全 文 ：文章编号 :100028551 (2007) 022168205
HPT2ELISA 方法的建立及其在转基因水稻监测中的应用
汪海燕　叶庆富
(浙江大学原子核农业科学研究所 ,浙江 杭州　310029)
摘 　要 :本文改进了 HPT2ELISA 检测法 ,利用一种简便并且高效的微生物表达体系 ,将 hpt 基因的全编码
序列克隆到原核表达质粒 p GEX2KG上 ,在 E. Coli 菌株 BL21 (DE3)2pLys 中进行诱导表达 ,获得了融合
蛋白 GST2HPT ,经 Thrombin 凝血酶酶切过夜 ,再经过柱纯化后获得不含 GST 且具有生物活性的 HPT 纯
蛋白 ,所得蛋白纯度 > 90 %。MALDI2TOF2MS 分析表明 ,HPT蛋白分子量为 3914KD。用 HPT纯蛋白免疫
家兔 ,制备了高效价的多克隆抗体 ,进而构建了双抗夹心酶联免疫检测方法 ,其灵敏度为 0131ngΠml。应
用该 HPT2ELISA 方法 ,测定了不同生育期转Bt 基因水稻植株中 HPT蛋白的表达水平以及成熟期稻米中
的 HPT 蛋白含量。结果表明 ,不同生育期转 Bt 基因水稻植株中 HPT 蛋白的表达量约为 15167～
60112ngΠg·FW ,转 Bt 基因稻米中 HPT蛋白的含量为 5128ng HPTΠg·FW ,而在非转基因亲本的植株和稻米
中均未检测到 HPT蛋白。
关键词 :HPT蛋白 ;表达纯化 ;抗体制备 ;酶联免疫分析 ;转 Bt 基因水稻
ESTABLISHMENT OF HPT2ELISA METHOD AND ITS APPLICATION IN HPT2
MONITORING OF TRANSGENIC PLANTS
WANG Hai2yan 　YE Qing-fu
( Institute of Nuclear Agricultural Sciences , Zhejiang University , Hangzhou , Zhejiang 　310029)
Abstract :A simple HPT2ELISA method was developed for quantitative and qualitative determination of HPT protein. Hpt gene
fragment was inserted into the prokaryotic vector p GEX2KG, and transferred into E. coli BL21 for expression of HPT fusion
protein. After overnight cleavage with Thrombin and purification by liquid chromatography , the final HPT proteins were
obtained with purity of 90 %. The analysis of MALDI2TOF2MS demonstrated that molecular weight is 3914kD. The HPT
protein was used to immunize rabbit for the preparation of polyclonal antibodies with high titer. The specificity of HPT2antibody
(HPT2Ab) was detected by Western blot , which showed specific binding reaction between the antibodies and the purified HPT
protein. Then the double2Ab sandwich ELISA method for HPT protein was established with the sensitivity of 0131 ngΠml. The
method was applied to determine HPT content in Bt transgenic rice. The results showed that the HPT expression level in the
plants of Bt transgenic rice ranged from 15167 to 60112 ngΠgFW during the whole growth , and its content in the flour of the
Bt2rice was 5128 ngΠgFW. Relatively , no HPT protein was detected in non2Bt rice.
