全 文 ：文章编号 :100028551 (2008) 022148204
蔺草基因组 DNA 提取方法的比较研究
王忠华1 ,2 　李礼君1 　王焯毅1
(11 浙江万里学院生物技术研究所 , 浙江 宁波　315100 ; 21 浙江大学原子核农业科学研究所 , 浙江 杭州　310029)
摘 　要 :以 16 个蔺草品种实生苗和 4 个蔺草品种组培苗为材料 ,探讨了 CTAB 改良法与 DNA 试剂盒法对
蔺草基因组 DNA 提取质量的影响。结果发现 ,对于同一品种而言 ,CTAB 改良法提取获得的 DNA A260nm
和 OD 值远低于试剂盒提取法 ,前者的 DNA 浓度仅为 0165～4190μgΠml ,而后者则为 5110～32180μgΠml ,
后者为前者的 116～2112 倍。这表明试剂盒提取法更适合于蔺草基因组DNA 的提取。试验还发现提取
材料对基因组 DNA 的质量有显著影响 ,蔺草组培苗优于实生苗。
关键词 :蔺草 ;基因组 DNA ;提取 ;改良 CTAB 法 ;试剂盒提取法
COMPARATIVE STUDY OF EXTRACTION METHOD FOR
GENOMIC DNA IN MAT RUSH
WANG Zhong2hua1 ,2 　LI Li2jun1 　WANG Zhuo2yi1
(11 Institute of Biotechnology , Zhejiang Wanli University , Ningbo , Zhejiang 　315100 ;
21 Institute of Nuclear Agricultural Sciences , Zhejiang University , Hangzhou , Zhejiang 　310029)
Abstract :Seedlings of sixteen mat rush varieties planted in the field , and shoots derived from tissue culture of four varieties
were used to investigate the effects of modified CTAB method and Isolation Kit method on the extraction quality of genomic
DNA. The results showed that A260nm and OD values of DNA solution of same material extracted by modified CTAB method were
lower than those by isolation kit method. The concentrations of DNA solution were 0165～4190μgΠml with the former method
and 5110～32180μgΠml with the latter method. Therefore , it was demonstrated that DNA Isolation Kit method was more
suitable for genomic DNA extraction of mat rush. In addition , it was also found that extraction material had the significant
impact on the extraction quality of genomic DNA ,and the shoots developed by tissue culture were better than seedlings planted
in the field.
Key words : Juncus eff uses L. ; genomic DNA ; extraction ; modified CTAB method ; isolation kit method
收稿日期 :2007207212 　接受日期 :2007209218
基金项目 :浙江省科技厅支撑和引导计划 (2007C22009) 、浙江省科技厅新苗计划 (2007R40G2210005)和宁波市农业择优委托项目 (2004C10004)
作者简介 :王忠华 (19722) , 男 , 浙江开化人 , 副教授、在职博士后 , 主要从事植物种质创新技术研究。Tel :0574288222851 ; E2mail : wang1972 @zwu.
edu. cn
　　蔺草 ( Juncus eff usus L. var. decipiens Buchen) 是灯
心草科灯心草属的多年生宿根性草本植物 ,其草茎可
编织草席、草垫、草扇、草篮等 ,是一种重要经济作
物[1～3 ] 。其生产的成品主要用于居家 ,深受国内外民
众的喜爱。我国蔺草栽培已有 1000 多年的历史 ,目前
蔺草制品主要出口日本。但自 2003 年 7 月 8 日日本
正式实施《种苗修改法》后 ,日本海关对进口的蔺草进
行了外观及 DNA 检测 ,一旦认定是侵犯日本品种专利
权的产品 ,将予以没收和销毁。所以 ,对我国现有的主
要蔺草品种资源进行有效地鉴定显得尤为重要[4～6 ] 。
不同品种实生苗基因组 DNA 的获取是实现分子鉴定
