全 文 ：文章编号 :100028551 (2008) 012032204
抗药性木霉菌株的选育及其与多菌灵的协同作用
田连生
(扬州工业职业技术学院化工系 ,江苏 扬州　225127)
摘 　要 :在含多菌灵药物培养基上 ,采用紫外线重复诱导处理的方法 ,对拮抗性木霉 T21 进行改良 ,筛选
到 5 株在多菌灵 2000mgΠL 浓度下仍能较好生长的具有显著抗性菌株 T2121～T2125 ,通过抗药遗传稳定
性和对灰霉菌拮抗性测定 ,从中选育出性能较优良的抗药性菌株 T2124 ,并与多菌灵协同作用进行防治
黄瓜灰霉病试验。结果表明 :菌和药配比在 9∶1 ,8∶2 ,7∶3 时协同防治效果分别达到 7517 % ,7819 %和
7915 % ;单独使用 T2124 和多菌灵的防效分别为 7015 %和 7117 %。表明菌和药协同作用防治效果明显
高于单独使用的防效。因此 ,在使用木霉 T2124 菌剂防治农作物病害时 ,添加少量的多菌灵 ,可降低植
物病原菌的活性和侵染力 ,提高生物菌剂生防效果。
关键词 :紫外线诱导 ;抗药性木霉 ;抗药性 ;灰霉菌
SCREENING OF RESISTANT Trichoderma STRAINS AND THE
Co2INTERACTION WITH CARBENDAZIM
TIAN Lian2sheng
( Yangzhou Polytechnic Institute Chemical Engineering Department , Yangzhou ,Jiangsu 　225127)
Abstract :Five carbendazim resistance strains T2121～T2125 were induced by UV2light and selected from Trichoderma spp. ,
which could grow well in the medium , concentration Carbendazim below 2000mgΠL. Through a testing of genetic stability of
resistance and antagonism of Botrytis cinerea , an ideal resistant strain T2124 was screened. with a Co2interaction. the
combination of T2124 agent and Carbendazim was used to control Botrytis cinerea of cucumber , the results showed that the
control rote reaches 7517 % , 7819 % and 7915 % by treatment of T2124 and Carbendazim at the ratio of 9∶1 , 8∶2 and 7∶3 ,
respectively. The control rate is only reaches 7015 % and 7117 % , respectively by applving T2124 or Carbendazim alone.
Adding little Carbendazim to Trichoderma T24 to control crops disease , not only reduceds the activity and infection ability of
plant pathogens , but also improved the biocontrol efficiency.
Key words :UV2induction ; resistant Trichoderma ; resistance ; Botrytis cinerea
收稿日期 :2007202211 　接受日期 :2007204209
基金项目 :河北省科技攻关项目 (052413D)
