全 文 ：文章编号 :100028551 (2006) 032187206
高羊茅 DREB 类转录因子基因的分离及鉴定分析
阳文龙　刘敬梅　刘　强　公衍道　赵南明
(清华大学生物技术系 , 北京　100084)
摘 　要 :DREB 转录因子是植物中特有的与低温、高盐和干旱胁迫相关的反式作用因子。为了分离和鉴
定高羊茅 ( Festuca arundinacea Schreb. ) DREB 转录因子基因 ,我们构建了冷诱导 (4 ℃) 的高羊茅 cDNA 文
库 ,用拟南芥 DREB1A 基因作探针筛选该文库得到一个 DREB 类基因 FaDREB1。序列分析表明 ,
FaDREB1 具有一个 651bp 的开放阅读框和 229bp 的 3’非编码区 ,推测的氨基酸序列中含有一个高度保
守的 EREBPΠAP2 结构域。酵母单杂交结果表明 FaDREB1 蛋白能在体外特异结合 DRE 元件 ,并具有转
录激活功能。Northern 杂交结果发现 FaDREB1 基因受低温的诱导表达 ,对高盐、干旱和 ABA 没有反应 ,
说明 FaDREB1 基因在高羊茅植株对低温的应答反应中起重要作用。
关键词 :高羊茅 ;DRE元件 ;转录因子 ;胁迫
ISOLATION AND CHARACTERIZATION OF A DREB2LIKE TRANSCRIPTION
FACTOR GENE FROM TALL FESCUE
YANG Wen2long 　LIU Jing2mei 　LIU Qiang 　GONG Yan2dao 　ZHAO Nan2ming
( Department of Biological Sciences and Technology , Tsinghua University , Beijing 　100084)
Abstract :DREB transcription factors are unique trans2acting factors that involved in low2temperature , high2salt and drought
stress responses in plants. To isolate DREB genes from tall fescue ( Festuca arundinacea Schreb) , we constructed a cDNA
library of cold (4 ℃) stressed F. arundinacea seedlings and identified a cDNA clone , FaDREB1 , by screening the library
with DREB1A gene of Arabidopsis as probe. The FaDREB1 has an open reading frame of 651bp with a 3’2UTR of 229bp .
The putative protein contains a highly conserved EREBPΠAP2 domain. In yeast one2hybrid analysis FaDREB1 protein was
specifically bound to DRE elements and activated the expression of the reporter genes of HIS3 and LacZ. Northern blotting
results indicated that FaDREB1 gene obviously induced by low2temperature , but not by high2salt , drought stress and ABA ,
suggesting an important role of FaDREB1 in response to cold stress in F. arundinacea.
Key words :tall fescue ( Festuca arundinacea Schreb) ; DRE ; transcription factor ; stress
收稿日期 :2005207205
基金项目 :国家“973”项目 ,国家“863”项目 (批准号 2002AA224091)及国家杰出青年基金 (批准号 30125005)