Key words :HPT protein ;expression ; purification ; antibodies preparation ; ELISA ;Bt transgenic rice
收稿日期 :2006207210
基金项目 :国家自然科学基金 (20477037)
作者简介 :汪海燕 (19792) ,女 ,山东聊城人 ,博士研究生 ,主要研究方向为分子与环境生物学。
通讯作者 :叶庆富 (19632) ,男 ,浙江开化人 ,博士 ,研究方向为分子与环境生物学、生理物理学、核农学 ,E2mail :qfye @zju. edu. cn　　潮霉素 B 是一种氨基糖苷类抗生素 ,可以破坏各种细胞中核糖体的功能 ,对植物细胞有较强的毒性。 hpt 基因所编码的氨基糖苷242磷酸转移酶 [APH(4)2I ]可将磷酸共价地加到潮霉素 B 的第 4 位上 ,从而使受
861　 核 农 学 报　2007 ,21 (2) :168～172Journal of Nuclear Agricultural Sciences
体细胞产生潮霉素抗性[1 ] 。因此 ,在转基因植物遗传
转化过程中 ,将 hpt 基因作为选择标记基因与目标基
因 (如 Bt 和 CpTI 基因等) 一同导入作物 ,可使转化成
功的植株产生潮霉素抗性 ,以有利于转基因作物的筛
选。
作为目前最有效的选择标记基因之一 , hpt 基因
已被广泛应用于水稻[2 ,3 ] 、玉米[4 ] 、高粱[5 ] 、小麦[6 ] 和棉
花[7 ]等多种转基因抗虫作物。选择标记基因 ( hpt 和
nptII 基因等)的食品和环境安全性 ,与目标基因 ( Bt 基
因等) 和报告基因 ( Gus 基因等) 一样 ,也需要全面评
价[8 ] ,因此 ,建立选择标记基因表达蛋白的快速简便的
检测方法很有必要。杨丽琛等[3 , 9 ] 就 hpt 基因在大肠
杆菌中的融合表达、纯化及抗体制备等已进行了研究 ,
成功获得了融合蛋白 ,并利用该融合蛋白制备了免疫
抗体 ,进而建立了 HPT 蛋白的 ELISA 检测方法。然
而 ,他们的方法尚存在不足之处 ,如用“Western 和Π或
ELISA 检测时 ,融合蛋白抗血清与所带的 GST 标签均
有一定的交叉反应、获得的是融合蛋白 ( GST2HPT) 的
免疫抗体而不是 HPT蛋白本身的免疫抗体”,此外 ,还
存在灵敏度不高等不足。因此 , HPT 蛋白的 ELISA 检
测方法仍有待进一步改进。本实验直接用不带 GST
标签的 HPT纯蛋白免疫家兔 ,制备高效价的多克隆抗
体 ,改进了双抗夹心酶联免疫检测方法 ,并利用该法检
测了不同生育期转 Bt 基因水稻植株中 HPT蛋白的表
达水平以及成熟期稻米中的 HPT蛋白含量。
1 　材料和方法
111 　材料
Escherichia coli BL21 (DE3)2pLys 菌株、克隆有 hpt
片段的 pSilencerTM 3112H1 及表达质粒 p GEX2KG均保存
于本实验室。Taq DNA 聚合酶、琼脂糖均购自上海生
工生物公司 ;限制性内切酶、T4 DNA 连接酶均购自
TaKaRa 公司 ; IPTG (异丙基2β2D2硫代半乳糖苷) 、X2
Gal、DNA 凝胶回收试剂盒为 Invitrogen 公司产品 ;蛋白
质分 子 量 标 准 购 自 Amersham pharmacia biotech ;
Thrombin 凝血酶等购于 sigma 公司。其他化学试剂均
为国产分析纯。DDy2III5 稳压稳流电泳仪为北京六一
仪器 厂 产 品 ; Thermal Cycler PCR 仪 来 自 Hybraid
Express , UK;AKTA explorer 100 蛋白质纯化系统为瑞士
Amersham Pharmacia Biotech 产品 ;SpectrMax 190 高效微
孔板分光光度计为美国 Molecular Devices Corporation 产
品 ;VersadocTM Imaging System 3000 凝胶成像系统为美
国Bio2rad 产品 ;Voyager DE Pro 质谱仪为美国 ABI 产
品。
112 　方法
11211 　GST2HPT 融合蛋白表达质粒的构建和蛋白诱
导表达 　以质粒 pSilence 3112H1 hygro 为模板 ,根据
hpt 基 因 全 长 cDNA 设 计 了 引 物 : 5 ’2
GTTTTCCCAGTCACGAC23 ’, 5 ’2GAGTTAGCTCAC2
TCATTAGGC23’。将 PCR 扩增得到的 hpt 基因片段连
接到 PGEX2KG质粒中 ,将该重组质粒转化入 E. coli
菌株 BL21 (DE3)2pLys 感受态细胞 ,挑取阳性克隆接种
于含 Amp 的LB 培养基中 ,在 37 ℃下振荡培养过夜 ,培
养至 OD600 为 016～018。在 25 ℃条件下 ,重组质粒经
