全 文 ：文章编号 :100028551 (2006) 042282205
秋水仙素处理诱导大青杨 2n 花粉方法的优化
李开隆　肖　静　刘桂丰　李志新
(东北林业大学林学院Π黑龙江省林木遗传育种重点实验室 ,黑龙江 哈尔滨　150040)
摘 　要 :为提高大青杨生长速度 ,采用秋水仙素诱导二倍体花粉技术 ,通过杂交获得大青杨三倍体。采用
不同水培时间处理的单因素试验设计 ,结果表明 ,在水培 4d ,温度 15 ℃～28 ℃,相对湿度 85 %～95 %时 ,
采用 0112 %秋水仙素处理大青杨雄花芽效果最好 ,A4 级 (d > 50μm) 花粉百分数为 412 % ,大花粉粒百分
率 (d > 3715μm)达 1019 % ;利用正交试验设计方法 ,将 011 %、013 %、015 %的秋水仙素用注射、棉浸、棉浸
+ DMSO 法处理水培 2、4、6d 的大青杨雄花芽 ,在雄花枝水培 4d 时 ,注射 013 %秋水仙素 ,诱导获得 A3
级大花粉粒 (3715μm < d < 50μm)最多 ,达 10 % ,表明在雄花枝水培 4d 时 ,注射 013 %秋水仙素是诱导大
青杨大花粉的有效方法。
关键词 :大青杨 ;2n 花粉诱导 ;秋水仙素
OPTIMIZATION OF INDUCING 2n POLLEN GRAIN OF Poupulus ussuriensis Kom BY COLCHICINES
LI Kai2long 　XIAO Jing 　LIU Gui2feng 　LI Zhi2xin
( College of Forestry , Northeast Forestry UniversityΠKey Laboratory of Forestry Genetics and breeding , Heilongjiang province , Harbin , Heilongjiang 　150040)
Abstract :The technique of induction of 2n pollen grain by colchicines was used to improve the growth rate of Poupulus
ussuriensis Kom. The male buds of Poupulus ussuriensis Kom are cultured in water for 0 ,2 ,4 and 6d and with a treatment of
injection of 012 % colchicines. The result showed that pollen percentage of A4 (d > 50μm ) was 412 % , pollen percentage of
A3 (3715μm < d < 50μm) plus A4 was 1019 % under the condition of male buds cultured in water for 4d , 15 ℃～28 ℃and
relative humidity 85 %～95 %. Then in the orthogonal design the male buds are cultured in water for 2 ,4 and 6d ,treated with
011 % , 013 % or 015 % of colchicines by injecting ,cotton dipping and cotton dipping added DMSO , respectively. Significant
influences on 2n pollen formation were found among the treatments. The amount of big pollen grain (A3) reached 10 % , when
male bud injected with 013 % colchicines after 4d water culture , which is the most effective treatment for inducing big pollens.
Key words : Poupulus ussuriensis Kom. ; induction of 2n pollen grain ; colchicines
收稿日期 :2005208224
基金项目 :黑龙江省攻关项目 ( GB01B603 - 04) :教育部科技基础条件平台项目 (505002)