作者简介 :田连生 (19622) ,男 ,河北保定人 ,研究员 ,主要从事植物病害的生物防治研究工作。Tel :13665250865 ; E2mail :lianshengt @163. com　　拮抗性木霉 ( Thichoderma spp . )是目前国内外研究较多的生防菌 ,它对立枯丝核菌 ( Rhizoctonia solani) 、腐霉菌 ( Pythium spp . ) 、灰霉菌 ( Botrytis cinerea) 等多种植物病原菌具有明显的抑制作用。但因生物菌剂对使用环境要求较高 ,单一使用木霉菌防治农作物病害时效果不理想。多菌灵是目前被大量使用的真菌杀菌剂 ,可有效控制多种植物病害 ,但却易产生抗药性。因此有必要将木霉菌剂和多菌灵复合使用 ,以提高木霉菌 剂的生防效果 ,大幅降低化学杀菌剂用量和残留量。但木霉对多菌灵非常敏感 ,为获得抗药性木霉菌株 ,需要对野生菌株加以改良。目前 ,菌株改良主要有诱变育种、原生质体融合以及遗传改造等[1 ,2 ] 手段。1982年 Papavizas[3 ,4 ]以苯菌灵为敏感性标记物 ,采用紫外线诱变对哈茨木霉 ( T. harzianum) 和绿色木霉 ( T. viride)进行诱变 , 得到了对苯菌灵有抗药性的菌株。Harman[5 ]用哈茨木霉通过原生质体融合 ,也得到了性
23　 核 农 学 报　2008 ,22 (1) :32～35Journal of Nuclear Agricultural Sciences
状改善的木霉变异株。本研究通过药物选择性培养驯
化和紫外线重复诱导相结合的方法 ,对本院筛选出的
拮抗性木霉 T21 进行改良后 ,与多菌灵协同作用防治
黄瓜灰霉病 ,为农业生产中生物农药和化学农药的综
合防治提供物质基础。
1 　材料与方法
111 　材料
11111 　试验材料及仪器 　拮抗性木霉菌 ( Trichoderma
spp . ) T21 由本院从河北省多地采集的土样中分离、纯
化 ,后经过与灰霉菌、立枯丝核菌等病原菌对峙培养筛
选得到[6 ] ;灰霉菌 ( Botrytis cinera)由本院从感病黄瓜上
分离、纯化、鉴定得到 ;50 %多菌灵可湿性粉剂 ,日本住
友化学株式会社生产 ;津青 1 号黄瓜种子 ,天津津北蔬
菜研究所生产。所用仪器有血球计数板、电子光学显
微镜 OLYMPUS COVER2018。
11112 　培养基 　PDA 培养基 :土豆 200g ,葡萄糖 20g ,
水 1000ml ,15g 琼脂 ;选择性培养基 :把 PDA 培养基溶
化后 ,按试验需要量加入多菌灵粉剂混合均匀倒入平
板 ;固体培养基 : 麸皮 8 % ,秸秆粉 20 % , (NH4 ) 2 SO4
115 % ,KH2 PO4 0105 % ,MgSO4 01025 % ,水 701425 %。
112 　试验方法
11211 　紫外线重复诱导处理 　在 PDA 上接种木霉菌
株 T21 ,25 ℃恒温培养 5d ,待产生大量绿色分生孢子
后 ,用无菌水轻轻洗刷 ,制成 107 个孢子Πml 悬浮液。
在含多菌灵 10mgΠL 的 PDA 培养基上涂抹 011ml 上述
悬浮液。去盖放在 20W ,波长 25317nm 的紫外灯管下
30cm 处 ,照射 80min 后 ,立即用黑纸包好 ,放入 25 ℃恒
温箱中培养。5 次重复。统计平板上生长菌落数 ,并
将其转移到含多菌灵 10mgΠL 的 PDA 上培养。选取生
长迅速的突变型木霉菌株[7 ] ,待产生大量绿色分生孢
子后 ,按上述方法配制孢子悬浮液 ,涂抹在含多菌灵
20mgΠL PDA 培养基上 ,进行第二次紫外线重复诱导处
理。依此类推 ,逐步提高多菌灵浓度达到 2000mgΠL。
11212 　多菌灵对抗药性菌株的抑制作用 　用打孔器
在培养 2d 的各木霉菌落边缘截取直径 5mm 菌块 ,将
菌块移植到含多菌灵 100mgΠL、300mgΠL、500mgΠL、
800mgΠL、1100mgΠL 浓度选择性 PDA 平板中央 ,一个培
养皿接一个菌饼 ,重复 3 次 ,并设空白平板对照。于
25 ℃恒温培养 3d。每天用十字交叉法测量菌落直径。
按下式计算抑制生长率。
抑制率 = (对照菌落直径 - 处理菌落直径)Π
对照菌落直径 ×100 %
将各抑制率换算成抑制率概率值 ,然后以各处理
中多菌灵浓度的对数值作 x 值 ,以相应处理抑制率的
概率值为 y 值 ,用统计回归方法求出供试杀菌剂的毒
力曲线方程 y = a + bx ,计算 Ec50 (抑制中浓度) ,以
Ec50作为比较各菌株耐多菌灵敏感性强弱的依据。
11213 　抗药木霉菌的遗传稳定性测定 　把 5 株变异
