全 文 ：文章编号 :100028551 (2006) 032236205
聚乙二醇化重组人白细胞介素 6 的放射性标记
徐贤坤　王　霜　曾宪垠　汪淑芳
(四川农业大学原子能农业应用研究室 ,四川 雅安　625014)
摘 　要 :分别用常规氯氨 T和改进的双相氯氨 T法对 PEG2rhIL26 进行放射性碘标记 ,用柱层析法和离心
超滤法对标记物分离纯化 ,同时用三氯乙酸沉淀法和 SDS2PAGE 电泳法鉴定纯化后的标记化合物放射
化学纯度 ,采用 rhIL26 依赖细胞 7TD1 ,用 MTT比色法测定标记物的生物学活性。结果表明 :11 改进的
双相氯氨 T法标记率为 7415 % ,高于常规氯氨 T法的 6213 % ,放射性比活度分别为 51513 ×105 和 41610
×105 BqΠμg。21 经柱层析法和离心超滤法对标记物分离纯化后 ,用三氯乙酸沉淀法测得放射化学纯度
均能达到 99 %以上。31 用 SDS2PAGE 电泳法检测两种标记方法所得的标记物与非标记物的结果表明 ,
常规氯氨 T法标记物比非标记物多 1 条高分子量蛋白带 ,认为是标记过程中蛋白质受到部分损伤 ;改进
的双相氯氨 T的标记物与非标记物蛋白质条带一致 ,认为蛋白质标记后基本没有受到损伤。41 生物活
性检测表明改进的双相氯氨 T标记物与非标记物活性之间无显著差异 ,常规氯氨 T法标记物活性略低
于双相氯氨 T的标记物活性。
关键词 :聚乙二醇化重组人白细胞介素26 ;放射性碘标记 ;离心超滤法 ;MTT比色法
RADIO2LABELING OF POLYETHYLENE GLYCOL MODIFICATION OF
RECOMBINANT HUMAN INTERLEUKIN26
XU Xian2kun 　WANG Shuang 　ZENG Xian2yin 　WANG shu2fang
( Isotope Research Lab , Sichuan Agricultural University , Ya’an , Sichuan , 625014)
Abstract :Iodine2125 was used as labeling nuclide , and the PEG2rhIL26 was labeled by the common used chloramines2T and
the two2phase chloramines2T , respectively. The labeled compound was purified by both methods of gel filtration and
ultrafiltration respectively. The purity of the labeled PEG2rhIL26 was determined by both trichloroacetic acid (TCA) and SDS2
PAGE , and the biological activity was determined by MTT method. The results demonstrated that the labeling rate and specific
radioactivity were 7415 % and 51513 ×105 BqΠμg for PEG2rhIL26 by the two2phase chloramines2T method , higher than that by
the common used chloramines2T method , which was 6213 % and 41610 ×105 BqΠμg respectively. The purity of labeled PEG2
rhIL26 ,purified by both gel filtration and ultrafiltration methods ,was over 99 % with TCA method. The labeled PEG2rhIL26 by
two2phase chloramines2T method showed two bands , which was identical to that of standard PEG2rhIL26 though SDS2PAGE ,
but the labeled PEG2rhIL26 by common used chloramines2T method had one more band compared with standard PEG2rhIL261
When determined by MTT , it shown that the biological activity of PEG2rhIL26 iodinated by common used chloramines2T
method was lower than that by two2phase chloramines2T method.