作者简介 :李开隆 (19632) ,男 ,辽宁开原人 ,教授 ,从事杨树遗传育种研究。Tel :0451 82190607 ; Email :likailong @126. com　　植物多倍体育种在速生、优质、抗逆等林木新品种选育中具有很大的潜力。如欧洲山杨 ×美洲山杨( Populus tremula ×P. tremuloids)杂种三倍体的材积生长比其亲本快 1～2 倍 ,纤维长度长 18 % ,密度高20 % ,是一种优良的纸浆原料[1 ] ;9 年生三倍体毛白杨( P. tomentosa)的材积比相同立地环境条件下的二倍体提高 2～3 倍[2 ] ;且年轮平均密度最大为 01474gΠcm3 ,平均高出对照 13169 % ; 木材体积气干干缩率718 % ,比对照降低 112 % ,是纸浆材和胶合板材兼优的 品种[3 ,4 ] ;三倍体桑树的产叶量比对照 (二倍体) 增加3118 % ,桑叶 (干重)蛋白质含量比对照高 4114 %[5 ] ;三倍体或四倍体日本黑松比二倍体具有较高含量的SOD ,能显著阻止脂类过氧化物的形成 ,防止氧化伤害[6 ] 。林木三倍体育种研究始于 20 世纪 30 年代。1935年 Nilsson Ehle 在瑞典发现了一株叶片巨大、生长迅速的巨型三倍体欧洲山杨 ,由此成为人们进行林木多倍体育种研究的开端[7 ] 。而 1937 年 Blakeslee 和 Avery 发
282　 核 农 学 报　2006 ,20 (4) :282～286Journal of Nuclear Agricultural Sciences
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现秋水仙素具有诱导细胞染色体加倍的效果 ,这一发
现从技术上解决了进行染色体加倍的可靠、可行性。
我国学者采用 0. 1 %～0. 5 %的秋水仙素处理毛新杨
的杂种雄花序 ,诱导不减数的 2n 大花粉也取得了成
功 ,并获得了三倍体杂种植株[8 ] 。林木三倍体的选育
可以从自然林分中直接选择天然三倍体[9 ] ,或选出不
减数的天然 2n 花粉授粉杂交获得 ,也可以用人工诱变
不减数的 2n 花粉授粉杂交获得[8 ] ,还可以用四倍体与
二倍体杂交获得[10 ] ,或用秋水仙素诱导雌配子加倍[11 ]
等。朱之悌在 1995 年从上述前 3 条途径获得 31 个毛
白杨三倍体无性系 ,其中天然三倍体 5 个 ,用秋水仙素
诱导的 6 个 ,用选择 2n 大花粉授粉杂交的 20 个[12 ] 。
可见利用人工诱变不减数的 2n 花粉授粉合成三倍体
是杨树三倍体育种的一条有效途径。
大青杨 ( Poupulus ussuriensis Kom. ) 是我国东北林
区的乡土树种 ,具有耐寒性强、生长较快、易繁殖的特
点 ,是营造速生丰产林的主栽品种之一 ,在维系我国东
部地区生态环境和全国木材生产基地的地位中具有特
殊意义[13 ] 。因此以速生、优质、适应性强为育种目标
的大青杨杂交育种逐渐引起人们重视。但以欧洲黑杨
和山海关杨等杨树为亲本与大青杨杂交 ,多数杂种由
于冻害不能适应东北地区生长[14 ] ,而以生长在山地林
区的大青杨香杨不同种源优树为亲本选育出的杂种 ,
适应性较强 ,但生长速度仍没有提高[15 ] 。因此本研究
采用秋水仙素处理大青杨的雄花芽 ,诱导获得 2n 花
粉 ,为大青杨多倍体育种打下基础。
1 　材料与方法
111 　材料
大青杨雄花枝于 2005 年 3 月采集于黑龙江省带
岭林业局 ,用塑料膜包裹 ,保持潮湿 ,运回后保存于低
温的苗木窖中 ,分批取出。4 月于温室内进行水培处
理 ,室温为 15 ℃～28 ℃,相对湿度为 85 %～95 %。
112 　方法
11211 　不同水培时间处理的单因素试验设计 　在水
培时间分别为 0、2、4、6 和 8d 时 ,采用 012 %秋水仙素
溶液注射法[8 ]处理大青杨雄花芽 ,每种处理 10～15 个
雄花芽。
11212 　采用三因素 (水培时间 ,处理方法和秋水仙素
浓度)三水平处理的正交试验设计 　正交试验因子水
平见表 1 ,处理见表 2 ,每种处理 10～15 个雄花芽。
表 1 　正交设计的因子与水平
Table 1 　Factors and levels of orthogonal design
因素
factor
水平 level
1 2 3
雄花枝水培时间
time of culturing male branch in water 2d 4d 6d
秋水仙碱处理方法
treating method of colchicines
注射法
injecting
棉浸法 [16 ]
cotton dipping
棉浸法 + DMSO[17 ]
cotton dipping + DMSO
秋水仙碱浓度
concentrations of colchicines
0. 1 % 0. 3 % 0. 5 %
表 2 　正交设计试验表
Table 2 　Treatments of orthogonal design
编号
code
因素 1(雄花枝水培时间)
factor 1 (time of male branch cultured in water)
因素 2(秋水仙素浓度)
factor 2 (concentrations of colchicines)
因素 3(处理方法)
factor 3 (treatment method)
T3 - 1 2d 0. 1 % 注射法 injecting
T3 - 2 2d 0. 3 % 棉浸法 cotton dipping
T3 - 3 2d 0. 5 % 棉浸法 + DMSO cotton dipping + DMSO
T3 - 4 4d 0. 3 % 注射法 injecting