性木霉菌株分别接种在 PDA 平板上 ,25 ℃恒温培养箱
中培养 ,每 7d 转接 1 次 ,连续转接 10 次。观察这些菌
株每次转接后的生长特性 ,并在含多菌灵 1000mgΠL 的
PDA 上培养 ,进行抗药性测定 ,计算多菌灵对突变木霉
菌的生长抑制率。每处理 3 次重复。
11214 　抗药木霉菌生长速率和产孢能力 　将各抗药
性木霉菌株接种在 PDA 平板上 ,25 ℃恒温培养 2d ,用
打孔器沿菌落边缘截取直径 5mm 的菌块接入 PDA 平
板中央 ,置入 25 ℃恒温培养箱中 ,每天测量菌落生长
直径 ,连续 3d ;在 7d 时用无菌水轻轻洗刷 PDA 表面绿
色孢子 ,取 1ml 洗液放入 100ml 盛有无菌水的三角瓶
中 ,在 200rΠmin 的摇床上振荡 20min ,用血球计数板测
产孢量。每处理 3 次重复。
11215 　抗药木霉菌株拮抗性测定 　将各抗药性木霉
菌株分别与灰霉病菌对峙接种在 PDA 平板上两端 ,两
接菌点相距 40mm ,菌块直径 5mm。以单独接种木霉菌
和灰霉病菌为对照。每处理 3 次重复。25 ℃恒温培
养 ,逐日观察各菌落的生长和各木霉菌对灰霉菌的抑
制情况 ,连续观察 7d 并记录。根据下面公式计算各木
霉菌株对灰霉病菌的抑菌作用 : I = 100 - (R2ΠR1) 。其
中 I 为木霉的抑制力 ,R1 为对照灰霉菌菌落直径 , R2
为灰霉菌菌落中心到木霉菌落边缘的距离。
木霉覆盖灰霉菌的分级标准为 : Ⅰ:木霉菌丝占据
培养皿 100 % ; Ⅱ:木霉菌丝占据培养皿 > 2Π3 ; Ⅲ:木霉
菌丝占据培养皿 1Π3～2Π3 ; Ⅳ:木霉菌丝占据培养皿 <
1Π3 ; Ⅴ:病原菌菌丝占据培养皿 100 %。
11216 　协同作用活体测定 　将经过固体培养基发酵
获得抗药性木霉 T2124 的分生孢子粉[8 ] ,和多菌灵可
湿性粉剂配制成重量比为 9∶1、8∶2、7∶3 ,同时作 T2124
菌和多菌灵单独处理试验。分别把各处理药品用无菌
水稀释 800 倍 ,各取 5ml 药液与等量灰霉菌孢子悬浮
液 (浓度 105 个孢子Πml) 混和均匀 ,然后喷施在盆栽黄
瓜苗上。每盆种植 8 株 ,每株留 3 片复叶 ,用药 10mlΠ
株。每处理 4 盆 ,3 次重复以喷施等量无菌水作空白
对照。20 ℃恒温保湿 3d ,调查叶片发病情况 ,计算发
病率和防治效果。防效 = (对照发病率 - 处理发病
率)Π对照发病率。
33　1 期 抗药性木霉菌株的选育及其与多菌灵的协同作用
2 　结果与讨论
211 　紫外线重复诱导处理
紫外线处理对木霉分生孢子有很强致死作用。第
一次照射时间为 80min 时 ,诱导产生对多菌灵有抗药
性突变菌株平均每板 3 株 ,突变率 3 ×10 - 6 。试验结果
表明 ,采用紫外线重复诱变与含药培养基驯化相结合
的方法 ,可以产生抗药性菌株。从含多菌灵 10mgΠL 平
板开始重复诱变 ,提高至 2000mgΠL 仍能正常生长 ,得
到 5 株生长较快的变异菌株 ,分别标记为 T2121～T212
5。
212 　多菌灵对抗药性菌株的敏感性测定
将各浓度下菌落直径计算的抑制率换算成相应的
概率值 ,用统计回归方法求出多菌灵对 5 个菌株的毒
力方程 ,得到 Ec50值。结果见表 1。
表 1 　T2121～T2125 木霉菌株的多菌灵敏感度
Table 1 　The sensitivity of T2121～T2125 Trichoderma
strain on carbendazim
菌株
richoderma
strain
毒力方程
toxicity
equation
R2
Ec50
50 % effective
concentration (mgΠL)
T2121 y = 1. 0270 x + 5. 5194 0. 9616 812. 1
T2122 y = 1. 9740 x + 5. 4373 0. 9553 855. 6
T2123 y = 1. 9904 x + 5. 4672 0. 8996 837. 5
T2124 y = 1. 3287 x + 5. 5938 0. 9786 877. 4
T2125 y = 1. 1647 x + 5. 7818 0. 9808 613. 2
