全 文 ：文章编号 :100028551 (2005) 062469205
不同种源马蔺的叶绿体 DNA 变异研究
牟少华　孙振元　韩　蕾　彭镇华
(中国林业科学研究院林业研究所Π国家林业局林木培育重点实验室 ,北京　100091)
摘 　要 :本研究利用通用引物 ,采用 PCR 技术从 9 个不同地理种源的马蔺样品中扩增了叶绿体
基因组 trnL2trnF 间隔区的 DNA 片段 ,进行了序列测定 ,并运用 DNAMAN 软件分析了不同种源
马蔺的亲缘关系。结果表明 :9 个马蔺植物样品分为 2 个相对独立的组 ,其中第 1 组包括采自
北京、泰山、武威、涿洲、民勤、固原 6 个种源的马蔺 ,第 2 组包括采自太仆、乌鲁木齐和西乌旗 3
个种源的马蔺。2 个组的亲缘关系很远 ,同源性只有 45 % ,这表明马蔺物种不是单系起源 ,本
研究结果也表明了利用叶绿体基因间序列研究马蔺亲缘关系是可行的。
关键词 :马蔺 ;亲缘关系 ;叶绿体 DNA(cpDNA) ; trnL2trnF 序列
THE CHLOROPLAST DNA VARIATION OF Iris lactea FROM DIFFERENT RESOURCES
MU Shao2hua 　SUN Zhen2yuan 　HAN Lei 　PENG Zhen2hua
( Research Institute of Forestry , Chinese Academy of ForestryΠKey Lab. of Forest Cultivation , State Forestry Administration , Beijing , 100091)
Abstract :In this paper , the intergenic region of trnL and trnF from Iris lactea from 9 different provinces was
amplified by PER with common primer. The PCR products were purified and sequenced. The genetic relationships
of these samples were analyzed using software DNAMAN. It showed that with a low homology of 45 % , the 9
samples could be fromed into two groups. It meant that Iris lactea was not unilaterally derived. The first group
including 6 samples collected from Beijing , Taishan , Wuwei , Zhuozhou , Mingqing and Guyuan respectively , and
the another group including 3 samples from Taipusi , Wulumuqi and Xiwuqi . The present study supported the use of
the intergenic sequence of the chloroplast genome for the relationship of Iris lactea.
Key words : Iris lactea ; relationship ; chloroplast DNA (cpDNA) ; trnL2trnF sequence
收稿日期 :2005210211
基金项目 :项目来源 :国家重大科技基础性工作专项 :森林植物质资源收集、保存与编目 (编号 :2002DEA10009)
作者简介 :牟少华 (1976 - ) ,女 ,山东栖霞人 ,博士 ,从事植物种质资源方面的研究 , Email :luckymsh @1261com。孙振元为通讯作者 ,
Email : sunzy @caf . ac. cn
马蔺 ( Iris lactea) 是鸢尾科鸢尾属多年生草本宿根植物 ,亦称马莲 (花、草) 、马兰 (花) 、紫蓝草、兰花
草、箭秆风、山必博、蠡实、旱蒲等 ,分布于我国东北、华北、西北等地[1 ,2 ] 。马蔺生态类型复杂 ,是鸢尾科
植物中分布最广、价值最高的植物之一[3 ] 。牟少华等曾对马蔺的植物学特性、栽培繁殖、抗性以及细胞
学等进行了研究[4 ] 。叶绿体 DNA(cpDNA)的保守性和单性遗传的特征使 cpDNA 的同源性分析成为研究
植物亲缘关系的一种重要手段。本文用具有分子量小、多拷贝和结构简单等特点的 cpDNA ,对马蔺叶绿
体基因组进行遗传操作和序列分析 ,以期为初步揭示马蔺不同地理变异种的亲缘关系 ,建立完整的马蔺
系统发育理论奠定基础。
1 　材料与方法
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111 　材料
实验材料为分别采自 9 个地区的天然马蔺群体 (表 1) ,每个群体随机选取 20 个单株 ,每株取 1 片幼
叶 ,每个叶片取相同质量组成混合样 ,用于总 DNA 的提取。
表 1 　马蔺采样群体的地理地点和环境条件
