全 文 ：文章编号 :100028551 (2006) 032211204
外源 DNA 导入彩棉后 RAPD 分析体系的优化
蔡剑辉1 ,2 　谢丽琼1 　赵惠新1 　李　冠1
(新疆大学生命科学与技术学院 ,新疆 乌鲁木齐　830046 ;新疆科学技术出版社 ,新疆 乌鲁木齐　830001)
摘 　要 :通过 25keV 的 10 ×1015Ar + Πcm2 离子介导将白棉全 DNA 导入彩棉进行 RAPD 分析 ,以改进 CTAB
法抽提叶片总 DNA ,进行随机扩增多态 DNA(RAPD) 分析 ,分别测试了镁离子、dNTP、模板 DNA 含量、引
物浓度、DNA 聚合酶量和牛血清蛋白浓度对反应结果的影响 ,通过各因子的组合研究 ,得出彩棉 RAPD
分析较适宜的扩增条件。应用构建的优化体系对 40 条引物进行筛选 ,选出引物 S53、S176 可使新彩棉 8
号品种引起特异性扩增 ,该随机扩增效果稳定、清晰 , 各材料间图谱差异明显 ,此试验奠定了利用 RAPD
技术对离子束介导外源 DNA 随机片段转化彩色棉品种进行鉴定分析的基础。
关键词 :彩棉 ;Ar + 离子 ;优化体系 ;RAPD
OPTIMIZATION OF RAPD CONDITIONS FROM EXOGENOUS DNA INTRODUCED INTO COLORED COTTON
CAI Jian2hui1 ,2 　XIE Li2qiong1 　ZHAO Hui2xin1 　LI Guan1
( College of Life Science and Technology , Xinjiang University , Urumqi , Xinjiang 　830046 ;
Xinjiang Science and Technology Publishing House , Urumqi , Xinjiang 　830001)
Abstract :The total DNA of white cotton was introduced into colored cotton by low energy beam Ar + ion with 10 ×1015 Ar + Π
cm
2
, 25 keV. Random amplified polymorphic DNA ( RAPD) was used to evaluate DNA variation of these varieties and to
analyze each hereditary variation. It was necessary to determine the optimized system of RAPD reaction before analyzing the
genetic diversity of colored cotton. The genomic DNA of colored cotton was extracted by the improved CTAB method and RAPD
amplification was carried out under the optimal reaction conditions of the content of Mg2 + , dNTP , DNA templates , primers ,
DNA polymerase and bovine serum protein. It was indicated that the species of the Xincai 8 green cotton produced the special
amplification by using the S53 and S176 primers , and the effect of amplification was stable and the bar of electrophoresis was
clear. It demonstrated that the RAPD technique was an effective method in the total DNA introduced into colored cotton by
Ar + ion.
Key words :colored cotton ; Ar + ion beam ; reaction system ; RAPD
收稿日期 :2005207205