T21 y = 0. 5162 x + 7. 3724 0. 9897 7. 49
　　亲本菌株 T21 Ec50 值为 7149mgΠL ,而选育出的木
霉突变菌株除 T2125 外 ,其余菌株的 Ec50 值均大于
800mgΠL 生长 , Ec50 值比对照普遍提高了 100 多倍 ,其
中 T2124 最高达 87714mgΠL。
213 　抗药性菌株的遗传稳定性测定
由表 2 可以看出 ,紫外线诱导产生的抗药性菌株
T2121～T2125 经连续 10 次转接后 ,其抑制率变化都不很
表 2 　多菌灵对各菌株的抑制率
Table 2 　Inhibitory rate of Trichoderma strains on
Carbendazim PDA plate ( %)
菌株
strain
1 代
original
generation
2 代
2th
generation
4 代
4th
generation
6 代
6th
generation
8 代
8th
generation
10 代
10th
generation
T2121 36. 2 39. 9 41. 2 40. 1 41. 8 43. 9
T2122 11. 9 13. 2 14. 8 14. 3 16. 2 15. 9
T2123 23. 8 24. 0 27. 8 31. 9 33. 6 37. 8
T2124 8. 9 8. 7 9. 0 8. 8 8. 9 8. 9
T2125 18. 2 22. 9 26. 3 24. 0 30. 7 35. 1
大 ,表明变异菌株的抗药性没有随着传代培养而消失。
特别是 T2124 抗药特性更加稳定 ,基本未发生变化。
214 　抗药性菌株生长速率和产孢能力
从各抗药菌株的产孢量和生长速率看 ,T2122 菌株
明显高于其他变异型菌株 , T2124 则接近于 T2122 ,但
T2124 的遗传稳定性和药物敏感性优于 T2122。
表 3 　抗药性菌株生长速率和产孢能力
Table 3 　Growth rate and ability of producing sporus
of Trichoderma strain
菌株
strain
生长速率
growth rate (mmΠd) 产饱量sporus quantity( ×1010Πml)
T2121 18. 3 8. 8
T2122 23. 3 10. 0
T2123 20. 7 9. 1
T2124 22. 8 9. 8
T2125 15. 6 7. 5
215 　抗药性木霉菌株拮抗性测定
试验观察到 :各木霉菌株先在各自的一边 PDA 上
生长 ,随后与灰霉菌落边缘接触 ,并对其产生抑制作
用 ,使其生长减缓最后停止。62h 后各木霉菌对灰霉
菌形成包围 ,木霉菌丝通过重寄生等方式逐渐侵入、直
至最后完全覆盖灰霉菌菌落 ,并在灰霉菌落上产生大
量绿色分生孢子。对峙培养测定结果表明 (表 4) :5 个
变异菌株对灰霉菌均有强烈的抑制作用。其中 ,突变
菌株 T2124 对灰霉菌的抑制率最强 ,达到 98. 6 %。
表 4 　各木霉菌株对灰霉菌的抑制率
Table 4 　Inhibitory rate of Trichoderma strains
on Botrytis cinerea
菌株
strain
R2
(mm)
R1
(mm)
Ⅰ
( %)
覆盖情况
coverage (7d)
显著性 0. 05
significance
at 0. 05 level
T2121 8. 9 28. 8 96. 9 Ⅱ b
T2122 15. 2 28. 8 98. 2 Ⅰ a
T2123 9. 8 28. 8 97. 1 Ⅱ b
T2124 16. 1 28. 8 98. 6 Ⅰ a
Y2125 10. 1 28. 8 97. 1 Ⅱ b
注 : I 为木霉的抑制率 ,R1 为对照灰霉菌菌落直径 ,R2 为灰霉菌菌落中
心到木霉菌落边缘的距离。
Notes : I means the inhibition rate of Trichoderma , R1 means the diameter of
control Botrytis cinerea colony , R2 means the distance between the center and the
edge of Botrytis cinerea colony.
