目标选择单株和株系。龙辐 97 K1099 是 D4
代选出的综合农艺性状优良的抗病品系。1998～1999 年将该品系送往中国农业科学院植物
27　 核 农 学 报　2000 ,14 (2) :72～75Acta A gricult urae N ucleatae Sinica
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保护研究所病毒室进行毒蚜接种鉴定 ,同时参加产量对比试验 ,并用 SDS2PA GE 法作籽粒的
高分子量麦谷蛋白亚基分析。
112 　抗 BYDV品系龙辐 97 K 1099 的 RAPD 分析
11211 　供试材料 　抗 B YDV 品系龙辐 97 K1099、供体中 5 和受体新克旱 9。
11212 　模板 DNA 提取 　采取苯酚2氯仿2异戊醇2核糖核酸酶法提取。提取的 DNA 用 018 %
琼脂糖凝胶电泳检测其片段大小 ,用岛津 UV2160A 检测其浓度和纯度。
11213 　RAPD 扩增 　龙辐 97 K1099、新克旱 9 和中 5 的 DNA 同时扩增 ,反应体系为 10μl ,包
括 10 ×缓冲液 1μl ,MgCl2 (25mM) 1μl ,dN TPs (dA TP、dTTP、dCTP、d GTP 各 200μM) 1μl , Taq
DND 聚合酶 (4units) 012μl ,随机引物 1μl ,模板 DNA (25ng/μl) 1μl ,超纯水 418μl。
11214 　RAPD 扩增程序 　反应器是美国 PE 公司生产的 DNA Thermal cyclear 480 ,102mer 随
机引物购于北方同正公司 (按 Opern 公司的引物序列合成) ,它们是 OPB01 - 20 、OPC01 - 20 、
OPE01 - 20 、OPF01 - 15共 75 个。95 ℃预变性 215min ,94 ℃1min ,36 ℃1min ,72 ℃2min ,进行 40
个循环 ,72 ℃保温 5min ,4 ℃保温。
11215 　电泳检测 　反应后向反应管中加入 210μl 6 ×溴酚兰 ,在 114 %的琼脂糖凝胶上进行电
泳 ,紫外检测仪上观察 ,照相。
2 　试验结果
211 　抗 BYDV品系龙辐 97 K1099 及其受体的主要农艺性状
龙辐 97 K1099 与受体的主要农艺性状和产量列于表 1。可看出龙辐 97 K1099 较受体新
克旱 9 矮 7cm ,除千粒重较低外 ,其它农艺性状均好于新克旱 9 ,并略有增产。从两年的田间
表现还看出 ,龙辐 97 K1099 植株整齐 ,秆有强性 ,抗倒伏 ,根腐病和赤霉病轻 ,后期落黄好 ,稳
定性能很好。另外 ,龙辐 97 K1099 还具有一些供体中 5 的性状 ,如颖较长 ,穗呈深绿色等。
表 1 　抗 BYDV品系龙辐 97 K1099 及其受体的主要农艺性状
Table 1 　Main agronomical t raits of Longfu97 K1099 and its receptor
材　　料
material
株　高
plant height
(cm)
穗　长
ear height
(cm)
主穗小穗数
spikelet
number
千粒重/ 1000
kernel weight
(g)
产量
yield
(kg/ hm2)
±
龙辐 97 K1099
Longfu97 K 1099
9510 ±510 912 ±014 1511 ±113 3114 ±117 471910 215
新克旱 9 (受体)
New kehan No. 9 (receptor)
10210 ±413 812 ±013 1412 ±113 3410 ±210 460210 -
212 　抗 B YDV 品系龙辐 97 K1099 及其受体和供体的抗性与高分子量麦谷蛋白亚基
1988～1999 年龙辐 97 K1099 与及受体新克旱 9 和供体中 5 经麦二叉蚜和麦长管蚜为媒
介传播的 GAV 株系接种鉴定 (表 2) ,龙辐 97 K1099 对 B YDV 的抗性较受体明显提高 ,而且稳
定。从表 2 看出 ,龙辐 97 K1099 的高分子量麦谷蛋白亚基组成发生了变化。与受体新克旱相
比 ,丢失了亚基 1 ,而亚基 7 + 9 变成了 7 + 8。
37　2 期 抗大麦黄矮病小麦新品系选育及其 RAPD 分子验证
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表 2 　品系龙辐 97 K1099 及其受体与供体对 BYDV的抗性和高分子量麦谷蛋白亚基
Table 2 　Main agronomical t raits of Longfu 97 K1099 and its receptor and donor
材 　　料
material
大麦黄矮病抗性
B YDV resistance
第 1 次调查 第 2 次调查 第 3 次调查 第 4 次调查
1st investigation 2nd investigation 3rd investigation resistance evaluation
9815126 9915126 981618 991618 9816116 9916116 98 99 高分子量麦谷蛋白亚 　基HMW2GS
龙辐 97 K1099
Longfu97 K1099 2 1 2 2 2 + 2 R R 7 + 8 2 + 12
新克旱 9 (受体)
New Kehan No. 9
(receptor)
3 3 5 5 5 5 S S 1 　7 + 9 2 + 12
中 5 (供体)
Zhong No. 5 (donor) 0 0 1 1 1 1 R R 2
3 7 + 9 5 + 10
　　注 :接种的大麦黄矮病为 GAV 株系
Note :B YDV inoculum is GAV
213 　抗 BYDV品系龙辐 97 K1099 及其受体和供体的 RAPD 检测
图版 Ⅰ　引物 OPF15的扩增产物
Plate Ⅰ　Amplified product of the primer OPF15
