全 文 ：文章编号 :100028551 (2007) 012079204
人工雌性激素己烯雌酚单克隆抗体的制备及表征
王文　　许　艇1 　高宏斌1 　赵继勋2 　张国中2 　李　季1
(11 中国农业大学资源与环境学院 ,北京　100094 ; 21 中国农业大学动物医学院 ,北京　100094)
摘 　要 :合成了己烯雌酚的半抗原 CP2DES ,并将半抗原与牛血清蛋白 (BSA) 和卵清蛋白 (OVA) 共价偶联
制备免疫原和包被原。将免疫好的 BalbΠc 小鼠脾脏细胞和 SP2Π0 骨髓瘤细胞融合 ,筛选出了 1 株能稳
定分泌己烯雌酚单克隆抗体的杂交瘤细胞株 2D8 7C4 12C7 。分析该杂交瘤细胞的染色体 ,并以间接酶联
免疫吸附分析法 (iELISA) 检测了单克隆抗体免疫球蛋白的类型。获得的杂交瘤细胞的平均染色体数
目为 45～50 对左右 ,它分泌 IgG1 亚类的单克隆抗体。该细胞株体外传代和冻存复苏后抗体分泌稳定 ,
细胞上清效价大于 640 ,诱导腹水效价大于 108 ,该单克隆抗体的检测限 IC20 = 213ngΠml , 与己烯雌酚结
构类似物存在一定的交叉反应 ,与两种载体蛋白 (BSA , OVA)无交叉反应。本研究为己烯雌酚 ELISA 检
测方法的建立提供了条件。
关键词 :己烯雌酚 ;单克隆抗体 ;酶联免疫吸附分析
PREPARATION AND IDENTIFICATION OF MONOCLONAL ANTIBODIES OF
SYNTHESIZED ESTROGEN DIETHYLSTILBESTROL
WANG Wen2jun1 　XU Ting1 　GAO Hong2bin1 　ZHAO Ji2xun2 　ZHANG Guo2zhong2 　LI Ji1
(11 College of Natural Resources and Environmental Sciences , China Agricultural University , Beijing 　100094 ;
21 College of Veterinary of Medicine , China Agricultural University , Beijing 　100094)
Abstract :Hapten of diethylstilbestrol was synthesized and conjugated to bovine sera albumi (BSA) and ovalbumin (OVA) to
prepare immunogen and coating antigen , respectively. A strain of hybridoma cell , named 2D8 7C4 12C7 , stably secreting
monoclonal antibodies (McAb) against diethylstilbestrol was screened from fusing mouse myeloma cells SP2Π0 and splenocytes
of BalbΠc mice immunized with immunogen. The chromosomes of hybridoma cell were analyzed and number of that was 45～50
pair , the immunoglobulin class was determined with indirect enzyme linked immunosorbent assay (iELISA) and the results
indicated : the subclass was IgG1 1The titers of cell supernatant and ascites were 640 and 1 ×108 , respectively. The iELISA
showed the limit of detection ( IC20 ) of 213ngΠml. DES analogs such as Hexestrol and dienestrol exhibited certain cross2
reactivity and there is no cross2reactivity was seen between McAb and two carrier proteins (BSA , OVA) . The monoclonal
antibodies of diethylstilbestrol were obtained successfully and this made it possible to establish ELISA for diethylstilbestrol .
