全 文 ：文章编号 :100028551 (2004) 032183203
酶标仪在稻米表观直链淀粉含量测定及
突变体筛选中的应用
朱小杨1 　沈圣泉1 　陈文岳1 ,2 　舒庆尧1 3
(11 浙江大学原子核农业科学研究所 ,浙江 杭州　310029 ; 21 杭州农业科学研究所 ,浙江 杭州　310008)
摘 　要 :探索了 96 孔全自动酶标仪 (SpectraMax 190 , Sunnyvale , USA) 在稻米表观直链淀粉含量
(AAC)测定中的应用效果。实验以 IR24、Iri371、Z413、KMD1、秀水 11 共 5 个品种为材料 ,以农
业部部颁标准为参照 ,样本处理后不作定容稀释而直接在 96 孔酶标板上进行显色 ,测定 OD
值 ,根据标样获得的回归等式计算待测样本的 AAC。结果表明 ,酶标法与国标法测得的精度
无显著差异。利用这一体系 ,对 1500 余份协青早B 的M3 (收自M2 单株)种子进行了AAC突变
体筛选及后代跟踪研究 ,获得了 1 份中等 AAC(16 %左右) 突变体 ZXY16。该方法操作简便易
行 ,据此可建立高通量稻米 AAC测定体系。
关键词 :酶标仪 ;稻米 ;表观直链淀粉含量 ;突变体
APPLICATION OF MICROPLATE SPECTROPHOTOMETER IN DETERMINATION OF
APPARENT AMYLOSE CONTENT AND MUTANT SELECTION IN RICE
ZHU Xiao2yang1 　SHEN Sheng2quan1 　CHEN Wenyue1 ,2 　SHU Qing2yao1
(1. Institute of Nuclear Agricultural Sciences , Zhejiang University , Hangzhou , Zhejiang ,310029 ;
2. Hangzhou Agricultural Science Research Institute , Hangzhou , Zhejiang , 310008)
Abstract :The application of automatic microplate spectrophotometer ( SpectraMax 190 , Sunnyvale , USA ) was
investigated for measurement of apparent amylose content (AAC) of rice grains. By using five rice varieties ( IR24 ,
Iri371 , Z413 , KMD1 and Xiushui 11) , a microplate spectrophotometer2facilitated AAC measurement system was
established with similar accuracy to that of standard protocol (NY147288) . In this system , sample was treated as
NY147288 , but directly stained in a microplate and the OD values of each sample were determined by a microplate
spectrophotometer. A regression equation was established by using the AAC and OD value of standard samples , and
the AAC of test samples were estimated by using the equation. The system is simple , accurate and high2throughput .
By using this system , about 1500 progenies of M3 seeds (harvested from individual M2 plants) were screened for
putative AAC mutants , from which one mutant line ZXY16 was developed with a middle AAC of about 16 %.
Key words :microplate reader ; rice ; apparent amylose content ; mutant
收稿日期 :2003212224
基金项目 : :国家十五科技攻关 (2002BA406B04)和浙江省 8812 计划项目资助
作者简介 :朱小杨 (1979～) ,女 ,硕士研究生 ,主要从事诱变方法和诱变育种研究。3 通讯作者国内外大量研究表明 ,表观直链淀粉含量 (apparent amylose content , AAC) 是影响稻米食用和蒸煮品质的重要因子[1 ] 。目前 AAC测定主要是基于碘比色的化学法[2～4 ] 。为适应各种实际需要 ,一些实验室对该法进行了一些改良 ,如杨金华等提出的适应于单 (半)粒测定的改良方法[5 ] 。虽然近红外光谱 (NIR)最近在水稻 AAC 测定中的应用已取得较大进展 ,其优点也十分突出 ,但其精确性仍受一定的限制[6 ,7 ] 。
