全 文 ：文章编号 :100028551 (2007) 032217204
利用 SSR 标记分析部分粳稻品种的遗传多样性
宣　云1 　赵　伟2 　宋丰顺2 　易成新2 　倪大虎2 　李　莉2 　杨剑波1 ,2
(11 安徽省农科院原子能农业应用研究所 ,安徽 合肥　230031 ;21 安徽省农科院水稻研究所 ,安徽 合肥　230031)
摘　要 :以我国 16 个粳稻品种为材料 ,包括水稻雄性不育系、恢复系、杂交种以及少量常规稻 ,从分布在
水稻基因组的 12 条染色体上 300 对 SSR 引物中筛选出 14 对多态性丰富、重复性高的引物 ,这些引物在
16 份材料间共扩增出 61 个多态性片段 ,平均每对 SSR 引物可检测到 4136 个等位基因。聚类分析表明 :
品种间遗传相似系数在 0157～0197 之间。生产中应用的 BT型水稻雄性不育系与恢复系分别聚类于不
同的类群 ,遗传关系较远。
关键词 :粳稻 ; SSR ; 遗传差异
GENETIC DIVERSITY ANALYSIS OF SOME JAPONICA RICE VARIETIES WITH SSR MARKERS
XUAN Yun1 　ZHAO Wei2 　SONG Feng2Shun2 　YI Cheng2xin2 　NI Da2hu2 　LI Li2 　YANGJian2bo1 ,2
(11 Institute for Agricultural Application of Atomic Energy , Anhui Academy of Agricultural Sciences , Hefei ,Anhui 　230031 ;
21 Institute of Rice Research ,Anhui Academy of Agricultural Sciences , Hefei ,Anhui 　230031)
Abstract :16 japonica rice ( Oryza sativa L. ) varieties , including 3 cytoplasmic male sterile lines ,7 restorer lines ,3 hybrid
rice and 3 conventional varieties were analyzed by using 14 SSR (simple sequence repeats) primer pairs which comes from 300
SSR that disperse on 12 chromosomes in rice. A total of 61 polymorphic bands were detected among 16 varieties , and each
primer pair detected 4136 alleles on average. Result from cluster analysis shows that genetics similarities among 16 varieties
ranged from 0157 to 0197. The restored lines were clustered separately from the BT2type male sterile lines which are widely
grown in production.
Key words : japonica rice ; SSR ; genetic diversity
收稿日期 :2006208211
基金项目 :安徽省农业科学院院长青年创新基金 (06A1101)
作者简介 :宣　云 (19762) ,女 ,安徽肥东人 ,助理研究员 ,研究方向为辐射生物学及生物技术 ,E2mail :yxuan03 @126. com　　籼稻和粳稻是我国两个主要的栽培稻亚种。2002年我国粳稻面积占当年水稻总面积的 30 % ,近年来 ,粳稻种植面积不断增加 ,有望在 10 年后达到 1000 万公顷 ;且杂交粳稻在近时期内很有可能取得跨越式发展 ,成为我国粮食新的增长点[1 ] 。目前 ,生产上应用的杂交粳稻品种 (组合) 不育系多数是 BT 型配子体不育 ,容易发生生物学混杂和人为混杂 ,从而影响杂交种的纯度。DNA 分子标记技术为揭示品种间遗传差异提供了新的手段。SSR 标记是近年发展的新型 DNA分子标记 ,方法简便、可靠性强、重复性高且品种多态性丰富[2 ] ;而且 ,SSR 标记属共显性分子标记 ,对杂交水稻及其亲本的区分鉴定更具有优势。利用 SSR 分 子标记进行水稻种质鉴定和遗传多样性分析已有较多报道[2～8 ] 。本文以 16 份粳稻材料为研究对象 ,采用 14对 SSR 引物对这些材料的遗传多样性进行分析。1 　材料与方法111 　试验材料16 份粳稻材料 ,包括 BT 型雄性不育系 A23、六千辛 A、皖 A 和恢复系京 636、中花 106、Hp121、C4115、R1229、R218、U160 ,杂交种 Ⅲ优 98、抗优 97、皖 AΠU160以及常规稻秋光、皖粳 97、H02 ,均由安徽省农业科学院水稻研究所提供。
712　核 农 学 报　2007 ,21 (3) :217～220Journal of Nuclear Agricultural Sciences