IPTG诱导表达过夜 ,然后收集表达菌体。表达产物主
要以包涵体的形式存在于沉淀中 ,沉淀用 PBS 提取液
( KH2 PO4 012g , Na2 HPO4 ·12H2O 219g , NaCl 810g , KCl
012g ,pH714) 洗涤 2 次。再于 4 ℃条件下 ,用提取液
PBS + 2mmolΠL DTT + 2mmolΠL EDTA 悬浮菌体 ,进行超
声破胞 3min ,12000g 离心 ,取上清液。
11212 　融合蛋白纯化 　将得到的上清液通过 GSTrap
FF 亲和层析柱 (Amersham pharmacia biotech) 纯化 ,得到
洗脱组分融合蛋白。将纯化的 GST2HPT 组份通过
HiPrep 26Π10 Desalting 柱脱盐 (脱盐缓冲液为 50 mmolΠL
Tris + 150 mmolΠL NaCl + 2mmolΠL DTT + 2mmolΠL
EDTA) ,收集滤液 ,加入终浓度为 215mmolΠL 的 CaCl2 ,
同时加入终浓度为 5μgΠml 的 Thrombin 凝血酶酶切过
夜。然后将酶切后的样品通过 GSTrap FF 柱 , 用
50mmolΠL Tris (pH 810) + 10mmolΠL 谷胱甘肽洗脱 ,除去
GST片断 ,收集洗脱液。再将洗脱液通过 HiTrap Q HP
阴离子交换柱 (Amersham pharmacia biotech) ,通过盐梯
度 (50 mmolΠL Tris + 50 mmolΠL NaCl) 洗脱 ,再次进行过
柱脱盐。在 HPT粗蛋白过不同分离柱时 ,分管收集并
进行 SDS2PAGE 检测 (分离胶浓度为 12 %) ,合并含有
HPT蛋白样品管 ,最后获得 HPT蛋白纯品。蛋白浓度
用 Folin2酚法进行测定。
11213 　HPT 抗体的制备 　将 2mg HPT 纯蛋白分 4 次
注射 2 只新西兰雄性成年大白兔。第 2 次加强免疫
14d 后耳部静脉采血用间接 ELISA 方法进行效价检
测[10 ] ,效价达到要求 ,进行最后一次加强免疫 ,14d 后
取全血 ,待血液凝固、血块收缩后 ,于 3000rpm 离心
15min ,取上层血清 , 纯化并分装得到多克隆抗体
S122121 和 S122122 ,保存于 - 70 ℃。
113 　分析测定
11311 　HPT纯蛋白保存期检验 　将新纯化好的、保存
于冰箱 (4 ℃) 24h 和 7d 后的 HPT 蛋白分别进行 SDS2
PAGE电泳 ,观察不同保存时间的检测结果。
961　2 期 HPT2ELISA 方法的建立及其在转基因水稻监测中的应用
11312 　HPT纯蛋白的MALDI2TOF MS 分析　采用基质
辅助激光解吸电离 - 时间飞行质谱法 (MALDI2TOF
MS) 进行了分子量测定。测定时取 200ngΠμl 样品
0175μl (分子量低于 10000) 与基质 (新鲜配制 10 mgΠml
的芥子酸 SA) 等体积混合 ,点于靶上。靶自然干燥后
装入质谱仪进行分析 ,仪器相应的参数为线性模式、氮
激光 (337 nm , 3 ns pulse width , 3 Hz repetition rate) ,离
子延迟提取 1000ns ,质谱信号的单次扫描累加 150 次 ,
正离子谱测定。
11313 　HPT抗体的鉴定 　(1) 抗体效价的测定。将抗
血清分别稀释倍数为 1∶500、1∶2000、1∶5000、1∶10000、1
∶100 ,000、1∶1000 ,000 ,阴性对照加入稀释 1∶5000 的免
疫前血清 ,以 PBS 为空白对照 , BSA 为阴性对照 ,测定
450 nm 处的光吸收值 (OD) 。一般 PΠN > 2 的都可以
判为阳性 (P = 样品 OD2空白 OD ,N = 阴性对照 OD2空
白 OD) ,其中最小的阳性孔的稀释倍数即为血清抗体
的效价。(2)抗体的 Western Blot 测定及其抗体的 HRP
酶标。用纯化好的 HPT 稀释成不同浓度 1158、3116、
6132、12164、25128、50156、101112μgΠml ,抗体 S122122 稀
释 1∶1000 ,进行 Western Blot 测定抗体 S122122 的特异
性。采用改良的过碘酸钠法将辣根过氧化物酶 ( HRP)
耦联到纯化的兔抗 S122121。将多抗 S122122 与酶标后
的标记抗体 S122121 组成双抗夹心检测体系。
11314 　转基因水稻 HPT蛋白的检测
(1)水稻田间培养及地上部和根系 HPT 蛋白的提
取 　供试水稻为浙江大学原子核农业科学研究所成功
转育的含有 hpt 基因的转 cry1Ab 基因水稻 (克螟稻 ,
KMD) [11 , 12 ]及其非转基因亲本 (秀水 11 ,Xiushui 11) 。