Key words :diethylstilbestrol ; monoclonal antibodies ;iELISA
收稿日期 :2006202214
基金项目 :北京市生态学重点学科 (XK10019440) ;北京市都市农业学科群建设建设项目 (XK100190553)
作者简介 :王文　 (19752) ,女 ,山西大同人 ,博士 ,研究方向为农业及环境毒物的免疫分析 ,E2mail :wwj107 @1631com
通讯作者 :李季 (19652) ,山西静乐人 ,教授 ,博士生导师 ,研究方向为农业生态与固废处理　　己烯雌酚 (diethylstilbestrol ,DES) 是一种具有酚羟基结构的人工合成雌性激素 ,从 1938 年起就在全世界范围广泛应用 ,在畜牧业主要作为一种生长促进剂用以提高饲料的利用率。动物通过食物获得的 DES 一 部分被排泄到环境中 ,一部分在动物体中残留 ,并通过食物链在人体内富集。20 世纪 70 年代末 ,人们发现了 DES 的致癌性。现在 ,世界上大多数国家已将 DES列为在食品动物中禁止使用的兽药。然而 ,在强大经
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济利益的驱使下 ,滥用 DES 的现象依然存在。国内外
对 DES 残留的检测方法主要是理化方法[1～5 ] 。但理化
方法前处理复杂 ,对仪器和操作人员的要求较高 ,无法
实现大量样本同时检测。酶联免疫吸附分析 ( ELISA)
可以弥补这些不足。近几年来 ,关于 DES 多克隆抗体
的制备成为研究的热点[6～8 ] ,这为 DES 的 ELISA 分析
提供了基本条件。我们在制备高亲和性、高特异性
DES多克隆抗体的基础上 ,建立了高灵敏度的 DES 单
克隆抗体。
1 　材料与方法
111 　仪器与试剂
所用仪器为酶联免疫检测仪 ( Epson ,日本) 、倒置
显微镜 (尼克 ,日本) 、ACF2300 MHZ 核磁共振仪、FD21
冷冻干燥机、96 孔及 24 孔细胞培养板 (丹麦 ,NUNC) 、
CO2 培养箱 ( Pharmacocia ,美国) 、超净工作台 (苏州) 。
SP2Π0 骨髓瘤细胞由本实验室保存 ,BALBΠC 小鼠由军
事医学科学院提供 ,明胶、牛血清白蛋白 (BSA) 、卵清
蛋白 (OVA) 、反式己烯雌酚 ( trans2DES) 、己烷雌酚
(HEX) 、双烯雌酚 (DIEN) 、β - 雌二醇 ( E2 ) 均为 Sigma
公司产品 ,弗氏完全佐剂 ( FCA) 和不完全佐剂 ( FICA)
为 GibcoBRL 公司产品 ,己烯雌酚 (顺反混合) 为 Aldrich
产品。
112 　方法
11211 　免疫原的合成和鉴定 　半抗原正丁酸己烯雌
酚单醚 (DES2CP) 以及免疫原 (DES2CP2BSA) 、包被原
(DES2CP2OVA) 的合成见王文　等的方法[8 ] 。用紫外
吸收光谱对半抗原与蛋白质的偶联物 (DES2CP2BSA、
DES2CP2OVA)进行鉴定 ,并计算结合比 (每分子载体蛋
白质连接的半抗原数目) 。公式如下 :结合比 = (ε结
合物 - ε载体)Πε半抗原 (ε为摩尔吸光系数)
11212 　免疫小鼠　以 DES2BSA 作为免疫原 ,免疫雌性
BALBΠC小鼠 (8～10 周龄) 。免疫方案如下 :初次免疫
时 ,每只小鼠用约 100μg 的 DES2BSA (以载体蛋白计)
与 FCA 混合 (1∶2) ,充分乳化后 ,于颈背部皮下多点注
射。加强免疫时 ,将 FCA 换成 FICA ,剂量和方法与上
同。每次免疫间隔时间为 14d。三免后 7～10d 开始采
血检测抗体效价和亲和力。
11213 　ELISA 方法的建立 　用融合小鼠的阳性血清