作者简介 :阳文龙 (19742) ,男 ,湖南衡阳人 ,博士后 ,现从事植物分子生物学研究 ,Email : wlyang @mail . tsinghua. edu. cn。公衍道为通讯作者。　　本研究的供试植物为既可作为牧草用 ,又可作为草坪草用的禾本科羊茅属多年生植物高羊茅 ,它原产欧洲 ,在我国新疆、东中部湿润的地区均有分布。作为冷季型草种 ,高羊茅特别适合于亚热带过渡气候区生长。但在严寒的冬季和酷热的夏季 ,高羊茅会生长不良甚至枯死。目前 ,我国生产中使用的高羊茅品种大都靠国外进口 ,很难满足国内畜牧业和草业的发展需 要。因此 ,加快高羊茅品种引种驯化和选育以适应我国气候环境的优良品种 ,就显得非常重要。作者试图利用基因工程技术将 DREB 基因导入高羊茅植株以改良高羊茅品种。转录因子 (transcription factor)是能够与真核基因启动子区的顺式作用元件发生特异性相互作用的 DNA结合蛋白或能与这些蛋白相互作用的相关蛋白质 ,并
781　核 农 学 报　2006 ,20 (3) :187～192Journal of Nuclear Agricultural Sciences
且能特异性地激活或抑制转录的关键因子[1 ] 。细胞的
分化、多细胞生物的形态发育、器官建成 ,以及对外界
刺激的反应都与转录因子的作用密切相关。DREB 转
录因子是植物中特有的与低温、高盐和干旱胁迫相关
的转录因子。DREB 转录因子基因最早被 Liu 等
(1998) 根据已确立的 DRE 元件 ( drought2responsive
element , 与低温、高盐和干旱胁迫应答相关的顺式作
用元件) ,利用酵母单杂交的方法 ,从低温处理的拟南
芥 cDNA 文库中分离得到 , 分别命名为 DREB1A 、
DREB1 B 和 DREB1 C[2 ] 。同时 Thomashow 研究小组也
分离 得 到 了 这 3 个 基 因 , 分 别 命 名 为 CB F1
( DREB1 B ) 、CB F2 ( DREB1 C)和 CB F3 ( DREB1A) [3 ,4 ] 。
研究表明 ,这 3 个基因被 4 ℃低温快速强烈诱导 ,但不
受外源 ABA 的诱导。随后的研究表明 ,DRE 或其核心
序列普遍存在于冷诱导和脱水诱导基因的启动子中 ,
为这类基因的冷诱导和脱水诱导表达所必需[5～10 ] 。
DREB 类 转 录 因 子 也 普 遍 存 在 于 有 花 的 植 物
中[2～4 ,11～17 ] 。进一步的研究表明 ,拟南芥中的 CBFΠ
DREB1 类转录因子通过与 DRE元件特异结合 ,调控一
系列与植株对干旱、低温、高盐等逆境胁迫响应有关的
基因的表达[18 ,19 ] ,其他植物中的研究也得到类似的结
论。对转化有 CB FΠDREB1 基因植株的耐逆性检测表
明转基因植株的抗逆性比对照植株及转单一效应分子
(如 P5CS、SS 等)基因植株的抗逆性显著增强 ,这就为
基因工程改良植物耐逆性提供了一条全新的技术途
径 ,本文报道了高羊茅一个 DREB 类转录因子基因的
克隆和鉴定分析。
1 　材料与方法
111 　植物材料的培养及胁迫处理
将高 羊 茅 ( Festuca arundinacea Schreb. ) 品 种
Cochise 的种子浸泡于 1 %次氯酸钠溶液中消毒 20min
后 ,用无菌水洗 3 遍 ,播于 1Π2 MS 固体培养基 (pH = 5.
8) 上。在 25 ℃、16/ 8h (光Π暗) 的条件下培养 14d ,移出
幼苗。取一部分幼苗分别置于 4 ℃光照培养箱、
250mmolΠL NaCl 溶液或 100μmolΠL ABA 溶液中 ,或超净
工作台上风干进行低温、高盐、ABA 或脱水处理 ,并分
别于处理后 0、1、2、4、8、12h 间隔取样 ,将样品立即用
液氮速冻 ,于 - 80 ℃保存备用。
112 　高羊茅冷诱导 cDNA 文库的构建及筛选
用 Trizol ( GIBCO) 提取冷处理 5h 的高羊茅植株的
总 RNA ,用 poly (A + ) mRNA purification kit ( Promega)
分离出 mRNA , 取 2mg mRNA 用 ZAP Express cDNA
Synthesis Kit 和 ZAP Express cDNA Gigapack III Gold
Cloning Kit (Stratagene) 构建出高羊茅冷诱导 cDNA 文
库。以拟南芥 DREB1A 基因为探针 ,对该 cDNA 文库
进行筛选 ,得到了 3 个阳性克隆。将阳性克隆进行测
序鉴定。序列分析均采用 DNA star 软件。所选用于分
析比对的 CBFΠDREB 蛋白序列来源见下表。
表 1 　CBFΠDREB 蛋白的植物来源、名称及基因库注册号
Table 1 　Plant source , protein name and registration No. in GenBank of CBFΠDREBs
物种
species
蛋白名称
protein name
基因库注册号
registration No. in GenBank
物种
species