T3 - 5 4d 0. 5 % 棉浸法 cotton dipping
T3 - 6 4d 0. 1 % 棉浸法 + DMSO cotton dipping + DMSO
T3 - 7 6d 0. 5 % 注射法 injecting
T3 - 8 6d 0. 1 % 棉浸法 cotton dipping
T3 - 9 6d 0. 3 % 棉浸法 + DMSO cotton dipping + DMSO
T3 - 10 (CK) 0 0 0
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11213 　2n 花粉的统计与纯化 　将试验处理所取得的
花粉在 480 倍光学显微镜下用测微尺测量花粉粒大
小。统计时将每处理所得的花粉混合均匀 ,制成 3～5
个临时涂片 ,每片观察 5 个视野 ,按照花粉粒直径 (d)
大小分为 4 级A1～A4 ,其中A1 :d < 25μm ;A2 :25μm < d
< 3715μm ;A3 :3715μm < d < 50μm ;A4 :d > 50μm。大青
杨花粉通常在 15～30μm 范围内 ,将 A1、A2 归类为小
花粉 ,A3、A4 归类为大花粉 ,统计每个处理花粉中的各
级花粉粒数 ,各级花粉粒所占百分率。采用 SPSS11. 0
软件进行方差分析 ,在进行方差分析前将各百分率转
换成反正弦值 ,然后进行统计分析。
2 　结果与分析
211 　不同水培时间的大青杨雄花枝秋水仙素诱导效果
将不同水培时间的大青杨雄花用 012 %的秋水仙
素处理 ,统计的各级花粉所占百分率 (见表 3) ,经反正
弦转换后进行方差分析 (见表 4) 。
表 3 　不同水培时间用秋水仙素诱导雄枝花粉的效果
Table 3 　Effect of pollen induced by colchicines at different time of male branches cultured in water
水培时间
time of cultured in water (d) 0 2 4 6 8
样本数
number of sample
15 25 25 25 —
A1 花粉数和百分率
pollen amount of A1 and percentage
60
(50. 5 %)
78
(41. 3 %)
95
(47. 6 %)
62
(37. 2 %) —
A2 花粉数和百分率
pollen amount of A2 and percentage
48
(49. 5 %)
90
(55. 3 %)
65
(41. 4 %)
75
(56. 0 %) —
A3 花粉数和百分率
pollen amount of A3 and percentage
0
(0. 0 %)
4
(3. 3 %)
12
(6. 7 %)
4
(6. 6 %) —
A4 花粉数和百分率
pollen amount of A4 and percentage
0
(0. 0 %)
0
(0. 0 %)
7
(4. 2 %)
0
(0. 0 %) —
注 :大青杨水培 8d 时 ,花粉已成熟 ,不能进行秋水仙素注射 ;A1 表示花粉粒直径 d < 25μm 范围 ;A2 表示 25μm < d < 3715μm ;A3 表示 3715μm < d <
50μm ;A4 表示 d > 50μm。下表同。
Note : male bud is unavailable for injection with colchicines when it is cultured in water for 8d and pollen has developed into mature ;A1 means a pollen of diameter (d)
< 25μm ;A2 means 25μm < d < 3715μm ;A3 means 3715μm < d < 50μm ;A4 means d > 50μm. The same as following tables.
表 4 　不同水培时间用秋水仙素诱导各级花粉
百分率的方差分析
Table 4 　Variance analysis of pollen percentage of each
class induced by colchicines at different cultured time
指标
index
平方和
sum of squares
自由度
degree of freedom
均方
mean square
F
A1 百分率
A1 percentage
0. 322 3 0. 107 0. 628
A2 百分率
A2 percentage
0. 781 3 0. 260 1. 191
A3 百分率
A3 percentage
0. 098 3 0. 030 0. 847
A4 百分率
A4 percentage
0. 031 3 0. 010 6166033
注 :33在 0101 水平差异显著 ,下表同。
Note :33difference significance at 0101 level , the same as following tables.