Table 1 　Sampling location of Iris lactea and environmental conditions
群体 population (采集地 collection place) 经度 ( E)
longitude
纬度 (N)
latitude
海拔 (m)
altitude
年均温 ( ℃)
annual
average
temperature
年降水量 (mm)
annual
precipitation
涿洲 Zhuozhou(河北涿洲市郊 Hebei) 115°44′ 39°35′ 28 1116 617
乌鲁木齐 Urumqi (新疆乌鲁木齐南山 Xinjiang) 87°20′ 43°31′ 2718 510 165
太仆 Taipu(内蒙古沽源县太仆寺 Inner Mongolia) 114°51′ 41°55′ 1460 112 416
西乌珠 Xiwuzhu(内蒙古锡林郭勒西乌珠穆沁旗 Inner Mogolia) 117°36′ 44°35′ 997 110 345
固原 Guyuan(宁夏固原市郊 Ningxia) 106°15′ 36°38′ 1648 611 492
民勤 Minqin (甘肃民勤沙生植物园 Gansu) 103°05′ 38°34′ 1378 716 113
武威 Wuwei (甘肃武威市区西郊 Gansu) 101°49′ 38°38′ 1535 718 191
泰山 Taishan(山东泰山玉皇顶 Shandong) 117°05′ 36°12′ 1532 513 1132
北京 Beijing(北京香山 Beijing) 116°25′ 39°48′ 76 1116 634
引物“c”和“f”由上海博亚生物技术有限公司 (BIOASIA)北京分公司合成 ,稀释到 20pmolΠμl。Taq 酶
购自 TaKaRa 生物公司。PCR 扩增和产物纯化实验于 2005 年在中国林业科学研究院林业研究所国家林
业局林木培育重点实验室完成。测序工作由北京三博远志生物技术公司完成。
112 　方法
11211 　DNA 提取 　总DNA 提取采用 CTAB 方法[6 ] 。DNA 的浓度及质量用琼脂糖凝胶电泳估测和检查 ,
最后稀释到 50～100 ngΠμl 备用。
11212 　DNA 片段的扩增 　在离心管中加入上述 DNA 样品 1μl ,引物“c”和“f”各 1μl ,超纯水 37175μl ,
dNTP Mixture (215mM) 4μl ,10 ×PCR Buffer (Mg2 + Plus) 5μl ,Taq DNA polymerase (5UΠμl) 0125μl。扩增按照卢
孟柱等[7 ]的扩增程序在 PCR 仪 (Biometra Tgradient) 上进行 ,扩增产物在 115 %的琼脂糖凝胶上鉴定大小
和估测浓度。
11213 　扩增产物纯化 　DNA 纯化采用 Promega 公司的纯化试剂盒 Winzard PCR Preps DNA Purification
System 的 prototal 方法 ,取 5μl PCR 产物进行琼脂糖电泳 (110 %) ,紫外显影仪上观察后 ,切取 cpDNA 放入
115ml 的离心管中 ,70 ℃水浴中溶化。加入 resin 1ml ,混匀 20s。把加 resin 的 cpDNA 倒入注射器中 ,挤出
液体。加 80 %异丙醇到注射器中 ,洗膜后转移到离心管中 ,10000 rpm 离心 2min 后转移过滤器至新的离
心管中 ,加 50ul 1 ×TE buffer ,静置 1 min 后 ,离心 20s。弃去过滤器 , - 20 ℃贮存。
11214 　序列测定　纯化好的 PCR 产物送交北京三博远志生物技术公司进行序列测定 ,自动测序仪型号
为 ABI3730XL。
11215 　序列分析与系统树构建　序列排列用 ClustalX软件完成[8 ] ,排序后适当手工校正 ,删除引物和边
缘的部分序列 ,将双向测定的序列按照正链的方向拼接成完整的序列 ,整理以待分析。排好的序列用
DNAMAN 软件 (version 410 ,Lynnon Biosoft Ζ 1994 - 1998)进行系统发育和同源性分析。利用 bootstrap (1000
次重复) [9 ]检验各分支的置信度。
2 　结果
211 　trnL2trnF 片段的扩增
根据已发表的 trnL2trnF 序列的通用特异引物 ,采用 PCR 方法 ,从 9 个马蔺样品中分别扩增出了相
应的 trnL2trnF 片段。
212 　trnL2trnF 片段的序列变异
9 个马蔺样品 trnL2trnF 片段的序列长度为 1003～1066bp ,比较长度为 919bp。为了方便群体间序列
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比较 ,列出北京和固原两个群体的比较序列 (见图 1) 。其中 ,北京、民勤、固原、泰山、武威和涿洲 6 个群
体的样品共有 2 个位点发生了单个碱基的置换 ,1 个位点发生了缺失 ,因此有进化意义的位点共 3 个 ,
约占总序列比较长度的 0135 %。民勤和固原群体样品相对其它 4 个种源的样品分别在 519bp 和 727bp