作者简介 :蔡剑辉 (19782) ,女 ,江苏泰兴人 ,在读硕士 ,从事离子束诱变彩棉的研究 ,Email : cjh2botany @1631com。李冠为通讯作者 ,Email : guanli @
xju. edu. cn
　　近年来 , 由于方法简便易行 ,而且易获得变异明
显的后代 ,利用离子束介导转入外源 DNA 的技术日益
受到国内外学者的关注。据报道已在多种作物[1～3 ] 中
得到了能稳定遗传的新品系。此项技术与常规育种相
比 ,具有可以打破物种界限和基因连锁 ,实现有性杂交
不可能进行的种间或属间遗传物质的转移 ,缩短育种
周期的特点。1990 年 Williams 等[4 ,5 ] 建立了以 PCR 为
基础的 RAPD 分子标记技术后 ,许多学者利用 RAPD
分子标记技术对棉花、水稻、玉米、大豆等经济农作物
的纯度 ,以及系谱、基因组遗传多样性等进行了研
究[6～9 ] 。本试验是在进行了外源 DNA 随机片段转入
彩棉后其抗病性的生理生化指标测定和纤维长度检测
(已发表)后的分子鉴定 ,以进一步证明抗病性指标及
纤维的改变是由外源基因导入后引起的。
112　核 农 学 报　2006 ,20 (3) :211～214Journal of Nuclear Agricultural Sciences
1 　材料与方法
111 　材料
受体彩棉为新彩棉 8 号 ,绿色 ,种子来自新疆石河
子农科院 ;供体白棉为新海 17 号 ,长绒棉 ,抗枯萎病耐
黄萎病 ,种子来自新疆农业科学院。
112 　方法
11211 　材料处理 　在新疆大学离子束生物工程中心
采用LCD21000 型离子注入机进行离子注入。选取受
体饱满种子 ,剥去胚芽处的部分种壳 ,进行无菌消毒 ,
烘干。用能量为 25keV 的 Ar + 处理胚芽 ,剂量为 10 ×
1015Ar + Πcm2 (经前期的生理生化指标检测后在 6 个剂
量中此剂量下彩棉后代的综合指标有明显提高) 。将
DNA 溶液用 40Ф的细菌滤器过滤除菌。离子注入后
的种子随机分为两组 ,一组立即浸入白棉 DNA (200μgΠ
ml)的导入介质中温育 ,另一组浸入不含 DNA 的 011 ×
SSC中温育 ,作对照 ,28 ℃浸泡 20h ,放入盆中培养。
11212 　枯萎病毒素处理　根部注射枯萎病毒素 ,孢子
浓度为每毫升 4 ×106 ,两叶一心时选取健康植株进行
分析。
11213 　总 DNA 的提取 　实验方法参考文献 [ 10 ,11 ] ,
略有修改。
11214 　DNA 质量检测 　配制 018 % (wΠv) 的琼脂糖凝
胶 ,于 1 ×TBE缓冲液中电泳 ,电泳电压为 75V ,待溴酚
蓝迁移至琼脂糖凝胶的 2Π3 处 ,取出胶 ,观察并照相
(BIO2RAD 凝胶成像系统) 。
11215 　RAPD 反应程序 　使用美国生产的 PE2400 扩
增仪 ,PCR 反应程序 :94 ℃预变性 3min ,94 ℃变性 30s ,
37 ℃退火 45s ,72 ℃延伸 2min ,共 35 个循环 ,72 ℃最后
延伸 10min。扩增产物在 114 % 琼脂糖凝胶中电泳 ,经
溴化乙锭染色 ,紫外灯下观察结果并照相。扩增引物
为 40 种随机引物 ,每种引物重复 3 次。
11216 　RAPD 最佳体系的探索 　对于影响 RAPD 因素
设立反应梯度 ,每个仅改变 1 个 PCR 参数 ,保持其他
条件不变 , 逐个研究每个参数对 RAPD 结果的影
响[12～14 ] 。
2 　结果与分析
211 　DNA质量分析
由图 1 可以看出 :4 种样品模板 DNA 大小一致 ,条
带清晰 ,适合以后的 PCR 试验。
212 　模板 DNA对 RAPD 结果的影响
图 1 　样品总 DNA 电泳图谱
11 新彩棉 8 号 ; 21 新海 17 号 ; 3110 ×1015Ar + Πcm2 剂量处理 ;
4110 ×1015Ar + Πcm2 剂量 ,CK
RAPD 对模板 DNA 的适应性很宽 ,在 25μl 的反应
体系中 ,分别加入 50、100、200ng 的模板 DNA ,结果均
能扩增 (见图 2) ,但 RAPD 对非目的模板 DNA 的污染
反应敏感 ,所以在 DNA 的提取、浓度测定、稀释、扩增
过程中应避免其他来源 DNA 的污染。虽然 DNA 模板
的大小不是影响扩增结果的主要原因 ,但应避免模板
的严重降解 ,否则会使扩增带的数量减少。因此 ,在提
取 DNA 时应尽量避免剧烈或不适当的操作 ,以便获得
大分子量的模板。