蛋白名称
protein name
基因库注册号
registration No. in GenBank
Arabidopsis thaliana AtDREB1A AB007787 Hordeum vulgare
HvCBF1
HvCBF2
AF418204
AF442489
AtDREB1B AB007788 Lycopersicon esculentum LeCBF1 AY034473
AtDREB1C AB007789 Oryza sativa OsDREB1A AF300970
AtDREB1D Q9FJ93 OsDREB1B AF300972
AtDREB2A AB007790 OsDREB1C AP001168
AtDREB2B AB007791 OsDREB1D AB023482
Brassica napus BnCBF7 AF499032 OsDREB2A AF300971
BnCBF17 AF499034 Pennisetum glaucum PgDREB2A AY829439
Capsicum annuum CaDREB1 AY496155 Poa pratensis PpDREB2 AY553331
Capsella bursa CbCBF AY391121 Secale cereale ScCBF1 AF370730
Cynodon dactylon CdDREB1 AY462117 Triticum aestivum
TaDREB1
TaCBF
AF303376
AF376136
Festuca arundinacea FaDREB1 AJ634001 Thellungiella salsuginea TsDREB1
TsDREB2A
AY514018
AY551820
Gossypium hirsutum GhDREB1A AY321150 Zea mays ZmDREB1A AF450481
Helianthus annuus HaDREB2 AY508007
881 核　农　学　报 20 卷
113 　酵母单杂交
将得到的全长 cDNA FaDREB1 的编码区克隆到酵
母表达载体 Yep GAP 的 32磷酸甘油醛脱氢酶基因的启
动子和乙醇脱氢酶 I 基因的终止子之间 ,然后将其分
别转化到两种具有报告基因 HIS3 和 acZ 的酵母菌株
中 ,一种菌株的报告基因前插有 3 个串连重复 rd29A
基因的 71bp DRE(TACCGACAT)序列 (野生型 DRE) ,另
一种菌株的报告基因前插有突变的 3 个串连重复
rd29A 基因的 71bp mDRE ( TATTTTCAT) 序列 (突变型
DRE) 。观测转化的重组酵母菌株在含 3 - AT的 SD 选
择培养基 (缺 His、Ura、Tyr) 上的生长情况以确定该基
因的产物是否能结合 DRE元件并具有转录激活功能。
114 　FaDREB1 在不同逆境胁迫下的表达分析
用 Trizol ( GIBCO)提取高羊茅植株的总 RNA ,将每
泳道 40μg 总 RNA 转移到尼龙膜上 ( Hybond N + ,
Amersham) ,以α232P2dCTP 标记的探针 ,在 65 ℃下杂交
18h 后洗膜。分别用 2 ×SSC , 011 % SDS 和 1 ×SSC ,
0. 1 %SDS ,42 ℃下洗膜 15min ,再用 1 ×SSC , 011 %SDS ,
55 ℃下洗膜 15min。最后将膜置暗盒中 ,压上 X 光片 ,
在 - 70 ℃放射自显影 7～14d。
图 1 　FaDREB1 与拟南芥、水稻和玉米的 DREB1 类蛋白的全序列比较
Fig. 1 　Comparison of the deduced amino2acid sequence of FaDREB1 with DREB1 proteins from
Arabidopsis thaliana , rice and maize
下划线表示蛋白的 EREBPΠAP2 DNA 结合区域 , ★表示在 DNA 结合域中高度保守的两个氨基酸残基 , ⊥表示β2折叠区域 , 表示α2螺旋区域。
The conserved EREBPΠAP2 domains are underlined , the asterisks mark the two residues which have been especially identified in Arabidopsis , predictedα2helixes andβ2
sheets were also indicated
981　3 期 高羊茅 DREB 类转录因子基因的分离及鉴定分析
2 　结果与分析
211 　FaDREB1 基因的分离与序列分析
用拟南芥 DREB1A 为探针对 4 ℃冷诱导 5h 的