的基础。通过对蔺草基因组中 DNA 的研究 ,可较好地
解决品种纯度问题 ,为蔺草生产的可持续性发展奠定
坚实的资源基础。本试验采用 CTAB 改良法与 DNA
试剂盒法提取蔺草基因组 DNA ,并用琼脂糖凝胶电泳
与紫外分光光度测定相结合的方法进行纯度和浓度的
841　 核 农 学 报　2008 ,22 (2) :148～151Journal of Nuclear Agricultural Sciences
检测 ,以对蔺草的 DNA 提取方法进行分析比较 ,为下
一步开展蔺草种质资源的遗传多样性及分子鉴定研究
奠定基础。
1 　材料与方法
111 　材料
采用宁波高桥种质资源试验基地中的 16 个蔺草
品种实生苗为材料 ,此外鄞蔺 1 号、岗山 3 号、农林 4
号和台湾绿种的组培苗也作为试验材料。
112 　方法
取蔺草实生苗和组培苗 ,剪碎后分别置于研钵中 ,
加入液氮迅速研磨 ,至粉末状或细纤维状 ,取出后置于
10ml 的离心管中备用。
11211 　CTAB 改良法 　CTAB 提取 DNA 法参照
Dellaporta 等[7 ] 和 Saghai2Maroof 等[8 ] 的方法 ,并作适当
修改。操作步骤如下 :称取 5g 蔺草茎秆粉末置于 50ml
离心管中 ;加入 10ml CTAB 提取缓冲液 ,摇匀后 55 ℃水
浴 45min ;加入 10ml 氯仿Π异戊醇 (24∶1) 轻轻混匀 ,
14000rΠmin 离心 10min ;收集上清液 ,加入 800μl 的异丙
醇 ,沉淀 DNA ;加入 400μl 70 %乙醇洗涤 DNA 2～3 次 ;
将 115ml Eppendorf 管倒置于通风柜里 ,使 DNA 尽量干
燥 ;加入 100μl 水 ,溶解 DNA ;置于 4 ℃冰箱保存 ,备用。
11212 　DNA 试剂盒法提取 DNA 　DNA 试剂盒提取法
参照厂家说明作适当修改。具体操作步骤如下 :称取
50mg蔺草组织粉末于 115ml 离心管中 ,用 360μl TE 悬
浮后加 400μl 细胞裂解液 (Cell Lysis Solution) 混匀 ,再
加入 6μl 蛋白酶 K( Proteinase K) 混匀 ,置于 55 ℃水浴
30min ,其间上下混匀 5～6 次 ;再加入 600μl 氯仿混匀 ;
在台式离心机上 10000rΠmin 室温下离心 5min ,取 400μl
上清液置于无菌 115ml 离心管中 ;加入 500μl 沉淀液
(Precipitation Solution) 混匀 ,室温下放置 5min ,10000rΠ
min 离心 5min ; 吸去上清 ,立即加入 100μl 112molΠL
NaCl ,轻轻震荡至 DNA 样品完全溶解 ,加入 3μl RNase
A ,于 37 ℃水浴 10min ;加入 300μl 冰冷乙醇 (100 %) , -
20 ℃下放置 1h。10000rΠmin 离心 5min ,倒掉上清液 ,用
70 %乙醇再洗 1 次。在室温下倒置干燥 10min ,最后用
100μl 无菌双蒸水溶解 ,置于冰箱 4 ℃保存 ,备用。
113 　DNA 浓度与纯度检测
DNA 浓度与纯度的定性检测采用琼脂糖凝胶电
泳的方法 ,操作步骤如下 :取 2μl DNA 样品 ,在 115 %的
琼脂糖下电泳 ,电压为 60V 左右 ,电泳时间为 2 - 3h。
DNA 浓度与纯度的定量检测采用紫外分光光度法。
DNA 的紫外吸收峰在 260nm 波长处。若样品内混杂有
大量的核苷酸或蛋白质等 ,则测定误差较大 ,应设法事
先除去。纯的 DNA 其 260Π280(OD 值)应该≥118[9 ,10] 。
2 　结果与分析
211 　不同方法对蔺草 DNA 提取质量的影响
选取 16 个蔺草品种实生苗 ,分别采用 CTAB 改良
法和 DNA 试剂盒提取法进行蔺草茎杆基因组 DNA 提
取的比较研究 ,结果如图 1、图 2 和表 1 所示。
图 1 　试剂盒提取法的 DNA 电泳图
Fig. 1 　Electrophoresis of DNA extracted by isolation kit method
M:Marker ;1 :俞家蔺草 ;2 :野山草 ;3 :古家桥 ;4 :郑家漕 ;5 :黄种张马 ;6 :茅山 ;7 :石家桥 ;8 :张马村 ;
9 :台湾绿种 ;10 :鄞蔺 1 号 ;11 :岗山 3 号 ;12 :农林 4 号 ;13 :茂林村 ;14 :前虞村 1 号 ;15 :前虞港蔺草 ;16 :野草。图 1、表 1 同。
M: Marker ; 1 : Mat Rush in Yujian ;2 : Yeshan grass ; 3 : Gujia Bridge ; 4 : Zhenjia canal ;5 : Zhangma Yellow ; 6 : Maoshan ; 7 : Stone Bridge village ;
8 : Zhangma village ; 9 : Taiwan Green ; 10 : Yinlin No11 ;11 : Gangshan No13 ;12 : Nonglin No14 ; 13 : Maolin village ;
14 : Qianyu village No11 ;15 :Qianyu Harbor ; 16 :Weed. The same as following Table 1 and Fig11.