　　从表 4 可以看出 ,大青杨雄花枝水培不同时间用
0. 2 %秋水仙素溶液处理 ,对 A3 和 A4 级花粉的形成
有较大影响 ,且对 A4 级花粉的诱导达极显著水平 ,说
明秋水仙素在不同水培时间处理显著影响了花粉的发
育。水培 4d (温度 15 ℃～28 ℃、相对湿度 85 %～95 %)
时 ,采用秋水仙素处理效果最好 , A4 级花粉率为
412 % , 大花粉粒 (A3 + A4)百分数达 1019 %。
212 　秋水仙素的不同浓度和不同处理方法及雄花枝
的不同水培时间对大花粉形成的诱导
对水培 2、4、6d 的大青杨花芽分别以浓度为
011 % , 013 % , 015 %的秋水仙素采用注射法 , 棉浸
法[16 ] ,棉浸法中添加渗透剂[17 ] 等方法处理 ,试验采用
正交设计方法。所得各级花粉及其百分率见表 5 ,方
差分析见表 6。
在三因素三水平的正交实验中 ,水培时间对 A1
和 A3 级百分率的影响达极显著水平 ,秋水仙素的处
理浓度对 A2 级百分率达极显著水平 ,处理方法对 A3
级百分率的影响达到极显著水平 ,各因素对 A4 级花
粉影响虽有差异 ,但没有达到显著水平。对水培时间、
秋水仙素浓度、处理方法所获得的 A3 级大花粉百分
率见图 1。
　　由图 1 可以看出 ,所有采用三因素正交实验秋水
仙素处理的雄花芽其 A3 级花粉比率都较大 ,而对照
这一级比率为 0。从各实验因子不同水平比较看出 ,
482 核　农　学　报 20 卷
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　　　 表 5 　正交试验诱导大青杨各级花粉数及百分率
Table 5 　Amount and percentage of each class pollen induced by orthogonal test
编号
code
样本数
number of
sample
A1 花粉数
pollen amount
of A1
A2 花粉数
pollen amount
of A2
A3 花粉数
pollen amount
of A3
A4 花粉数
pollen amount
of A4
A1 百分率
pollen percentage
of A1 ( %)
A2 百分率
pollen percentage
of A2 ( %)
A3 百分率
pollen percentage
of A3 ( %)
A4 百分率
pollen percentage
of A4 ( %)
T3 - 1 25 20 142 0 0 12 88 0 0
T3 - 2 50 154 293 0 0 34 66 0 0
T3 - 3 25 46 146 2 0 24 75 1 0
T3 - 4 25 14 111 14 3 10 78 10 2
T3 - 5 50 80 288 6 1 21 77 2 0
T3 - 6 50 45 280 13 0 13 83 4 0
T3 - 7 60 101 237 4 0 29 69 1 0
T3 - 8 46 40 170 11 1 18 76 5 1
T3 - 9 25 13 152 2 3 8 89 1 2
T3 - 10 (CK) 34 37 156 0 0 19 81 0 0
表 6 　正交试验三因素处理所得花粉各级百分率方差分析
Table 6 　Variance analysis for pollen percentage in each
class obtained from orthogonal test of three factors
因素
factor
F(A1) F(A2) F(A3) F(A4)
水培时间
time of culturing in water 5. 190
33 0. 296 4. 78033 1. 542
秋水仙素浓度
concentration of colchicines
1. 748 5. 61633 0. 060 2. 182
处理方法
treating method 1. 835 0. 188 5. 121