112 　DNA 提取
取供试材料叶片约 011g ,置于 210ml 的离心管中 ,
加入液氮并用玻璃棒研磨至粉末状。加入 600μl DNA
提取液 ,60 ℃水浴 1h ,每隔 15min 颠倒混匀 1 次 ;加入
等体积的氯仿 + 异戊醇 + 乙醇 (80 + 4 + 16) ,轻缓混
匀 ,室温静置 1h ;以 12000g 转速在 4 ℃离心 15min ,将
上清液转移至另一个 115ml 离心管中 ,加入等体积异
丙醇混匀 ,室温静置 30min ;以 12000g 转速在 4 ℃离心
15min ,弃上清液 ;加入 200μl 70 %乙醇洗涤沉淀 ;离心
10min ,弃去乙醇 ;重复上步 1 次 ;风干残余乙醇 ,将沉
淀溶于 50μl 去离子水中。
113 　SSR 检测
从分布在水稻基因组的 12 条染色体上 300 对 SSR
引物中筛选出 14 对多态性丰富、重复性高的引物 ,引
物序列由上海生物工程技术公司合成。
PCR 反应体系 : 10μl 体系中含 215mmolΠL Mg ++ ,
2mmolΠL dNTP , 正 向 和 反 向 引 物 各 0125μmolΠL ,
10mmolΠL Tris2HCl ,50mmolΠL KCl ,01001 % Gelation ,1U
TaqDNA 聚合酶 ,10ng 模板 DNA。
PCR 反应程序 : 95 ℃变性 5min 后 ,按照 94 ℃60s ,
57 ℃(根据引物推荐的退火温度设定) 60s ,70 ℃90s 的
设置循环 35 次 ,70 ℃延伸 6min ,4 ℃保存。
扩增产物在 6 %聚丙烯酰胺凝胶上电泳 1h ,恒定
功率为 60W ,银染检测。
114 　聚类图构建
数据分析根据扩增产物进行记录 ,1 和 0 分别代
表某 一 扩 增 片 段 的 有 与 无。采 用 UPGMA 法
(unweighted pair2group method with arithmetic average ,算
术平均非加权配组法) ,通过 NTSYS 程序运算构建粳
稻品种树状图。
2 　结果与分析
211 　多态性分析
选出的 14 对引物在 16 份水稻材料间共扩增出 61
个多态性片段 ,每对 SSR 引物平均可检测到 4136 个等
位基因 ,每个 SSR 位点可检测到的等位基因数目为 2
～7 个不等 ( 表 1 ) 。其中引物 RM1986、RM224、
RM5479、RM72、RM2504 和 RM264 在 16 份材料中可分
别检测到 5～7 个等位基因 ,表现出很好的多态性和较
高的检测效率。
212 　不育系和恢复系的 SSR 分析
对 SSR 引物扩增供试水稻基因组的产物进行比
较分析 ,发现引物 RM2504 能将雄性不育系 A23、六千
　　　　表 1 　SSR 标记的基序、染色体位置、等位基因数目
Table 1 　Motif , No. of alleles and chromosome
for SSR markers
位点
microsatllites
染色体
chromosome
核心序列
motifs
等位基因数目
No. of allels
RM336 7 (CCT) 18 4
RM474 10 (AT) 13 4
RM224 11 (AAG) 8(AG) 13 5
RM5473 4 TC 3
RM5479 12 TC 5
RM7102 12 ATAA 3
RM264 8 ( GA) 27 6
RM1986 12 AT 7
RM208 2 CT 3
OSR28 9 AGA 3
RM276 6 (AG) 8A3 ( GA) 33 3
RM2504 10 AT 6
RM6748 4 TAT 2
RM72 8 (TAT) 5C(ATT) 15 7
辛 A 和皖 A 相互间区分 ;引物 RM72 在恢复系京 636、
Hp121、C4115、R1229、R218 等材料扩增出分子量大小
不同的产物 ,引物 RM1986 在中花 106 和 U160 基因组
中扩增出多态性片段 , 因此 , 利用引物 RM72 和
RM1986 组合能有效地将供试恢复系相互间区分 (图
1、2) ;恢复系京 636、中花 106、Hp121、C4115、R1229、R2
18、U160 以及常规稻秋光、皖粳 97、H02 可以通过
RM72、RM1986、RM5479 和 RM264 在水稻基因组中扩
增出的多态性片段组合相互区分 (图 1～4) 。从 SSR
引物扩增图谱可以看出 ,SSR 分子标记能高效地进行
水稻种质区分和鉴定。
图 1 　引物 RM72 扩增的 SSR 图谱
Fig. 1 　Profile of the amplified primer RM72
1 :秋光 ; 2 :晚粳 97 ; 3 :H02 ; 4 :京 636 ; 5 :中花 106 ; 6 :Hp121 ;
7 :C4115 ; 8 :R1229 ; 9 :R - 18 ; 10 ;U160. 图 1～图 4 同
1 :Qiuguang ;2 :Wanjing97 ;3 :H02 ;4 ;Jing636 ;5 :Zhonghua106 ;
6 ;Hp121 ;7 ;C4115 ;8 :R1229 ;9 :R - 18 ;10 ;U160.