按统计学设计田间小区 (小区面积 200 m2 ,3 个重复) ,
分别移栽克螟稻和非转基因亲本秀水 11。在分蘖始
期、分蘖盛期、分蘖末期、孕穗期、抽穗期、灌浆期和成
熟期采样分析 ,每个生育期取样 1 次 ,每次随机取克螟
稻和非转基因亲本各 18 株 (每小区各 6 株) 。用清水
洗净根际土。地上部和根系剪成小段 ,分别放入微型
植物试样粉碎机 ( FZ102) 中 ,用液氮冷冻后磨粉 ,装入
封口袋中放入 - 70 ℃超低温冰箱 ( Revco) 中备用。分
别称取 10010 mg 已磨好的地上部和根系粉于 5ml 离心
管中 ,按 011gΠml 比例加入 110ml 提取液 (50mmolΠL Tris
·HCl + 10 %甘油 + 5mmolΠL DTT + 011 % PMSF + 011 %
Triton X2100) ,室温振荡 (LRH2250A) 1h ,15000g 离心 ,
5min 后取上清液 ,重复提取 3 次 ,合并上清液。
(2 ) HPT2ELISA 方法检测 HPT 蛋白 　将抗体
S122122 按 1∶50 稀释后包被酶标板 ,25 ℃孵育过夜。
加入不同浓度的样品蛋白 ,25 ℃孵育 2h ,洗涤后加入
按 1∶110 稀释的酶标抗体 S122121。25 ℃孵育 2h 后 ,洗
涤并加 TMB 底物显色 15min ,用 2M H2 SO4 终止反应 ,
于 450nm 测 OD 值 ,20min 内完成测定。比较酶标抗体
组成的反应系统的检测效果。每次操作时均以不同浓
度的 HPT蛋白为阳性对照 ,以 BSA 蛋白为阴性对照。
2 　结果与讨论
211 　融合蛋白的诱导表达及纯化
诱导表达后得到的 GST2HPT粗蛋白 ,过 GSTrap FF
柱、HiPrep 26Π10 Desalting 和 Thrombin 酶酶切后过
GSTrap FF 柱及 HiTrap Q HP 离子交换柱逐管收集的目
标蛋白组份 ,进行 SDS2PAGE分析 ,如图 1 所示 ,泳道 1
中的单一条带是过 GSTrap FF 柱后的 GST2HPT 蛋白 ,
分子量约为 64kD ,这表明 GST2HPT融合蛋白的诱导表
达及其纯化步骤是成功的 ;泳道 2～3 是 Thrombin 蛋白
酶酶切后的 GST2HPT 蛋白 ,有 3 条分别是 GST2HPT、
HPT和切掉的 GST;泳道 5～6 为过 HiTrap Q HP 柱去
掉 GST片段的 HPT纯蛋白 ,分子量约 40kD ,其纯度大
图 1 　纯化后的 GST2HPT和酶切后 HPT蛋白的 SDS2PAGE
Fig. 1 　Purified GST2HPT and HPT cleavage
by SDS2PAGE
1 :纯化的 GST2HPT;2～3 :酶切后的 HPT过脱盐柱收集液 ;4 :
蛋白质 Marker ;5～6 :过 HiTrap Q HP柱收的 HPT;
1 :purified GST2HPT;2～3 : desalting solution of HPT cleavage by
thrombin ;41protein Marker ;5～6 :HPT after HiTrap Q HP column
于 90 %。于 4 ℃下保存 14d 后 , HPT 纯蛋 白的 SDS2
PAGE分析结果进一步表明 (图 2) ,不同保存时间的蛋
白电泳均呈现单 1 条带 ,即纯化后的 HPT 蛋白具有一
定的稳定性且能保持较高的纯度。HPT 纯蛋白的
MOLDI2TOF2MS 分析结果表明 (图 3) ,它在质谱中的最
强信号的峰值为 39 ,706 ,推断出的分子量为 3914kD
(即峰值 39 ,706～38114) ,这与 Gritz 和Davies[13 ]报道的
理论分子量相符 ,并且比 Zhuo[14 ] 的结果 38kD 更精确。
上述结果表明 ,本试验采用的 HPT蛋白表达及纯化方
071 核　农　学　报 21 卷
图 2 　保存不同时间的 HPT
Fig. 2 　HPT stored at 4 ℃for different time
1 :新纯化的 HPT;2 :4 ℃保存 24h 的 HPT;
3 :蛋白质 Marker ;4 :4 ℃保存 7d 的 HPT
1 :purified HPT;2 :HPT stored at 4 ℃for 24h ;
3 :Protein Marker ; 4 :HPT stored at 4 ℃for 7d
法是可行的 ,这为后续的 HPT 抗体制备及其 HPT2
ELISA 方法的建立奠定了基础 ,也为同类 GST 融合蛋
白及 HPT蛋白的表达纯化提供了可供借鉴的方法。
212 　HPT抗体的效价测定与 Western Blot 检测
取少量 HPT 纯蛋白免疫产生的多克隆抗体进行
ELISA 检测 ,以免疫前的家兔血清为阴性对照 ,测定结