33 0. 660 花枝水培 4d ,秋水仙素浓度为 013 % ,注射法处理时 ,A3 级花粉百分率均最多。A3 级花粉直径为 3715～50μm ,这属于大花粉粒的范围 ,是我们试验处理诱导的目标。这充分说明采用秋水仙素处理能使染色体加倍 ,使花粉粒中含有多于 1 倍染色体数量的染色体 ,花粉粒直径增大 (见图 2) ,表明雄花枝水培 4d 时 ,浓度为 013 %的秋水仙素注射处理 ,是诱导 A3 级花粉的最优处理组合 ,诱导 A3 大花粉率达 10 % ,A4 大花粉率
达 2 %(见表 5) 。
图 1 　正交试验三种因子诱导 A3 花粉百分率
Fig. 1 　Percentages of A3 pollen induced with different levels of three factors in orthogonal test
A1B1C为处理方法 ,其中 A 为注射法 ;B 为棉浸法 ;C为棉浸法 + DMSO
A ,B , and C mean treating methods. A : injecting ; B : cotton dipping ; C : cotton dipping + DMSO
3 　讨论
通过光学显微镜测定 ,大青杨花粉通常在 15～
30μm 范围内。而据朱之悌院士观测 ,毛白杨雄株花粉
中 ,除那些扁小、空瘪、无核等败育花粉外 ,均可观察到
有大花粉粒的广泛存在 ,并混杂在众多的小花粉粒中 ,
但大花粉粒直径要超过小花粉粒 1 倍以上 ,很容易识
别 ;大花粉粒直径变动在 35～45μm 之间 ,疑为未减数
的二倍体花粉[12 ] 。据 Einspahr 和 Mashkina 经验 ,直径
大于 37μm 的花粉为染色体未减数的 2n 花粉[2 ] 。康向
阳经发芽镜检 ,其染色体数为 38 ,一般的正常毛白杨
单倍体花粉染色体数为 19[18 ] 。因此我们将直径大于
37μm的花粉作为大花粉的标志加以统计 ,得到的 A3
582　4 期 秋水仙素处理诱导大青杨 2n 花粉方法的优化
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图 2 　经秋水仙素处理的不同级别的大青杨花粉
(箭头所指为大花粉粒)
Fig. 2 　The pollens of Populus ussuriensis induced by
colchicines (Those pointed with arrowhead
are big pollens)
和 A4 级花粉极有可能是 2n 花粉。我们将会对这些花
粉作进一步的鉴定。
花粉染色体加倍效果与开始处理时期的减数分裂
阶段密切相关。不同水培时间处理大青杨雄花 ,对 A3
和 A4 诱导效果影响明显 ,水培 4d 是诱导花粉染色体
加倍获得大花粉的最有效处理时间 ,得率为 411 %。
而毛新杨一般只要是在水培 40h 左右 ,花序出露 1Π4
以内 ,花药由淡绿色转为绿黄色以后且未变红之前处
理 ,也就是由细线末期到终变期之前处理 ,均能取得较
好的效果[18 ] 。
用秋水仙碱处理植物材料有许多方法 ,如浸渍法、
棉花球滴浸法、涂抹法、注射法和药剂培养法等[16 ] 。
试验发现 ,注射法处理时针头易刺伤生长点 ,造成生长
点霉烂死亡 ,雄花芽发育不良 ,不能产生花粉 ;羊毛脂
法可以避免对生长点的机械损伤 ,死亡相对少一些 ,随
药剂浓度增加 ,诱导所得大花粉增多 ,但这种方法的缺
点是难使药剂与生长点完全接融 ,诱导效率低 ,另外羊
毛脂较粘 ,所诱导的一点有限花粉被羊毛脂粘住而损
失 ,所以在正交试验中用棉浸法中添加渗透剂来代替
羊毛脂处理方法 ;棉浸法处理所得大花粉效率与对照
相比较高的原因可能是能够使药剂与生长点接触 ,药
剂作用比较充分 ,棉花对花芽保护得较好 ,而使雄花芽
发育良好 ,获得花粉。
人工诱导花粉染色体加倍是树木人工多倍体育种
中最为快捷的途径。Johnsson (1940) 最早采用秋水仙
碱处理欧洲山杨、美洲山杨雄花枝 ,取得了一些 2n 花
粉 ,然后给雌花枝授粉 ,均得到了三倍体植株。此后在
欧洲山杨、美洲山杨、美洲黑杨、香脂杨、毛新杨、银腺
杨、桑树、葡萄等树种中 ,均通过秋水仙素或高温等诱
导方法进行了 2n 雌雄配子诱导 ,得到了三倍体植
株[2～5 ,17～20 ] 。而在大青杨大花粉诱导试验中 ,花枝水
培 4d、秋水仙素为 013 %、注射法处理是诱导 A3 级花
粉的最优处理组合。
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