图 2 　不同浓度模板 DNA 对 RAPD 扩增的影响
M: 标记物 ;1 ,2 ,3 : DNA 浓度分别为 200、100 和 50ngΠL
213 　引物浓度对 RAPD 结果的影响
本试验中 ,设计了 0108、0116、0124μmolΠL 的引物
梯度 ,结果引物浓度为 0124μmolΠL 时 ,扩增效果最佳
(图 3) ,0108μmolΠL 时由于引物浓度过低 ,引物和模板
的结合几率降低 ,扩增反应过早终止 ,使扩增条带过浅
212 核　农　学　报 20 卷
不能得到观察结果。
图 3 　不同引物浓度对 RAPD 扩增的影响
1 ,2 ,3 表示引物浓度分别为 0108 ,0116 ,0124μmolΠL
214 　MgCl2 浓度对 RAPD 结果的影响
MgCl2 浓度对 RAPD 反应的特异性和扩增效果有
着显著的影响 , Taq 酶的聚合作用需要一定浓度的
Mg2 + 来激活。若 Mg2 + 浓度过低 ,加上 dNTP 和溶液中
EDTA 对 Mg2 + 的螯合作用 ,没有足够的 Mg2 + 来激活
Taq 酶的活性 ,将导致扩增产物减少甚至整个反应失
败。而 Mg2 + 过高 ,反应严谨性降低 ,非特异性产物将
大大增加。本实验参照前人 PCR 组分的含量 ,设计了
Mg2 + 浓度 118、210、215mmolΠL ,反应结果见图 4 ,由扩增
的片段来看 ,低 Mg2 + 浓度扩增信号较弱 ,215mmolΠL 时
RAPD 扩增产物最为清晰。
图 4 　不同浓度的 dNTP及 Mg2 + 对 RAPD 扩增的影响
1、2 和 3 分别为 dNTP 浓度 0120、0116 和 0112mmolΠL ;
4、5 和 6 分别为 Mg2 + 浓度 118、210 和 215molΠL
215 　dNTP浓度对 RAPD 结果的影响
扩增产物的量对 dNTP 的浓度变化很敏感 ,dNTP
在反应中的最终起始浓度在 100～200μmolΠL 间为最
佳。但从本实验结果来看 (图 4 ) , dNTP 浓度为
012mmolΠL 时效果最佳 ,低于此浓度扩增带变弱或消
失。这是由于 dNTP 浓度过低 ,在反应过程中过早地
消耗完 ,此后的循环过程无延伸反应 ,扩增产物将单链
化。
216 　Taq 酶对 RAPD 结果的影响
Taq 酶为 1、115、2U 时扩增效果大致相同 (见图
5) ,但由于商品化的 Taq 酶加入甘油或二甲基亚讽等
物质 , 而这些物质对 Taq 酶活性的增强作用不尽一
致 , 另外 Taq 酶在贮存过程中 ( - 20 ℃) 可能部分活性
丧失 ,所以本研究选用了 115U 的 Taq 酶。
图 5 　不同 Taq 酶的 RAPD 扩增的影响
1 ,2 ,3 表示 Taq 酶单位分别为 1U、115U、2U
图 6 　不同浓度 BSA 对 RAPD 扩增的影响
1 ,2 ,3 ,4 表示 BSA 浓度分别为 0125 ,012 ,0115 ,0110μgΠμl
217 　BSA在 RAPD 分析中的作用
BSA 量的变化对植物 RAPD 扩增的条带数量和强
弱影响较大 ,结果如图 6 所示 :不同浓度的 BSA 对彩
棉的影响不同 ,在彩棉的扩增体系中 ,BSA 浓度为
0125μgΠμl 时对 RAPD 扩增效果的改善最明显。
218 　引物的筛选及扩增结果
从图 7 中可以看到 :在引物 S53 的扩增下 ,3 号较
312　3 期 外源 DNA 导入彩棉后 RAPD 分析体系的优化
1 和 2 号在大于 1kb 处有新条带的增加。从图 8 可以
看出 2 号在大于 5kb 的位置出现 1 条带的缺失 ,同时
在大概 1kb 处出现 1 条和供体相似而受体没有的条
带 ,同时从 3 号 ck 也可以看出同样经过离子束注入但
未经外源 DNA 介导的 DNA 图谱和 4 号较为相似 ,但
也在大约 500bp 处出现 1 条较弱的条带 ,可能是因为
离子注入使某段 DNA 链发生了重组。
图 7 　引物 S53 的 RAPD 扩增图谱
M:标记物 11 受体 (新彩棉 8 号) ;2110 ×1015Ar + Πcm2 剂量 CK;
3110 ×1015Ar + Πcm2 剂量处理 ;41 供体 (新海 17 号)
图 8 　引物 S176 的 RAPD 扩增图谱
11 供体 (新海 17 号) ;2110 ×1015Ar + Πcm2 剂量处理 ;
3110 ×1015Ar + Πcm2 剂量 CK;41 受体 (新彩棉 8 号) .