建立竞争性间接 ELISA。阳性血清倍比稀释从 1 ×103
到 1132 ×105 ,包被原 DES2OVA 稀释至 510、215、1125
和 01625μgΠml。反应程序如下 : (1) DES2OVA 用包被
缓冲液稀释至适当浓度 ,每孔加 100μl ,4 ℃过夜 ,洗涤 3
次 ,每次 3 min ; (2) 每孔加封闭液 150μl ,37 ℃孵育 30
min ,洗涤同上 ; (3) 96 孔酶标板奇数行加入抗体稀释
液 50μl ,偶数行加入 2μgΠml 的 DES(溶于抗体稀释液)
50μl ,将待测血清样品稀释后顺序加入 ,每孔 50μl。
37 ℃孵育 1 h ,洗涤同上 ; (4)用稀释液将酶标二抗稀释
到适当的工作浓度 ,每孔加 100μl ,37 ℃孵育 1 h ,洗涤
同上 ; (5)每孔加新鲜配制的底物溶液 100μl ,37 ℃孵育
15 min ; (6)每孔加终止液 50μl ; (7) 测定 OD 值 ,待测孔
OD 值大于或等于阴性对照孔的 211 倍 ,即为阳性 ; (8)
确定阳性血清和包被抗原的工作浓度。
11214 　细胞融合　选择血清效价高、抑制好的小鼠于
融合前 3d 腹腔注射加强免疫 ,不用佐剂 , 剂量为
150μgΠ只。将 SP2Π0 骨髓瘤细胞与免疫脾细胞按 1∶5
比例混合 ,在 50 % PEG2000 作用下融合 ,再用 HAT 培
养液悬浮加入 96 孔板中 ,放入 37 ℃,5 % CO2 培养箱
中培养。
11215 　杂交瘤细胞的筛选及克隆　融合后 ,待细胞长
至孔板底 1Π3 到 1Π2 ,上清开始变黄时 ,以建立好的
ELISA 方法筛选抑制率比较高的阳性株 ,具体方法是
96 孔酶标板奇数行加入抗体稀释液 50μl ,偶数行加入
2μgΠml 的 DES(溶于抗体稀释液) 50μl ,从 96 孔培养板
中取上清液 ,相邻的奇数孔和偶数孔各加入 50μl ,比较
两孔的 OD 值 ,选择抑制率较高 (大于 70 %) 、细胞生长
良好的阳性孔进行克隆。有限稀释法亚克隆 3 次 ,第
3 次克隆后各孔均为阳性者 ,即为筛选出的单克隆株 ,
而后扩大培养、冻存、制备腹水和鉴定。
11216 　腹水的制备 　大量腹水的制备是采用体内诱
生法 ,将 BALBΠC 小鼠 (8 周龄) 腹腔注入灭菌石蜡油
(015mlΠ只) ,7d 后再注入阳性细胞 106 个 ,10d 后抽取
腹水。
11217 　单克隆抗体的表征　单克隆抗体亚类鉴定 :采
用 ELISA 方法 ,在包被好的酶标板中依次加入阳性细
胞培养上清 ,羊抗鼠 IgG亚类的二抗及 HRP 标记的兔
抗羊三抗 ,温育显色 ,确定抗体蛋白亚型。
杂交瘤细胞染色体数目 :阳性细胞用秋水仙素处
理 ,计算染色体数目。
腹水抗体蛋白含量 :将腹水稀释为适当的浓度 ,测
260nm和 280nm 的分光光度值 ,按公式计算蛋白浓度。
蛋白质浓度 (mgΠml) = 1145OD280nm - 0174OD260nm
单克隆抗体对己烯雌酚的亲和性 :用间接竞争
ELISA 法测定不同标准浓度的 DES 对抗原 - 抗体反应
的抑制率 ,将 0ngΠml 标准品孔的OD 值定为B0 ,其他孔
OD 值定为 B ,以 BΠB0 值为纵坐标 ,相应的标准品浓度
的 log 值为横坐标 ,绘制 BΠB0 - log 标准曲线。根据标
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准曲线的回归方程求己烯雌酚抑制中浓度 IC50 (BΠB0
= 50 %)及最小检测限 IC20 (BΠB0 = 80 %) 。
单克隆抗体的特异性 :
(1)与 OVA、BSA 的交叉反应用间接 ELISA 法 ,分