The same series No. as following Figures
812 核　农　学　报 21 卷
图 2 　引物 RM1986 扩增的 SSR 图谱
Fig. 2 　Profile of the amplified primer RM1986
图 3 　引物 RM264 扩增的 SSR 图谱
Fig. 3 　Profile of the amplified primer RM264
图 4 　引物 RM5479 扩增的 SSR 图谱
Fig. 4 　Profile of the amplified primer RM5479
213 　杂交种及其亲本的 SSR 分析
在 16 份供试材料间 ,引物 RM72 和 RM264 分别可
检测到 7 个和 6 个等位基因。对这两个引物扩增的电
泳图谱进行分析 ,发现它们在杂交种 Ⅲ优 98 (亲本为
A23 和 R218) 、抗优 97 (亲本为皖A 和 R218) 、皖AΠU160
(亲本为皖 A 和 U160) 扩增出双亲的互补型条带 ,而
且 ,还能将 Ⅲ优 98、抗优 97、皖 AΠU160 以及不育系
A23、皖 A 和恢复系 R218、U160 有效鉴别 (表 2) 。这对
保证三组杂交稻制种质量和杂交稻种子真实性均具有
非常重要的意义。
表 2 　7 份水稻材料的 SSR 扩增结果
Table 2 　SSR amplified result of 7 rice materials
引物
primer
材料 material
A23
A23
皖 A
WanA
R218
R218 U160U160 Ⅲ优 98Ⅲyou98 抗优 97Kangyou97 皖 AΠU160WanAΠU160
0 0 0 1 0 0 1
RM72 1 0 0 0 1 0 0
0 1 0 0 0 1 1
0 0 1 0 1 1 0
0 0 1 0 1 1 0
RM264 0 0 0 1 0 0 1
1 0 0 0 1 0 0
0 1 0 0 0 1 1
注 :1 表示扩增出一条带 ,0 表示未扩增出条带
Notes :“1”means“present”,“0”means“absent”
214 　聚类分析
根据 14 对 SSR 引物所扩增出的 61 个差异产物 ,
对供试粳稻材料的雄性不育系、恢复系和常规稻进行
聚类分析 ,以 0167 的相似系数为标准 ,可将所试材料
分为 3 大类 (图 5) 。第 1 类 :共有 5 份材料 ,包含BT型
3 个雄性不育系 A23、六千辛 A、皖 A ,以及皖粳 97 和
H02。其中 A23 和六千辛 A 分别来源于日本和江苏 ,
皖 A 和皖粳 97 是安徽省农业科学院选育的品种 ; H02
来源于台湾 ,其原始来源可能是日本。3 个不育系之
间遗传差异较小 ,其中不育系六千辛 A、皖 A 之间有着
很近的亲缘关系 ,聚类分析表明两材料间的相似系数
为 0184 ,它们之间存在较大的遗传相似性。第 2 类 :只
有恢复系 Hp121 材料 ,与第 1、3 类各材料表现出较大
的遗传差异。第 3 类 :包含 6 个恢复系材料京 636、中
花 106、C4115、R1229、U160、R218 ,以及来源于日本的常
规稻秋光。其中京 636、中花 106 来源于北京 , R1229
来源于辽宁 ; R218 来源于日本 ,选自轮回 L422 ; C4115
是北方杂交粳稻技术工程中心选育的中晚熟粳型恢复
系。恢复系中花 106、U160 亲缘关系非常近 ,两材料间
的相似系数为 0197 ,具有很高的遗传相似性。聚类分
析表明 :13 份粳稻材料品种间遗传相似系数在 0157～