941　2 期 蔺草基因组 DNA 提取方法的比较研究
图 2 　CTAB 改良法提取的 DNA 电泳图
Fig. 2 　DNA electrophoresis by modified CTAB method
M:Marker ;1 :野草 ;2 :前虞港蔺草 ;3 :前虞村 1 号 ;4 :茂林村 ;5 :农林 4 号 ;6 :岗山 3 号 ;7 :鄞蔺 1 号 ;8 :台湾绿种 ;9 :张马村 ;
10 :石家桥 ;11 :茅山 ;12 :黄种张马 ;13 :郑家漕 ;14 :古家桥 ;15 :野山草 ;16 :俞家蔺草。
M: Marker ; 1 :Weed ; 2 :Qianyu Harbor ; 3 : Qianyu village No11 ;4 : Maolin village ; 5 : Nonglin No14 ; 6 : Gangshan No13 ; 7 : Yinlin No11 ;
8 : Taiwan Green ; 9 : Zhangma village ; 10 : Stone Bridge village ; 11 : Maoshan ; 12 : Zhangma Yellow ; 13 : Zhenjia canal ;
14 : Gujia Bridge ; 15 : Yeshan grass ; 16 : Mat Rush in Yujian1
　　由表 1 可见 ,利用紫外分光光度计测定的 16 个样
品中 DNA 的浓度 ,CTAB 改良法提取的 DNA A260nm和
OD 值远低于试剂盒法 ,前者的 DNA 浓度仅为 0165～
4190μgΠml ,而后者则为 5110～32180μgΠml ,后者为前者
的 116～2112 倍。表明试剂盒法更适合于蔺草实生苗
基因组 DNA 的提取。
由图 1 和图 2 也可清楚地看出 ,试剂盒提取法获
得的 DNA 样品出现 1 条明显的特异性条带 ,而 CTAB
法提取的 DNA 样品未出现这种结果。这与紫外分光
光度计检测的结果一致。但在试剂盒提取法中 ,品种
14～16 也未出现特异性条带 ,这可能与品种的特异性
有关。笔者正在开展有关试剂盒提取法的条件优化研
究 ,如水浴时间、水浴温度、离心速度与时间及添加
RNase 和蛋白酶 K量等。
由图 1 还可见 ,除样品 9～12 之外 ,其他样品在电
泳时都有明显的拖尾现象 ,这与 DNA 纯度不够和降解
有关。
212 　不同材料对蔺草 DNA 提取质量的影响
不同材料对蔺草基因组 DNA 提取质量的影响见
表 2、图 3 和图 4。
由表 2 可见 ,在测定的样品中 ,4 个品种的组培苗
DNA A260nm和 OD 值均高于实生苗 ,前者的 DNA 浓度为
94185～112125μgΠml ,而后者仅为 49110～64185μgΠml ,
相差近 2 倍。表明组培苗更适合于蔺草基因组 DNA
的提取。这与组培苗本身的组织结构有关 ,它的纤维
含量较低 ,极易粉碎 ,且富含分生组织 ,DNA 含量也比
实生苗丰富。
表 1 　两种提取方法对不同蔺草品种基因组 DNA 质量的影响
Table 1 　The effects of two extraction methods on
genomic DNA quality of Mat Rush
品种序号Π方法
cultivar No1ΠMethod A260nm A280nm OD260ΠOD280 DNA 浓度DNA Concentration(μgΠml)
1ΠCTAB 01048 01101 0148 2140
1ΠIsolation Kit 01101 01078 1144 5105
2ΠCTAB 01056 01048 1116 2180
2ΠIsolation Kit 01133 01091 1146 6165
3ΠCTAB - - - -
3ΠIsolation Kit - - - -
4ΠCTAB 01038 01059 0164 1190
4ΠIsolation Kit 01156 01112 1139 718
5ΠCTAB 01068 01121 0156 3140
5ΠIsolation Kit 01201 01130 1155 10105
6ΠCTAB 01086 01078 1110 4130
6ΠIsolation Kit 01133 01091 1146 6165
7ΠCTAB 01062 01040 1155 3110
7ΠIsolation Kit 01102 01076 1135 5110
8ΠCTAB 01031 01069 0145 1155
8ΠIsolation Kit 01656 01450 1146 32180
9ΠCTAB 01054 01053 1102 2170
9ΠIsolation Kit 01511 01294 1174 25155
10ΠCTAB 01044 01058 0176 2120
10ΠIsolation Kit 01082 01052 1158 4110
11ΠCTAB 01072 01084 0186 3160
11ΠIsolation Kit 01221 01142 1156 11105