处各有一个 T →C 转换 ,753bp 处有一个 C 位点的缺失。而太仆、西乌奇和乌鲁木齐 3 个群体的样品有
99164 %同源性 ,具有 5 个信息位点。其中 ,乌鲁木齐和太仆群体相对于西乌旗群体在 19bp 处有一个 T
位点的缺失 ,另外 ,太仆群体在 97bp 处有一个 G位点的插入 ,117bp 和 325bp 处各有一个 G→A 转换 ,
730bp 处有一个 A →G转换。
图 1 　马蔺 (北京和太仆群体) trnL2trnF 间隔区的核苷酸比较序列
Fig. 1 　The nucleotide sequence of the intergenic region of Iris lactea (Beijing and Taipu populations)
213 　马蔺的系统位置分析
根据马蔺样品的 cpDNA 序列计算 9 个样品间的遗传距离 ,用 DNAMAN (Version 410) 软件进行系统
位置分析 ,构建的系统发育关系树 (图 2) 和同源关系树 (图 3) 。用 Bootstrap 方法 1000 次重复验证分支
的可靠性 ,其得分值见图 2。
分析图 2 和 3 的数据可以将 9 个马蔺样品分为 2 个相对独立的组。第 1 组包括北京、泰山、武威、
涿洲、民勤、固原 6 个种源的马蔺 ,第 2 组包括太仆、乌鲁木齐和西乌旗 3 个种源的马蔺。每个组内的马
蔺之间同源性极高 ,亲缘关系都很近 ,但是两组间的亲缘关系较远 ,同源性只有 45 %。亲缘关系的远近
与纬度有密切关系 ,第 1 组种源的原产地纬度均低于 40°,而第 2 组的纬度均高于 40°。
174　6 期 不同种源马蔺的叶绿体 DNA 变异研究
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图 2 　依据 trnL2trnF 核苷酸序列构建的马蔺系统发育树
Fig. 2 　The phylogenetic tree reconstructed for
Iris lactea based on the sequence of the
trnL2trnF intergenic region 图 3 　依据 trnL2trnF 核苷酸序列构建的马蔺同源关系树Fig. 3 　The homology2tree reconstructed forIris lactea based on the sequenceofthe trnL2trnF intergenic region
3 　讨论
311 　trnL2trnF 片段的序列变异
叶绿体 trnL2trnF 间隔区的核苷酸序列在不同马蔺样品中呈现的变异 ,明显地分为两大组 ,两大组
间变异很大 ,但组内马蔺样品核苷酸序列变异不大。较大的 DNA 变异一方面是由于鸢尾属植物是比较
古老的植物 ,起源于第三纪[10 ] 。另一方面 ,由于基因间隔区为非编码序列 ,所承受的自然选择压力较
小 ,发生的变异被保留的机会很大[11 ] 。这样的变异程度在进行系统位置分析中能够给出较好的分辨能
力 ,为系统位置分析的准确性提供保证。
312 　马蔺的亲缘关系
由于马蔺植物分布广泛且形态变异很大 ,如何有效的取样是系统位置和亲缘关系研究的关键。本
研究虽然没有收集到我国分布的全部的马蔺样品 ,但样品来源覆盖了我国西北、华北及华东地区。因此
可以初步探讨在此范围内马蔺种源间的亲缘关系。
从构建的系统发育树 (图 2) 可以看出 ,5 个 Bootstrap 值在 60 %以上 ,只有一个值为 24 % ,但是因为
这个分支内部的所有种类拥有 100 %的同源序列 (图 3) ,因而这些分支的可信度较高 ,从中获得的信息
对所讨论的问题具有较高的支持程度。而两组群体间的同源性低 ,表明马蔺物种不是单系起源的 ,它的
分化具有地理变异性 ,新疆和内蒙古的马蔺与其它地方的马蔺明显分为 2 个不同的类群。
313 　叶绿体 DNA( cpDNA)基因间序列用于系统位置关系分析
由于叶绿体 trnL2trnF 间隔区的 DNA 是其遗传物质 DNA 的一部分 ,在植物中具有稳定性 ,不随季节
的改变而发生变化。因此 ,采用叶绿体 trnL2trnF 间隔区的 DNA 序列变异的分析方法 ,较好地确立了部
分马蔺不同地理变异种之间的相互关系 ,显示了该 DNA 分析方法不但具有较好的通用性 ,而且有较好
的分辨能力。在此基础上 ,采集全部马蔺分布区的样品 ,用本研究分析方法 ,可应用于建立马蔺植物完
整的系统发育体系。但同时由于 cpDNA 是单亲遗传 (Uniparentally inherited) ,这些分子片段也仅仅是分
类群诸多性状的一个来源 ,它虽能为分类群的系统重建提供不可忽视的发育信息 ,但并不能解释所有的
系统发育问题 ,如研究类群间的杂交或渐渗现象 (introgression) 。因此 ,愈来愈多的学者开始注重将多个
不同来源或不同功能的适用 DNA 序列相互结合 ,或与传统的形态性状结合起来共同分析 ,以期获得更
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多的发育信息 ,进而得到更接近真实系统发育历史的研究结果[12 ] 。
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