Key words :PEG2rhIL26 ; chloramines2T; radio2labeling ; TCA ; SDS2PAGE ; MTT
收稿日期 :2005208202
作者简介 :徐贤坤 (19802) ,女 ,重庆荣昌人 ,助教 ,在读博士 ,从事核素标记及新药示踪动力学研究。曾宪垠为通讯作者。　　白细胞介素26 ( IL26) 是淋巴类及非淋巴类细胞产生的一种多功能细胞因子 ,在机体免疫、骨髓造血及炎 症反应中均能发挥重要作用 ,是细胞网络中的重要成员[1 ] 。目前在欧美和日本等发达国家以 IL26 治疗血
632　 核 农 学 报　2006 ,20 (3) :236～240Journal of Nuclear Agricultural Sciences
小板减少症为目的的研究 ,已进入临床试验阶段[2 ,3 ] 。
但 IL26 在体内由于蛋白质水解而呈现出低稳定性 ,同
时由于快速的肾排泄和广泛的组织分布其生物半衰期
很短。为了达到期望中的临床效果 ,通常采用高剂量
和频繁给药[4 ] 。有关研究发现 ,聚乙二醇化重组人白
细胞介素26 ( PEG2rhIL26) 能够降低蛋白质的肾排泄率
和保护其不受蛋白酶的水解 ,从而延长蛋白质的生物
活性并保证它的临床效果[5 ] 。我国有关单位开发的
PEG2rhIL26 药物也正处于临床前研究阶段。为使 PEG2
rhIL26 早日应用于临床 ,本研究分别用常规氯氨 T 和
改进的双相氯氨 T 法对 PEG2rhIL26 进行放射性碘标
记 ,对标记物分离纯化并进行生物活性鉴定 ,制备出高
纯度、比放射性适中的 PEG2rhIL26 同位素标记物 ,为进
行 PEG2rhIL26 药代动力学方面的研究提供必要条件和
保证。
1 　材料和方法
111 　材料
Na125 I(放射化学纯度 > 9919 %) ,Amersham 公司产
品 ;PEG2rhIL26 (纯度大于 95 %) ,成都生物制品研究所
提供 ,生产许可证号 09 ;7TD1 细胞株 ,成都生物制品研
究所提供 ;垂直板式电泳槽 ,北京六一仪器厂 ;UV2754
分光光度计 ,上海精密科学仪器有限公司分析仪器总
厂 ;FT22008γ免疫测定仪 ,西安二六二厂 ;5408R 高速
冷冻离心机 ,德国 eppendorf 公司 ;超滤离心管 ,Millipore
公司 ;酶标仪 ,Bio2tek 公司。
112 　方法
11211 　标记反应 　常规氯氨 T 法标记参照尹伯元
法[6 ] 。双相氯氨 T法标记参照本室标记长效促红细胞
生成素的方法[7 ] ,放免试剂盒的标准小瓶 1 个 ,瓶盖 2
个 (不锈钢丝穿过瓶盖 ,折弯以悬挂滤纸片) 。用有机
硅溶液对反应瓶、吸头进行硅烷化以防吸附。取滤纸
1 张 ,用 1molΠL NaCl 溶液浸泡 30min ,烘箱干燥 ,剪成
7mm×40mm 大小的纸片。在反应瓶里依次加入 011
molΠL pH714 磷酸缓冲液 50μl、Na125 I 37MBq、PEG2rhIL26
50μg。取制备好的滤纸片 1 片 ,在其表面滴加 15μl 氯
氨 T溶液 ,悬挂在折弯的不锈钢丝上 ,迅速盖上反应瓶
盖。每 10min 换滤纸片一次 ,共换 5 次。反应过程中
间歇轻轻震荡保证反应液充分混匀。反应结束后加入
5μl 偏重亚硫酸钠终止反应。
11212 　标记率测定 　取标记反应后样品 2μl ,用三氯
乙酸 (TCA)沉淀法测定标记率[8 ] 。
11213 　标记物的分离纯化及纯度鉴定 　选用
Sephadex G275 层析柱对碘化反应混合液进行分离纯
化。离心超滤法纯化标记物参照《蛋白质技术手
册》[9 ] 。纯化后的标记物用三氯乙酸沉淀法测定放射
化学纯度[8 ] 。同时采用时液 SDS2PAGE 电泳法检测其
电泳行为和放射化学纯度。将碘标记 PEG2rhIL26 样品
所在凝胶切割成 4mm 宽的胶条 ,分别放入试管中在