别采用 DES2CP2OVA、OVA、BSA 为包被抗原 ,测定腹水
的效价 ;
(2)与结构类似物的交叉反应是用间接 ELISA 法
分别考察抗体与己烯雌酚、己烷雌酚 ( HEX) 、双烯雌
酚 (DIEN) 、17β- 雌二醇 ( E2 ) 的交叉反应 ,建立标准
抑制曲线 ,计算各自的 IC50 ,计算交叉反应 :交叉反应
(CR %) = IC50 (DES)ΠIC50 (供试物) ×100 %。
11218 　单克隆抗体稳定性的测定
定期复苏冻存的杂交瘤细胞 ,培养后收集上清 ,用
间接 ELISA 法测定上清效价。
2 　结果
211 　人工抗原的制备
经紫外扫描测定 ,偶联产物 DES2CP2BSA 的偶联
比为 DES∶BSA = 11∶1 (图 1) ; DES2CP2OVA 的偶联比为
DES∶BSA = 17∶1。
212 　细胞融合与杂交瘤的筛选
先后选取 3 只老鼠的脾脏与 SP2Π0 细胞融合、筛
选和克隆 ,前两次筛选出来的对己烯雌酚有特异性的
阳性细胞在第 1 次克隆中就丢失 ,第 3 次融合的细胞
中有 10 孔对己烯雌酚具有特异性 ,选取其中抑制良好
的细胞进行 3 次克隆 ,得到了能稳定分泌抗体的杂交
瘤细胞株 2D87C4 12C7 ,连续培养 60d ,细胞生长良好 ,
抗体分泌稳定 ,冻存后复苏仍保持稳定的抗体分泌能
力。
213 　杂交瘤细胞株的染色体分析
BalbΠc 小鼠和 SP2Π0 的染色体数目分别为 20 对和
36 对 ,所获的杂交瘤细胞数目应该在 50～54 对之间 ,
2D8 7C4 12C7 染色体平均数目为 45～50 对之间 ,在生长
过程中可能出现染色体丢失现象 ,但是接近两种亲本
细胞染色体数目总和。杂交瘤细胞在传代过程中携带
抗体产生基因 ,没有丧失抗体分泌能力 ,并将这种能力
遗传给子细胞。
214 　单克隆抗体亚型的测定
间接 ELISA 法的检测结果如表 1 ,该系抗己烯雌
酚的单克隆抗体的亚类是 IgG1 。
215 　单克隆抗体的效价测定
用 ELISA 分别检测细胞培养上清和诱生腹水效
价 ,细胞上清效价大于 640 ,腹水效价大于 128 ×106 。
可见腹水效价明显高于上清效价。
216 　腹水蛋白含量的测定　用分光光度法测定结果
表明 ,腹水中抗体蛋白的平均含量为 21162 mgΠml。
表 1 　单克隆抗体免疫球蛋白类别的分析结果
Table 1 　Indirect ELISA results of McAb
immunogloblin class
Ig IgM IgG1 IgG2a IgG2b IgG3
OD 01093 21192 01089 01102 01163
217 　单克隆抗体的亲和性
包被抗原 DES2CME2OVA 为 215μgΠml ,腹水抗体稀
释 2 万倍 ,己烯雌酚的间接 ELISA 法抑制曲线如图 2 ,
曲线回归方程 : y = - 014787x + 019766 , R2 = 019698。
根据回归方程计算 ,己烯雌酚的检测极限 ( IC20 ) 等于
213ngΠml ,抑制中浓度 ( IC50 )等于 918ngΠml ,证明本试验
所获单克隆抗体对己烯雌酚具有较高的亲和性。
图 1 　DES2CP、BSA 及 DES2CP2BSA 的紫外扫描光谱
Fig. 1 　spectrogram of DES2CP , BSA
and DES2CP2BSA conjugate
图 2 　己烯雌酚间接 ELISA 法标准抑制曲线
Fig. 2 　standard inhibition curve of DES
determined by indirect ELISA
218 　单克隆抗体的特异性
18　1 期 人工雌性激素己烯雌酚单克隆抗体的制备及表征