0197 之间 ,遗传相似系数较大 ,大部分材料之间表现
出较小的遗传差异 ;且雄性不育系与恢复系分别聚类
于不同的类群 ,遗传关系相对较远 ,这在一定程度上反
映了遗传距离同杂种优势呈正相关[6 ,9 ] 。
图 5 　13 个粳稻品种聚类分析图
Fig. 5 　Dendrogram of 13 japonica rice varieties constr2
ucted by SSR data using UPGMA method
材料编号 :1 :A23 ;2 :皖 A ; 3 :六千辛 A ; 4 :秋光 ;5 :皖粳 97 ;
6 :H02 ;7 :京 636 ;8 :中花 106 ;9 :Hp121 ;10 :C4115 ;
11 :R1229 ;12 :R218 ;13 :U160
1 :A23 ;2 :WanA ; 3 :LiuqianxinA ; 4 :Qiuguang ;5 :Wanjing97 ;
6 :H02 ;7 :Jing636 ;8 :Zhonghua106 ;9 :Hp121 ;10 :C4115 ;
11 :R1229 ;12 :R218 ;13 :U160
912　3 期 利用 SSR 标记分析部分粳稻品种的遗传多样性
3 　讨论
传统水稻种质的鉴定 ,主要是依据水稻植株的形
态指标和田间表现性状 ,鉴定方法比较直观 ,不同的技
术人员鉴定往往会得出不同的结果 ,而且需要耗费大
量时间、人力和物力。分子标记技术为在实验室中快
速鉴定种质提供了方法 ,而利用 RAPD 标记进行水稻
种质鉴定的报道较常见[10～15 ] 。SSR 分子标记技术克
服了 RAPD 标记稳定性较差、重复性低等缺点 ,且在品
种间多态性丰富 ,能够有效地区分不育系、恢复系和杂
交种 ,为快速鉴定杂交稻种的真实性以及进行种质资
源纯度分析提供了新途径。本实验从 300 对 SSR 引物
中筛选出 14 对多态性丰富 ,重复性高的引物 ,其中引
物 RM1986、RM224、RM5479、RM72、RM2504、RM264 在
16 份粳稻材料中可检测到 5～7 个等位基因 ,表现出
很好的多态性 ,可以用于种质的区分和种子纯度鉴定。
SSR 标记属共显性分子标记 ,引物在杂交种基因组中
扩增的条带应是双亲的互补型 ;但在实验中我们发现
RM2504 在杂交种抗优 97 扩增的产物只表现出与恢复
系相同的条带 ,而不是双亲的互补型 ,其原因可能是杂
合 DNA 双链表现出对此引物结合的空间干扰或竞争
作用 ,使得在杂交种中本应扩增出的条带受到抑制 ,没
有显现出来。
对所选 13 份粳稻供试材料聚类分析表明 ,恢复系
Hp121 材料单独归为一类 ,与其他材料表现出较大的
遗传差异 ;不育系与恢复系聚类于不同类群。遗传差
异是品种间产生杂种优势的基础。从杂种优势角度考
虑 ,通常认为双亲之间亲缘关系越远 ,杂种优势越显
著。贺浩华等[16 ] 以杂交稻部分雄性不育系和恢复系
为材料 ,通过 SSR 标记实验以及聚类分析表明 ,生产
上常用的一些杂交稻亲本划分在不同的生态类型中 ,
强优势组合亲本间的遗传差异一般较大。李云海等[6 ]
用微卫星 DNA 标记实验数据将生产中主要应用的水
稻雄性不育系与恢复系分别聚类于不同的类群。本实
验聚类分析结果也表明 ,生产上应用的 BT 型雄性不
育系与恢复系划分在不同的类群 ,在一定程度上反映
了双亲的遗传距离同杂种优势的正相关性。因此 ,在
生产上可以利用遗传关系图来指导杂交粳稻的亲本选
配。
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