FT22008γ计数器上测定放射性 ,并绘制扫描图谱。
11214 　蛋白含量测定　采用考马斯亮蓝染色法 ,参照
Bradford 检测法[10 ] ,以牛血清白蛋白作为参考品 ,在
UV2754 分光光度计上测出 A595 值 ,绘制标准曲线。
使用标准曲线定量柱层析及离心超滤的蛋白质浓度。
11215 　生物活性鉴定　利用体外培养 IL26 依赖 7TD1
细胞株 ,用 MTT 比色法测定 125I2PEG2rhIL26 生物活
性[11 ] 。
2 　结果
211 　放射性碘标记率和放射性比活度
标记反应完毕后取 2μl 样品 ,用三氯乙酸沉淀法
测定标记率。根据125 I蛋白 ( BqΠμg) = 所用125 I 总放射
性 (Bq) ×125 I 标记率Π所用蛋白总量 (μg) ,计算出125 I2
PEG2rhIL26 的放射性比活度 ,结果见表 1。
表 1 　两种不同标记方法标记 PEG2rhIL26 的
碘标记率和放射性比活度
Table 1 　Iodine incorporation and specific activity of
PEG2rhIL26 labeled by two different methods
标记方法
labeled method
加入的
放射性
added
radioactivety
(MBq)
加入的
蛋白量
added
protein
(μg)
平均
标记率
average
labeling
rate ( %)
放射性
比活度
specific
radioactivity
(BqΠμg)
双相氯氨 T
two2phase iodination of Ch2T 37 50 7415 51513 ×105
常规氯氨 T
common used iodination of Ch2T 37 50 6213 41610 ×105
212 　标记化合物的分离纯化
21211 　柱层析分离纯化 　柱层析法分离纯化双相氯
氨 T 碘标记 PEG2rhIL26。第一峰为蛋白峰 ,第二峰为
游离碘离子。共收集 19 管 ,放射性已极低 ,接近本底。
对常规氯氨 T 碘标记 PEG2rhIL26 的分离不够理想 ,仍
为两个放射峰 (见图 1) 。
21212 　超滤离心法纯化 　将标记后的 PEG2rhIL26 加
入超滤器后连续离心 3 次 ,样品得到高度纯化并浓缩 ,
回收体积为 20～30μl ,可按实验要求补充体积到需要
量。
732　3 期 聚乙二醇化重组人白细胞介素 6 的放射性标记
图 1 　125 I2PEG2rhIL26 层析分离纯化图谱
Fig. 1 　Purification of iodinated PEG2rhIL26
by gel chromatography
213 　放射化学纯度鉴定
21311 　三氯乙酸沉淀法测放射化学纯度　分别用柱
层析法和超滤离心法对标记蛋白分离纯化 ,得到标记
蛋白的放射化学纯度均高于 99 % ,结果见表 2。
表 2 　柱层析法和超滤离心法纯化的标记蛋白放射化学纯度
Table 2 　The Radiochemical purity of 125I2PEG2rhIL26
by gel chromatography and ultrafiltration with
two2phase iodination of Ch2T
标记方法
labeled method
柱层析法
gel chromatography
超滤离心法
ultrafiltration
平均纯度
average ( %)
标准差
SD
平均纯度
average ( %)
标准差
SD
双相
two2phase iodination of Ch2T 99142 0119 99138 0115
常规
common used iodination of Ch2T 99187 0122 99162 0112
21312 　SDS2PAGE法测放射化学纯度
2131211 　SDS2PAGE法比较两种方法标记物与非标记