　　通过试验和综合性能评价 ,认为变异木霉菌株
T2124 抗药性、遗传稳定性及对病原菌的拮抗方面性能
更优异。
216 　木霉菌与多菌灵协同作用活体拮抗性测定
活体拮抗性测定试验统计结果见表 5。
43 核　农　学　报 22 卷
表 5 　木霉菌与多菌灵协同作用活体拮抗性测定结果
Table 5 　Resistance test of the Co2interaction
of Trichoderma and Carbendazim
药剂处理
chemicals
compound
treatment
总叶数
(片)
total leaf
numbers
病叶数
(片)
diseased
leaves
发病率
incidence
rate
( %)
防效
control
rate
( %)
显著性 0. 05
significance
at 0. 05 level
9∶1 96 18. 2 19. 0 75. 7 b
8∶2 96 15. 8 16. 5 78. 9 a
7∶3 96 15. 3 15. 9 79. 5 a
10∶0 96 22. 1 23. 0 70. 5 c
0∶10 96 21. 2 22. 1 71. 7 c
0∶0 96 75. 0 78. 1 - -
注 :药剂处理中的数字为木霉菌 T2124 孢子粉与多菌灵可湿性粉剂的有
效成分重量配比。
Notes: The ratio in chemical treatment is effective composition content of
Trichoderma T2124 spore powder and carbendazim wettable powder
　　表 5 表明 ,木霉菌与多菌灵协同作用的防效均好
于它们单独使用的效果 ,且差异显著。在菌和药重量
配比为 8∶2 时 ,对黄瓜灰霉病的防治效果可达到
7819 % ,与 7∶3 配比基本相当。但为减少农药残留 ,还
是选择 8∶2 较好。
3 　结论
本试验采用紫外线多重诱导与药物选择性培养基
驯化相结合的方法 ,成功地筛选出对多菌灵产生高度
抗性的变异性木霉菌株 T2124。其遗传稳定性及对病
原菌的拮抗作用均优于亲本菌株 T21 ,与杨合同等[7 ]
试验结果基本一致。但因本试验是喷雾使用 ,故没有
作变异菌株在土壤定殖能力测定。同时本试验也表
明 :紫外线诱导处理技术仍然是值得利用的菌种改良
技术 ,不仅操作简便易行 ,而且通过扩大突变体的筛选
基数 ,可以得到性能优良的变异菌株。通过对黄瓜灰
霉病活体拮抗性测定 ,表明菌和药协同处理效果优于
单独使用生防菌和杀菌剂的防治效果。在生物防治中
加入少量的化学杀菌剂 ,可以使病原菌菌丝失活 ,生长
速度缓慢 ,致病性降低 ,使靶标病原菌对生物菌剂的侵
害更加敏感 ,从而提高了生物菌剂的防治效果 ,也减少
化学农药使用剂量及残留量。因此 ,选育具有高耐性
且对多种化学农药具有多重抗性的突变型菌株 ,实现
生物农药与化学农药综合协同作用 ,是当前植物病害
防治的一条新途径。
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