cDNA 文库进行筛选 ,得到 3 个阳性克隆。序列分析表
明 ,这 3 个阳性克隆的 cDNA 为同一个基因。将最长
的 cDNA 命名为 FaDREB1 ,并提交到 Genebank ,注册号
为AJ634001。FaDREB1 具有一个 651bp 的开放阅读框
和 229bp 的 3’非编码区 ,它编码一个具 216 个氨基酸
残基的多肽 ,分子量约为 2316 kD ,等电点为 4175。根
据推测的氨基酸序列 ,FaDREB1 蛋白含有一个高度保
守的 EREBPΠAP2 结构域。FaDREB1 的 EREBPΠAP2 结
构域 与 HvCBF2、OsDREB1B、ScCBF1 和 TaCBF 的
EREBPΠAP2 结构域的一致性较高 , 分别为 7816 %、
8010 %、8219 %、7711 %。与其他 DREB 转录因子一样 ,
在 FaDREB1 的 EREBPΠAP2 结构域也具有 3 个β2折叠
和 1 个含 18 个氨基酸残基的α2螺旋 (图 1) ,在β2折叠
中具有几个非常保守的氨基酸残基 ,它们可能对 DNA
的结合活性很关键 , 而保守的α2螺旋区段可能对
FaDREB1 与其他蛋白的相互作用很重要[2 ] 。
图 2 　不同植物来源的 CBFΠDREB 类蛋白的进化关系分析
Fig. 2 　Phylogenetic tree representing the relationship
between F. arundinacea FaDREB1 and
other plant CBFΠDREBs
对不同植物 DREB 转录因子的亲缘关系的分析
表明 (图 2) ,FaDREB1 被归类在单子叶植物DREB 转录
因子类中 , FaDREB1 与 ScCBF1、TaCBF、OsDREB1B 和
HvCBF2 的关系较近。FaDREB1 与双子叶植物的
DREB 转录因子如拟南芥的 DREB 和油菜等的 DREB
的亲缘关系较远。
212 　FaDREB1 的体外 DRE - 结合活性和转录激活功
能的检测
利用酵母单杂交的方法 ,将 FaDREB1 cDNA 的编
码区插入到酵母表达载体 Yep GAP 中 ,将其分别转化
到含报告基因 HIS3 和 LacZ 的野生型 DRE 或突变型
DRE的酵母菌株中 (如图 3) ,观测转化的重组酵母菌
株在含不同浓度的 32AT 的 SD 选择培养基 (缺 His、
Ura、Tyr) 上的生长情况。结果发现含有 FaDREB1
cDNA 的编码区的野生型 DRE 酵母菌株能在 10、20、
30、40mmolΠL 的 3 - AT的 SD 选择培养基上生长良好 ,
而含有 FaDREB1 cDNA 的编码区的突变型 DRE 酵母
菌株在 10、20、30、40mmolΠL 的 32AT 的 SD 选择培养基
上不能生长。这表明 FaDREB1 具有特异结合 DRE 元
件的活性和转录激活下游基因表达的功能。
213 　FaDREB1 基因在不同逆境胁迫下的表达分析
如图 4 所示 , FaDREB1 只受低温的特异诱导 ,且
在低温处理较长的时间内保持较高的表达水平 ,而对
脱水、高盐均没有响应。说明 FaDREB1 基因在高羊茅
植株对低温胁迫反应中起重要的保护作用。跟拟南芥
和水稻中的 DREB1 基因一样 , FaDREB1 均不受 ABA
诱导表达。
3 　讨论
EREBPΠAP2 类转录因子是植物中特有的一大类
转录因子 ,根据结构和功能的不同 ,可将其分为 AP2
亚族、DREB 亚族、EREBPΠERF 亚族和 RAV 亚族。其
中 AP2 亚族具 2 个 AP2ΠEREBP 结构域 ,其余亚族均含
1 个 AP2ΠEREBP 结构域。许多研究表明 ,它们与植物
发育、激素、病原反应以及低温、高盐和干旱胁迫应答
等密切相关。如玉米 IDS1 (AP2 亚族)决定玉米穗状花
序分 生 组 织 的 发 育 和 成 花 的 数 量[20 ] ; 拟 南 芥
AtEREBP124 等 ( EREBP 亚家族) 与植物激素乙烯、病
原、低温、干旱、高盐及水杨酸等的分子应答有关[21 ] ;
拟南芥和水稻等的 DREB 类转录因子与植物对低温、
高盐和干旱胁迫应答密切相关[3 ,4 ,17 ] 。本研究从高羊
茅中分离和鉴定出的 FaDREB1 基因 ,其推测的氨基酸
序列具有 DREB 类转录因子典型的结构特点 ,与水稻
的 OsDREB1 B 基因的同源性比较高 ,并且 FaDREB1
基因的产物在体外能特异结合 DRE 元件 ,激活报告
091 核　农　学　报 20 卷
　　　
图 3 　FaDREB1 的酵母单杂交实验分析
Fig. 3 　Yeast one2hybrid analysis of FaDREB1