12ΠCTAB 01043 01039 1110 2115
12ΠIsolation Kit 01239 01134 1178 11195
13ΠCTAB 01015 01019 0178 0175
13ΠIsolation Kit 01145 01092 1158 7125
14ΠCTAB 01089 01074 1120 4145
14ΠIsolation Kit 01164 01100 1164 8120
15ΠCTAB 01013 01015 0185 0165
15ΠIsolation Kit 01130 01081 1160 6150
16ΠCTAB 01098 01082 1120 4190
16ΠIsolation Kit 01154 01101 1152 7170
注 :蔺草品种序号所代表的品种名称见图 2 ;品种 3 未检测到。
Note : Cultivars names in table 1 were same as Fig. 2 ; DNA was not detected in
cultivar No131
051 核　农　学　报 22 卷
表 2 　不同提取材料对蔺草基因组 DNA 质量的影响
Table 2 　The effects of different materials on
genomic DNA quality of Mat Rush
品种
cultivars
材料
material
A260nm A280nm OD 值
DNA 浓度
DNA concentration
(μgΠml)
鄞蔺 1 号 组培苗 tissue culture 11923 01917 21098 96115
Yinli No11 实生苗 sreedling 01982 01602 11631 49110
岗山 3 号 组培苗 tissue culture 21080 11014 21050 104100
Gangshan No13 实生苗 seedling 11020 01589 11732 51100
台湾绿种 组培苗 tissue culture 21245 11098 21044 112125
Taiwan Green 实生苗 seedling 11145 01712 11608 57125
农林 4 号 组培苗 tissue culture 11897 01935 21030 94185
Nonglin No14 实生苗 seedling 11297 01651 11727 64185
　　由图 3 和图 4 也可清楚地看出 ,组培苗 DNA 出现
一条明显的特异带 ,而实生苗 DNA 也出现明显的条
带 ,但存在拖尾现象 ,这与 DNA 纯度不够有关。这与
紫外分光光度计的检测结果也是一致的。
图 3 　从组培苗提取的 DNA 电泳图
Fig. 3 　Electrophoretogram of DNA extracted from
tissue culture derived shoots
M:Marker ;1 :鄞蔺 1 号 ;2 :岗山 3 号 ;3 :台湾绿种 ;
4 :农林 4 号。图 4 同。
M: Marker ;1 : Yinlin No11 ;2 : Gangshan No13 ;
3 :Taiwan Green ;4 :Nonglin No14. The Same as Fig14.
图 4 　从实生苗提取的 DNA 电泳图
Fig. 4 　Electrophoretogram of DNA extracted from
seedlings planted in the field
3 　讨论
由上述试验结果可看出 ,试剂盒提取法更适合于
蔺草基因组 DNA 的提取。但我们在试验中发现 ,试剂
盒法提取的 DNA OD 值也小于 118 ,这说明所提取的基
因组 DNA 中含有蛋白质等杂质。究其原因 ,主要可能
存在以下几点 :首先 ,蔺草是草本植物 ,细胞壁厚且含
有大量的酚类和多糖等物质[1～3] ,这些多糖类物质很难
完全除去 ;其次 ,由于用液氮研磨蔺草时 ,组织纤维不能
被充分研碎 ,这些都可导致 DNA 样品不纯 ;第三 ,受材
料来源的限制 ,部分样品放置时间过长 ,导致部分 DNA
降解 ,这一点可从表 1 和表 2 明显看出 ,同一品种在不
同时间段提取的 DNA 质量相差很大 ,因此建议试验材
料取回后尽量在短时间内完成提取。
我们在试验中还发现 ,DNA 的提取质量与提取条
件也密切相关 ,如水浴温度与时间、离心速度与时间等
(另文发表) 。
除了提取方法和材料对蔺草基因组 DNA 质量有
较大的影响外 ,其他过程 ,如琼脂糖凝胶电泳 ,对 DNA
质量的检测也有较大影响。琼脂糖凝胶的分辨能力要
比聚丙烯酰胺凝胶低 ,但其分离范围较广。用各种浓
度的琼脂糖凝胶可以分离长度为 200bp～50kb 的 DNA
片段。长度 100kb 或更大的 DNA 片段 ,可通过电场方
向呈周期性变化的脉冲电场凝胶电泳进行分离。因
此 ,检测方法也值得进一步研究与探讨。
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