381　核 农 学 报　2004 ,18 (3) :183～185Acta Agriculturae Nucleatae Sinica
在化学法测定中 ,比色是一费时的步骤 ,而且同一批样本必须在较短时间内完成 ,否则会影响结果的准
确性。为 实 现 比 色 测 定 的 自 动 化 , 有 关 公 司 还 生 产 了 AAC 自 动 分 析 仪 , 如 ARF23
(HIRAMALABORATORIES ,日本) ,但仪器价格昂贵 ,用途单一 ,配备该仪器的单位很少。
近年来 ,一些高通量的微量测定仪器和技术随着分子生物学技术的迅猛发展而不断问世。基于 96
孔酶标板的各种取样、混合、离心和测定装置 ,不但可以提高工作效率 ,因操作时间的极大缩短 ,与时间
相关的实验误差也随之大幅下降。如用于测定光密度值 (OD) 的多孔道酶标仪已能同时对 96、甚至是
384 个微量样品进行测定 ,从而大大简化了比色测定这一关键环节。本实验对酶标仪在测定稻米 AAC
中应用的可行性进行了研究 ,并利用此方法成功地从协青早 B 诱变后代株系中选育到了 1 份中等 AAC
的突变系。
1 　材料与方法
111 　材料
试验用 5 个水稻品种分别为 IR24、Iri371、Z413、KMD1 和秀水 11。用 SATAKE 脱壳机脱壳 ,SATAKE
精米机磨成精米 ,再用旋风式磨粉机 (Udy , Fort Collins ,CO. ,USA) 碾磨成精米粉。测定前样品置于恒湿
器中 1 昼夜以上 ,以使含水量稳定在 1315 %左右。4 个 AAC 标准样品 (标样) 由中国水稻所农业部稻米
及制品监测检验中心提供 ,AAC含量分别为 115 %、1015 %、1912 %和 2710 %。
实验用两台关键仪器 ,一台为 722 型光栅紫外分光光度计 (上海第三分析仪器厂) ,用比色杯比色 ;
另一台为 CA94089 酶标仪 (Microplate Spectrophotometer ,Sunnyvale ,USA) ,可对 96 孔酶标板上的微量样本
的光密度 (OD)进行读取 ,该仪器可以自动排除各样本间因加样量不同造成的误差。
112 　方法
实验在样本处理阶段根据农业部部颁标准进行 ,称取试验样品各 50mg 于具塞刻度试管中 ,分别加
入 015ml 95 %的乙醇和 115ml 3molΠLNaOH溶液 ,在 30 ℃的恒温箱中过夜 (12～16h) ,充分脱脂糊化。次
日轻微混匀后加蒸馏水至 40ml 摇匀。在用酶标板法测定时 ,取混合溶液 10μl 于 96 孔酶标板点样孔中 ,
尔后加 2μl 的 1molΠL 乙酸和 3μl 的 2 %I22KI溶液 ,最后加蒸馏水 185μl ,使每孔体积至 200μl ,显色 10min ,
由酶标仪读取结果 ,波长设置为 620nm。同时采用部颁标准方法 (NY47288) 测定该样品。每次测定均设
3 次重复。
协青早 B 干种子诱变处理于 2000 年在本校辐照中心进行。辐照源为60 Coγ射线 ,处理剂量为
300Gy。于 2000 年冬～2001 年春在海南陵水县育种基地南繁 ,少本丛插 ,混收 M2 种子。2001 年早季于
杭州市农业科学研究所单本栽插 M2 秧苗 ,成熟后按单株收获 5000 余株 M3 种子。
2002 年春 ,取其中 1500 份 M3 材料用酶标法筛选 AAC突变体。为简化手续、提高效率 ,采用糙米粉
代替精米份 ,并在酶标板中设置协青早 B 糙米粉对照 ,每个样品设置 3 个重复。测得 OD 值低于邻近对
照 30 %的单株作为可能的突变体保留 ,作为中等 AAC的候选突变体 ,根据后代表现做进一步重点选择。
表 1 　酶标板法和国标法测定稻米 AAC的效果比较
Table 1 　Comparison of rice AAC determined by
standard protocol and microplate spectrophotometer
品种
variety
酶标法 plate reader1 国标法 standard protocol2
AAC
( %)
变异系数
CV( %)
AAC
( %)
变异系数
CV( %)
IR24 14110 ±1143 10113 14153 ±1171 11178
Iri317 11193 ±0195 7195 12177 ±0143 3134
Z413 12105 ±1107 8188 12147 ±0166 5126
KMD1 20183 ±0122 1104 20180 ±1103 4193
秀水 11
Xiushui
20150 ±2127 11107 20150 ±0136 1176
　　注 :11Y= 111834X - 019229 ;21Y= 110369X - 5148812 　结果与分析211 　AAC测定如表 1 所示 ,用国标法制备试验样品 ,用两种方法测定稻米 AAC时效果相仿 ,两者标准曲线的相关系数为 01996 和 01999。F 检验结果表明 ,所有样品间无论是在 0105 还是在 0101 水平上差异均不显著。但是 ,用酶标板法测得的各品种 AAC 的变异系数稍大于国标法 ,这可能和样本量小存在一定关系(表 1) 。为验证酶标板法的重演性 ,先后做了 2 次独立试验。结果 2 次试验的标准曲线的相关系数分别为