果抗血清滴度分别达到 1∶106 和 1∶105 。将不同浓度
的 HPT纯蛋白经 SDS2PAGE 电泳后 ,电转移至硝酸纤
维素膜上 ,用多抗 S122122 (1∶1000) 进行 Western 杂交
印迹分析 (图 4)表明 ,在约 39KD 处形成特异的抗原 -
抗体反应条带 ,证实了该抗体可有效地识别 HPT 蛋
白 ,具有较好的特异性。
利用制备的 HPT 蛋白和高效价抗体建立的 HPT2
ELISA 方法 ,对抗原 HPT蛋白进行灵敏度测定时 ,得到
图 3 　HPT纯蛋白的基质辅助激光解吸电离 - 时间飞行质谱分析
Fig. 3 　MALDI2TOF2MS analysis of purified HPT protein
图 4 　Western Blot 分析
Fig. 4 　Western Blot analysis of HPT
1 :3116μgΠml ;2 : 6132μgΠml ; 3 :12164μgΠml ;4 :25128μgΠml ;
5 :50156μgΠml ;6 :101112μgΠml ;7 :1158μgΠml ; 8 :3116μgΠml 最小检测限为 0131ngΠml ,且在 0131～20ngΠml 蛋白浓度的范围内呈良好的线性关系 ( R2 = 01997) 。杨丽琛等[3 , 9 ]利用 HPT融合蛋白获取的抗体构建双抗夹心酶联免疫体系其灵敏度仅为 30ngΠml ,而本试验利用非融合的 HPT纯蛋白抗体建立的 HPT2ELISA 方法 ,具更高的灵敏度 (0131ngΠml) ,可以用于更微量 HPT 样品的检测。为了节省转基因食品中的 HPT 监测时间、提高检测效率和重显性 ,最好采用固相化预包被技术以批量制备 HPT检测试剂盒 ,这有待进一步研究。213 　转 Bt 基因水稻中 HPT蛋白的检测利用上述 HPT2ELISA 法 ,对转 Bt 基因水稻不同生
育期的水稻植株根部、地上部及成熟期稻米的 HPT蛋
171　2 期 HPT2ELISA 方法的建立及其在转基因水稻监测中的应用
白进行定量检测。结果如表 1 所示 ,不同生育期转 Bt
基因水稻植株地上部表达量约为 24159～60112ngΠg·
FW ,根系表达量约为 15167～33113ngΠg·FW。克螟稻
植株地上部 HPT蛋白的表达量 ,前两个时期无显著差
异 ,分蘖末期达到最高 (60112ngΠg·FW) ,该时期后至成
熟期表达量呈现明显下降趋势 ,成熟期 HPT 量最低
24159 ngΠg·FW。而克螟稻根系中 HPT 蛋白的表达量
从分蘖始期到末期无明显变化 ,分蘖末期后呈现上升
趋势 ,抽穗期为最高 (33113ngΠg·FW) ,而灌浆期和成熟
期明显下降。
值得注意的是 ,转基因大米中也可检测到该蛋白
(5128ng HPTΠg·FW ) 。但是相应的非转基因亲本不论
是地上部、根系还是稻米中均检测不到 HPT蛋白的存
在 (低于检测限 0131ngΠml) 。虽然转 Bt 基因稻米中
HPT水平相对较低 ,但其对环境和食品安全性的影响
不容忽视 ,并有待于进一步研究。
表 1 　克螟稻稻米及其植株中 HPT蛋白随发育期的变化
Table 1 　Changes of HPT content in KMD rice and plants from early tiller period to maturing stage ( FW) ( ngΠg)
材料
material
分蘖始期
early tillering
分蘖盛期
flourish tillering
分蘖末期
final tillering
孕穗期
booting
抽穗期
heading
灌浆期
seed filling
成熟期
maturing
克螟稻地上部
KMD shoot
48108 ±2187 39123 ±6120 60112 ±6184 43179 ±1150 30188 ±2182 26151 ±9170 24159 ±5161
克螟稻根系
KMD root
22163 ±4143 21182 ±1187 22182 ±1141 31147 ±9116 33113 ±11102 27130 ±5182 15167 ±5176
克螟稻稻米
KMD flour
Nd 5128 ±0160
亲本地上部
Non2Bt rice shoot Nd
亲本根系
Non2Bt rice root Nd
亲本稻米
Non2Bt rice flour Nd Nd
　　注 :Nd 表示 HPT蛋白含量低于检测限 ( < 0131ngΠml)
Note :Nd means HPT protein content lower than limit of 0131ngΠml
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