3 　结语
RAPD 是利用寡聚核苷酸对基因组 DNA 进行的多
态性分析 ,检测区域几乎覆盖了整个基因组 ,因而可以
检测不同品种间的微小差异。从试验结果看 ,4 种材
　　　　　
料间存在着一定的多态性差异 ,即使一些遗传背景相
近的彩色棉材料也存在多态性差异 ,并且由于 RAPD
样品用量少 ,从单株秧苗或单粒种子提取 DNA 已足够
用于扩增 ,因而 RAPD 技术用于彩棉品种外源 DNA 介
导进入受体的鉴定是可行的。由实验结果可知 , 扩增
条件的变化会对 RAPD 图谱产生较大的变化 , 从而影
响 RAPD 分析的准确性 , 而 RAPD 带谱的准确性与稳
定性是利用 RAPD 标记进行遗传多样性分析的前提条
件。以此优化条件对彩棉植株 DNA 进行 3 次 RAPD
分析 ,结果可靠 ,带型稳定 ,证实了外源 DNA 随机片段
通过离子束介导进入了彩棉体内和彩棉 DNA 发生了
整合。
参考文献 :
[ 1 ] 　尹若春 ,吴丽芳 ,吴李君 ,等. 低能离子束介导的遗传转化研究进
展. 生物技术通报 ,2001 , (3) :32～35
[ 2 ] 　吴丽芳 ,余增亮. 离子束注入法获得大豆———小麦分子远缘杂种
及后代的变异分析. 核农学报 ,2000 ,14 (4) :206～211
[ 3 ] 　宋道军 ,王浩波 ,杨　坤 ,等. 离子束处理将外源基因导入西瓜研
究初报. 中国西瓜甜瓜 ,2001 , (2) :2～3
[ 4 ] 　Welsh J ,Mcclelland M. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary
primers. N ucleic Aci ds Research ,1990 ,18 (24) :7213～7218
[ 5 ] 　Williams J G K, Kubelik A R ,et al . DNA polymorphisms amplified by
arbitrary primers are useful as genetic markers. N ucleic Aci ds
Research ,1990 ,18 :6513～6535
[ 6 ] 　BIE Shu , KONG FanLing , et al . Genetic diversityanalysis of
representative elite cotton varieties Welsh J , Mcclelland M.
Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers. Nucleic Acids
Research ,1990 ,18 (24) :7213～7218
[ 7 ] 　卞　坡 ,苏明杰 ,秦广雍 ,等. 离子束介导甘蓝全DNA 转化拟南芥
菜的分子分析. 生物物理学报 , 2003 ,19 (3) :327～331
[ 8 ] 　L I Gengi , Chuanzhen J I , A study of genetic character of cultivar
shiyuan from G. barbadense ×G. thurberi ×G . hi rsut un using
isozyme and RAPD techniques. Acta Genetica Sinica ,2000 ,27 (11) :999
～1005
[ 9 ] 　郭江勇 ,王义琴 ,吴明刚 ,等. 棕色棉和绿色棉遗传多样性的比较
研究. 遗传 ,2004 ,26 (1) :63～68
[10 ] 　Jeff J Doyle , Jane I Doyle. Isolation of plant DNA from fresh tissue .
Focus , 1998 , 12 (1) :13～18
[11 ] 　宋国立 ,崔荣霞 ,王坤波 ,等. 改良 CTAB 法快速提取棉花 DNA.
棉花学报 ,1998 ,10 (5) :273～275
[12 ] 　边才苗 ,李均敏 ,金则新 ,等. 牛血清白蛋白在植物 RAPD 分析中
的作用. 遗传 ,2002 ,24 (3) :279～082
[13 ] 　傅俊江 ,李麓芸 ,徐　湘 ,等. 一种提高 RAPD 技术扩增效率的有
效方法. 遗传 ,2000 ,22 (4) :251～252
412 Journal of Nuclear Agricultural Sciences
2006 ,20 (3) :211～214