481 核　农　学　报 18 卷
01996 和 01992 ,均达到 0101 显著水平。对试样的测定值所作的差异显著性分析结果表明 ,在 2 次试验
之间 ,各样品 AAC的平均值之间的差异均不显著。
212 　突变体筛选
由于协青早 B 属于高 AAC(25 %左右)材料 ,因此本试验的目的是筛选中等 AAC的突变体。要选到
中等 AAC(16 %～20 %) ,根据经验其 OD 值至少低于对照 30 %以上。在 1500 余份材料中 ,结果共选到 4
份材料 ,其中 1 份的 OD 值仅为对照的 4410 % ,其余 3 份则为对照的 60 %～70 %。据此推算突变频率为
0126 %左右。
213 　纯合突变系选育
OD 值为对照 44 %单株 (Q549)的其余 M3 种子于 2002 冬～2003 春年按单株种于海南 (ZXY16) ,成熟
后按单株收获 M4 ,编号并用国标法进行 AAC测定。结果发现单株之间 AAC 尚存在分离。于是进一步
按系、按单株种植 M4 材料。对收获单株进一步做 AAC 测定 ,从中育成 1 个稳定的中等 AAC (16 %～
18 %)株系 (ZXY162121) 。现已将该突变系正式定名为 ZXY16。根据田间观察 ,该系农艺性状已经稳定 ,
与对照协青早 B 相比 ,除植株略有增高外其他性状几乎没有明显变化。现正将其转育为不育系 ,以评
估其在杂交水稻生产中的利用价值。
3 　讨论
快速、简便、高通量的 AAC 测定技术在水稻品质改良中具有十分重要的意义。目前根据碘蓝反应
测定稻米 AAC的各种标准或简化方法都涉及一系列样本处理和测定 ,群体一大 ,就会影响测定的效率
和精度。此外 ,碘蓝反应是显色反应 ,样品 OD 值会随着时间的延长而变小 ,因此在人工进行比色测定
时 ,每次能测定的样本量受到很大限制。用国标法 ,人工比色测定 96 个样本的 OD 值至少得花 30min ,
而采用酶标仪可在几秒种内完成读取 ,存贮 96 个甚至是 384 个样本的 OD 值。这些在很大程度上解决
了国标法及其他各种改良 AAC测定法中的上述难题 ,并大大节省了时间。另外 ,各种与 96 孔酶标板配
套的先进仪器或设施 ,如多通道移液器的使用 ,可以大大减少实验操作中的工作量 ,加速了筛选突变体
的进程。
协青早A 是过去 10 多年来广泛应用的籼型杂交水稻不育系 ,配制的协优系列杂交组合在浙江和陕
西等省的水稻生产中发挥了重要作用[8 ,9 ] 。同时 ,不断有用协青早 A 配制出抗病、高产甚至超高产组
合 ,如协优 413[10 ] 、协优 7954[11 ]等。但由于这些组合因双亲的 AAC 都偏高 ,因此其稻米的食用品质较
差 ,从而影响其大面积推广。本实验采用协青早 B 的诱变群体为材料 ,一方面是用来验证酶标法测定
AAC的可行性 ,另一方面也是有目的地选择低或中等 AAC 的突变体 ,以便通过回交育成新的优质不育
系。采用低或中等 AAC协青早 A ,有望降低这些高产组合的 AAC ,从而促进其推广。从所得结果看 ,两
大目标都以实现 ,因此表明本文提出的基于酶标仪的 AAC测定方法是有效的。
本试验建立的方法经适当改进后 ,也可适用于其他作物如玉米、高粱等的 AAC 的快速测定 ,同时对
其他品质性状测定方法的改进也具有一定的指导意义。
参考文献 :
[ 1 ] 　舒庆尧 ,徐光华 ,等. 稻米表观直链淀粉含量研究进展. 浙江农业学报 ,1998 ,10 (1) :47～54
[ 2 ] 　Juliano B O , Perez C M , et al . International cooperative testing on the amylose content of milled rice. StarchΠStaerke , 1981 ,33 :157～162
[ 3 ] 　NY147288. 米质测定方法. 北京 :中国标准测定出版社 ,1988 ,4～7
[ 4 ] 　GB7648287. 水稻、玉米、谷子籽粒直链淀粉测定法 ,北京 :中国标准出版社
[ 5 ] 　杨金华 ,毕晨光 ,宋文昌. 半粒稻直链淀粉测定方法的研究及应用. 作物学报 ,1992 ,18 (5) :366～372
[ 6 ] 　舒庆尧 ,吴殿星 ,等. 用近红外反射光谱测定小样本糙米粉的品质性状. 中国农业科学 ,1999 ,32 (4) :92～97
[ 7 ] 　舒庆尧 ,吴殿星 ,等. 用近红外反射光谱测定稻米精米粉样本表观直链淀粉含量的研究. 中国水稻科学 ,1999 ,13 (3) :189～192
[ 8 ] 　许成彪 ,吴树业. 协优 413 栽培试验初报. 温州农业科技 ,1996 ,3 :19～20
[ 9 ] 　王宏锦 ,屈发科. 杂交稻新品种协优 413 待征特性及高产栽培技术. 陕西农业科学 ,1999 ,4 :42～43
[10 ] 　禹盛苗 ,许德海. 杂交水稻新组合协优 413 的生物学特性及其配套栽培技术. 浙江农业科学 ,1996 ,4 :157～160
[11 ] 　李春寿 ,董世钧 ,等. 杂交水稻协优 7954 的选育与应用. 浙江农业科学 ,2002 ,4 :179～181
581Acta Agriculturae Nucleatae Sinica
2004 ,18 (3) :183～185