A :FaDREB1 的酵母单杂交原理 ;B :FaDREB1 的酵母单杂交结果 ;1、2 分别表示转化有 AtDREB1A 和 FaDREB1 的含 DRE 元件的酵母菌株在不同浓
度 32AT的 SD 培养基上的生长情况 ;3、4 分别表示转化有 AtDREB1A 和 FaDREB1 的含 mDRE元件的酵母菌株在含不同浓度 32AT的 SD 培养基上的
生长情况
A : FaDREB1 cDNA was cloned into the yeast expression vector Yep GAP and used for transformation into DRE yeast and mDRE yeast . B : heterogenous expression
of the FaDREB1 gene in yeast strains carrying the dual reporter genes under the control of the DRE motifs or mDRE motifs. The expression of AtDREB1A in yeast
was used as control . The transformants were examined for growth in the presence of 32AT. 1 , 2 stand for AtDREB1A and FaDREB1 in DRE yeast , 3 , 4 stand for
AtDREB1A and FaDREB1 in mDRE yeast
图 4 　FaDREB1 基因在低温 (4 ℃) 、干旱、盐胁迫
(250mmolΠL NaCl) 和 ABA (100μmolΠL) 处理下的表达分析
Fig. 4 　FaDREB1 expressions in seedlings of F.
arundinacea in response to cold (4 ℃) , drought ,
salt (250mmolΠL NaCl) stress and ABA
treatment (100μmolΠL)
0 , 1 , 2 , 4 , 8 , 12h 分别表示不同的处理时间
0 , 1 , 2 , 4 , 8 , 12h represent the time of different treatments on F.
arundinacea
基因的表达 ,说明 FaDREB1 是高羊茅中的 DREB 类转
录因子。
FaDREB1 基因在不同逆境胁迫下的表达分析表
明 ,低温特异诱导 FaDREB1 基因的表达 ,而 ABA 对
FaDREB1 基因没有影响 ,说明 FaDREB 基因在高羊茅
植株对低温的应答反应中起重要作用 , FaDREB1 基因
的启动子区没有对 ABA 反应的顺式作用元件 ABRE。
与 AtDREB1 B 和 OsDREB1 B 一样[2 ,3 ] , FaDREB1 基因
只受低温特异诱导 ,暗示 FaDREB1 基因可能具有类似
AtDREB1 B 和 OsDREB1 B 基因的功能。
许多研究表明 ,DREB 类转录因子通过与 DRE 调
控元件特异结合 ,能促进许多与低温、高盐和干旱相关
基因的表达。迄今为止 ,在拟南芥中约有 38 个基因受
DREB1A 的调控 ,这些基因的产物包括转录调控因子、
磷脂酶 C、RNA 结合蛋白、糖转运蛋白、碳水化合物代
谢相关蛋白、LEA 蛋白、冷诱导蛋白、渗透保护生物合
成蛋白、蛋白酶抑制因子等[22 ] 。其他 DREB 类转录因
191　3 期 高羊茅 DREB 类转录因子基因的分离及鉴定分析
子的转基因实验也表明 ,转基因植株中许多逆境胁迫
相关基因的表达得到增强 ,转基因植株的耐逆性得到
很大提高 ,这可能是逆境胁迫条件下 DREB 的目标基
因的编码产物共同起作用的结果 ,因而转 DREB 类基
因比转其他单一功能基因对转基因植株耐逆性的改良
效果更好。DREB 转录因子超表达在提高转基因植株
耐逆性的同时 ,还会产生生长迟缓、植株矮化、产量下
降等不良影响 ,这种负效应可以通过用胁迫诱导启动
子或其他条件性启动子启动 DREB 基因的表达来加以
克服。但在基因工程改良草坪草耐逆性方面 ,这种负
效应反而有利 ,因为在草坪的管理中 ,为保持其美观 ,
需要经常对草坪进行修剪 ,导入 DREB 基因后既能增
强转基因草坪草的耐逆性 ,还可减少草坪的修剪次数 ,
节约养护费用[23 ] 。因此 ,将 FaDREB1 基因转入高羊
茅或其他草坪草中 ,可望得到抗逆性增强、株型矮化的
理想草坪草株系 ,这项工作我们正在进行中。
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