A :中 5 (供体) 　B :龙辐 97 K1099
C :新克旱 9 (受体) 　M :DNA 分子量标准 ( PUC Mit)
引物 OPF15序列 :5′- CCAGTACTCC - 3′
A :Zhong No. 5 (donor) 　B :Longfu97 K1099
C :New Kehan No. 9 (receptor)
M :DNA molecular weight marker
The sequence of the primer OPF15 is 5′- CCAGTACTCC - 3′
提取的植物样品DNA 经紫外分光光度计检测 ,A260/ 280 ≥118 ,A260/ 230 ≥2 ,表明蛋白质及
其它杂质已除去。经琼脂糖电泳检测 ,DNA 片段整齐 ,接近 50kb ,符合 RAPD 的实验要求。
在测试所用的 75 个随机物中 ,有 74 个引物的扩增产物完全相同 ,占 9817 %。随机引物
OPF15分别在 880bp、650bp 和 500bp 处出现 3 条只有龙辐 97 K1099 和供体具有的特异带 (图
版 Ⅰ) 。实验经 3 次重复 ,结果稳定。
3 　讨 　论
通过花粉管通道将含有抗病基因的外
源总 DNA 导入受体来筛选病品种 (系) 的
研究已获得重要进展 [2 - 4 ] ,但提取的总
DNA 分子量较大 ,一般在 30～50kb 之间 ,
导入后使其整合到受体 DNA 时产生困
难。辐射处理外源 DNA 可引起分子链断
裂 ,形成较小的片段 ,导入受体后容易被整
合 ,并能获得大量具有供体特性的后
代[5 - 7 ] 。龙辐 97 K1099 等就是利用这种
方法获得的具有供体中 5 抗 B YDV 特性
的新品系。该品系除具有供体的抗病性等
特点外 ,还保留了受体新克旱 9 优良的农
艺性状。
RAPD 检测结果表明 ,在抗 B YDV 品
系龙辐 97 K1099 及其供体中 5 和受体新
克旱 9DNA 的扩增中共用了 75 个随机
物 ,其中 74 个引物的扩增产物表现出高度
47 核　农　学　报 14 卷
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的一致性 ,说明它们的遗传基础相近 ,基因组 DNA 具有高度的同源性。只有随机引物 OPF15
的扩增产物具有多态性 ,扩增出了只有供体和龙辐 97 K1099 才具有的 3 个特异片段。刘树兵等
人[8 ]在研究偃麦草与普通小麦间多态性及 E 组染色体的特异 RAPD 标记时得出 ,随机引物
OPF15在偃麦草中扩增出了一条 014kb 的片段 ,而这个片段也分别出现在双倍体和 DA3E 中 ,表
明它是 3E染色体的特异 RAPD 标记。可以认为在我们的试验中 OPF15扩增出的 3 条特异谱带
是 E组染色体片段存在的分子标记 ,而偃麦草抗B YDV 的特性是与 E组染色体密切相关的。
小麦品质与高分子量麦谷蛋白亚基组分有关 ,且不同亚基对品质贡献不同 ,一般认为 Glu2
B1 位点上的 7 + 8 优于 7 + 9[9 ,12 ] 。龙辐 97 K1099 在 Glu2B1 位点上的亚基是 7 + 8 ,而受体新
克旱 9 是 7 + 9 ,因此它具有较好的品质潜力。供体中 5 Glu2B1 位点的亚基是 7 + 9 ,与受体新
克旱 9 相同 ,而龙辐 97 K1099 Glu2B1 位点上亚基却是 8 ,是诱变引起的等位基因变异。
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SEL ECTION OF WHEAT NEW L INE WITH RESISTANCE TO
BYDV AND RAPD TECHNIQUE
SUN Guang2zu 　L I Zhong2jie 　L I Xi2chen 　WAN G Guang2jin 　TAN G Feng2lan
ZHAN G Yue2xue 　YAN Wen2yi 　SUN De2quan 　SUN Yan
( Instit ute of Crops B reeding , Heilongjiang Academy of A gricult ure Sciences , Heilongjiang Prov . Harbin ,150086)
ABSTRACT :The wheat new line Longf u97 K1099 with resistance to BYDV was selected by means
of irradiation and introduction exogenous D NA via the pollen2tube pathway. Longf u97 K1099
has stable a resistance to BYDV, good agronomical traits and good HMW2GS. 75 random de2
camer primers were used to amplify D NAs from Longf u97 K1099 ,donor Zhong No. 5 and new re2
ceptor Kehan No. 9. The primer OPF15 revealed polymorphism bet ween them. The specif ic D NA
fragments , which both Longf u97 K1099 and donor Zhong No. 5 own , have been found by RAPD
technique. These fragments are related to resistance to BYDV.
Key words :irrdiation , int roduction exogenous DNA , wheat line of resistance to B YDV , RAPD ,
HMW2GS
57Acta A gricult urae N ucleatae Sinica
2000 ,14 (2) :72～75