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21811 　与 OVA、BSA 的交叉反应 　由表 2 可知 ,所选
单抗不分泌针对 BSA 、OVA 的抗体 ,与 OVA、BSA 不存
在交叉反应。
21812 　单抗与其结构类似物的交叉反应　用间接竞
争性 ELISA 检测结果表明 ,单克隆抗体与其结构类似
物存在着一定的交叉反应 :单克隆抗体与 DIEN 交叉
反应为 2117 % ,与 HEX 的交叉反应为 4412 % ,与 E2 、
孕酮、雌酮的交叉反应均小于 011。抗体与结构类似
物的交叉反应是 ELISA 检测的固有问题。由试验结果
说明苯酚以及与其相连的碳原子是一个重要的抗原决
定簇。
表 2 　单克隆抗体对 DES2CP2OVA 、OVA、BSA 的效价
Table 2 　Titer of Mabs to DES2CP2OVA 、OVA、BSA
稀释倍数
dilution fold
OD
DES2CP2OVA OVA BSA
1 ×104 11003 01048 01050
2 ×104 01912 01046 01051
4 ×104 01727 01046 01046
8 ×104 01563 01044 01047
16 ×104 01375 01049 01046
32 ×104 01254 01042 01048
64 ×104 01174 01046 01047
219 　单克隆抗体的稳定性测定
杂交瘤细胞连续传代培养 10 代及冻存 3 个月后
复苏 ,检测细胞上清液对己烯雌酚的亲和性 ,结果证明
传代细胞和复苏细胞上清稀释后 ,OD 值依然很高 ,而
且对己烯雌酚有较强的亲和性。证明 2D8 7C4 12C7 杂
交瘤细胞株在测定时间内稳定性良好。
3 　讨论
成功制备一个高质量的单克隆抗体 ,需要建立起
可靠的杂交瘤细胞的筛选体系 ,一方面该体系能避免
筛选到不必要的单克隆抗体 ,另一方面又能在短时间
内筛选大量的细胞。一般来说 ,动物免疫产生的抗体
主要是针对 DES、BSA 以及连接臂的抗体。要获得针
对 DES 特异性抗体 ,理论上应选择另一亲缘关系较远
的蛋白质作为包被抗原中的载体蛋白 ,排除检测中因
BSA 的干扰而出现的假阳性 ,同时采用竞争性和非竞
争性 ELISA 法筛选 ,非竞争 ELISA 可以保证细胞培养
上清液对包被抗原的识别 ,但是 ,并不是所有识别包被
抗原的细胞上清液都对己烯雌酚有识别能力 (比如针
对连接臂的抗体) ,必须同时用竞争性 ELISA 法进行筛
选。抗体对己烯雌酚的亲和性较高 , IC50 = 918ngΠml。
所有抗体的特异性都不是绝对的 ,即使是针对某一个
抗原决定簇的单克隆抗体 ,也不能排除它由于识别类
似抗原或不同抗原上相同决定簇而存在交叉反应的可
能 ,本试验制备的己烯雌酚单克隆抗体与其类似物存
在一定的交叉反应。但对于生长期较短的动物来说 ,
不可能同时接触这些药品 ,而且制备的单抗与动物的
内源雌激素β- 雌二醇不存在交叉反应 ,不会对检测
结果造成干扰。
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更　正
2006 ,20 (6) :524 ,顾可飞等人撰写的论文“辐照降低食物致敏性的研究进展”中 ,基金项目“国家自然科学基
金项目 (C020508)”应为“国家自然科学基金项目 (30470999)”。特此更正。
28 Journal of Nuclear Agricultural Sciences
2007 ,21 (1) :79～82
© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net