品条带 　SDS2PAGE 电泳染色结果表明 ,PEG2rhIL26 的
电泳图谱显示了 2 个条带 , Rf 值分别为 01289 和
01542 ;双相标记 PEG2rhIL26 在电泳图谱上亦在同样的
位置有两个条带 , 其电泳迁移率分别是 01289 和
01542 ,与非标记品位置基本一致。且均表现出分子量
高的条带显色浅且窄 ,而分子量低的条带显色深且宽
(见图 2) 。由此可见 ,双相法标记的 PEG2rhIL26 与非
标记品电泳行为一致 ,说明没有产生聚合物或裂片 ,蛋
白分子结构没有改变。
常规氯氨2T 法标记的 PEG2rhIL26 在电泳时 ,显示
标记品多了 1 条高分子量、Rf 值为 01214 的较浅条带 ,
说明该法标记对蛋白质引起了部分损伤 ,产生了少量
聚合物。
2131212 　SDS2PAGE法测定放射化学纯度　SDS2PAGE
电泳后切割胶条测定放射性结果表明 ,双相法标记
PEG2rhIL26 的放射性检出位置与在电泳染色结果基本
一致 ,呈现 2 个放射峰 ,且分子量高的放射峰值低而分
图 2 　SDS2PAGE法比较两种方法标记物与标准品条带
Fig. 2 　Bands comparison of standard PEG2rhIL26 and
iodinated PEG2rhIL26 by SDS2PAGE
A :非标记品 ,B :双相标记品 ,C :常规标记品
A :non2labeled PEG2rhIL26 ; B : bands for two2phase iodination
of Ch2T; C: bands for common used iodination of Ch2T
子量低的放射峰值高 (见图 3) 。常规氯氨2T法标记品
呈现 3 个放射峰 ,与染色结果亦基本一致 (见图 4) 。
双相标记品的 2 个蛋白峰放射性总计数除以泳道全程
的总计数 ,得到标记蛋白的放射化学纯度为 9617 % ;
常规标记品的 2 个蛋白条带放射性总计数除以泳道全
程的总计数 , 得到标记蛋白的放射化学纯度为
9517 %。
图 3 　双相标记放射性扫描图谱
Fig. 3 　Radioactivity of the extracts from slice gels of
125 I2PEG2rhIL26 labeled
by the two2phase iodination of Ch2T
图 4 　常规标记放射性扫描图谱
Fig. 4 　Radioactivity of the extracts from slice gels of
125 I2PEG2rhIL26 labeled by
the common used iodination of Ch2T
832 核　农　学　报 20 卷
214 　蛋白定量和蛋白回收率
纯化后的标记蛋白 ,按 OD 值可以从标准曲线找
到对应蛋白量。根据标记时加入的蛋白量和纯化完成
后得到的蛋白量 ,得到了不同纯化方法的蛋白质回收
率 ,柱层析法的回收率为 33135 % ,离心超滤法纯化的
蛋白质回收率为 92 %。柱层析法的回收率明显低于
离心超滤法。
215 　储存条件对标记物的影响 21511 　储存条件对标记物放射化学纯度的影响　由表 3 数据看出 ,在保存时间及储存温度相同的情况下 ,加牛血清白蛋白 (BSA)作保护蛋白的标记物放射化学纯度均比不加 BSA 的高 ;此外 ,储存温度越低 ,标记物保存的时间越长。而加 BSA 且保存于220 ℃条件下的标记物 ,就放射化学纯度 (大于 95 %) 来看 ,可保存 45d左右。
表 3 　不同储存条件的标记物放射化学纯度
Table 3 　Radiochemical purity of 125 I2 PEG2rhIL26 preserved in different conditions and different times ( %)
储存时间
storage days(d)
室温
room temp.
室温 + BSA
room temp. + BSA 4 ℃ 4 ℃+ BSA - 20 ℃ - 20 ℃+ BSA
2 97156 ±0135 96155 ±0123 97179 ±0114 97179 ±0111 99112 ±0131 98138 ±0128
7 98106 ±0122 96189 ±0144 97178 ±0158 98185 ±0114 98133 ±0138 99107 ±0139
15 84195 ±0115 97113 ±0141 97131 ±0147 97188 ±0125 97123 ±0143 99142 ±0123
30 2 81188 ±0122 81179 ±0192 86138 ±0143 90162 ±0155 99127 ±0127
45 2 2 2 2 87179 ±0151 95185 ±0185
21512 　储存条件对标记物分子结构的影响　保存于
- 20 ℃条件下的标记蛋白不定期进行电泳检测 ,发现
在标记后 7d 内蛋白条带无明显变化 ,而保存 10d 以上
的标记蛋白电泳无正常条带 ,显示蛋白分子结构已经
发生变化。
216 　生物学活性鉴定
用 MTT法对 PEG2rhIL26 进行生物学活性鉴定 ,经
检验 ,两种标记方法得到的标记物生物活性与标准品
比较 ,p > 0105 ,说明标记后的 PEG2rhIL26 与标准品活
性相当 ,生物活性未受到损伤。但常规碘标记 PEG2
rhIL26 活性较标准 IL26 低 ,明显低于双相法标记的蛋
白活性。
图 5 　IL26 标准品与标记物生物学活性比较
Fig. 5 　Biological activity of 125 I2PEG2rhIL26
and standard PEG2rhIL26
3 　讨论
311 　蛋白质的氯氨 T碘标记
改进的双相氯氨 T法优于常规氯氨 T 法 ,两者的
标记率分别为 7415 %和 6213 % , 比放射性分别为
51513 ×105 和 41610 ×105 BqΠμg。造成上述差异的原
因可能在于双相标记反应时间长 ,能让蛋白质分子和
活化碘单质在温和的条件下进行充分的氧化置换反
应 ,故标记率和比放射性较常规法有所提高 ;常规氯氨
T标记的蛋白质受到部分损伤 ,其标记物活性低于双
相氯氨 T的标记物活性 ,可能是因为常规氯氨 T 标记
时氧化剂和被标记物在同一个反应体系中 ,反应较剧
烈 ,条件不易控制 ,而引起标记蛋白损伤和失活。本室
曾用双相氯氨 T 法成功标记 LL2EPO[7 ] ,标记率接近
90 % ,而本次实验蛋白标记率相对较低 ,可能是因为
PEG2rhIL26 分子量较小 ,酪氨酸分子个数相对较少和
暴露程度低所致。本试验采用常规氯氨2T 法标记
PEG2rhIL26 得到标记率为 6313 % ,高于沈维明等[12 ] 常
规氯氨2T法标记 IL26 的标记率 (3317 %) ,可能是碘化
条件和标记蛋白分子结构不同所致。
312 　标记蛋白的分离纯化
根据 PEG2rhIL26 的分子量选择 Sephadex G275 作
为分离胶 ,因选用层析柱较短 (110cm ×20cm) ,对常规
标记反应产生的聚合物分离不理想 ;离心超滤法潜在
的缺点是不能把高分子量聚合物与标记蛋白分离开。
鉴于此 ,笔者认为双相标记法更有优势 ,因为在电泳染
色和放射性扫描图谱中我们都没有发现有聚合物和小
肽等杂质 ,分离主要考虑脱盐 ,两种分离方法都可以得
到很好的分离效果 (纯度均大于 95 %) ,而不用担心杂
蛋白和游离放射性碘离子的存在。离心超滤法蛋白回
收率高、快速、简单 ,更适用于本试验双相氯氨 T 法标
932　3 期 聚乙二醇化重组人白细胞介素 6 的放射性标记
记物的分离纯化。
313 　标记蛋白的稳定性
本试验制备的125 I2PEG2rhIL26 在无保护蛋白条件
下保存稳定性优于范我等的结果[13 ] ,但仍有待提高 ,
分析原因可能有以下几点 :一是标记物比放射性较高 ,
保存时蛋白浓度较高 (0185μgΠμl) ,可能导致了部分辐
射自行分解 ;另由于实验条件限制 ,在标记过程中无菌
操作不够严格 ,可能引入了细菌等杂质 ,对蛋白质保存
不利。同时 ,更佳的蛋白保护剂的筛选也可能提高标
记物的稳定性。
综上所述 ,本试验常规氯氨 T 法制备的标记物有
少量聚合物产生 ,生物活性有所降低 ;而双相氯氨 T法
制备的125 I2PEG2rhIL26 能达到较高的比放射性和放射
化学纯度 ,在低温和有保护蛋白的保存条件下稳定性
好 ,生物学活性保持良好 ,满足药代动力学研究要求。
而该法是否适用于其他一些修饰蛋白的标记 ,还需作
进一步探讨。
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