全 文 ：　文章编号 :100028551 (2002) 0420208204
等离子体处理选育之江菌素产生菌
施跃峰　桑金隆　竺莉红　吴文娟
姚杭丽　夏湛恩　黄文彩
(浙江省农业科学院微生物研究所 ,浙江　杭州　310021)
摘 　要 :以之江菌素产生菌玫瑰黄链霉菌杭州亚种 93 - 15 - 32 菌株为出发菌 ,研究离
子注入微生物的诱变效应。结果表明 ,各剂量 N+ 离子注入之江菌素产生菌的总变
异率达 4214 %～7310 % ,其中正变异率为 518 %～3812 %。通过 9 批诱变实验 ,筛选
到 1 株高产菌株 97249 ,效价比出发菌株提高 4 倍多。通过 5 代传代 ,产素性能能稳
定遗传 ,并通过了 400L 发酵罐中试 ,表明离子注入处理是一种有潜力的微生物诱变
育种新方法。
关键词 :离子注入 ;诱变 ;链霉菌 ;之江菌素
收稿日期 :1999211212
基金项目 :国家自然科学基金及国家九五攻关资助项目
作者简介 :施跃峰 (1963～) ,男 ,浙江永康人 ,浙江省农科院微生物研究所研究员 ,副所长。从事农用抗生素研究工作
之江菌素是一种新抗生素[1 ,2 ] ,它对鸡白痢等畜禽肠道细菌病有良好的防治效果[3 ,4 ] 。离
子注入是 1980 年代兴起的一种表面处理技术 ,我们将其应用于之江菌素产生菌的诱变育种研
究 ,取得了良好的效果。
1 　材料与方法
111 　供试菌
之江菌素产生菌玫瑰黄链霉菌杭州亚种 ( Streptomyces roseoflavus subsp . hangzhouensisn. Sub2
sp . ) [5 ] ,菌号 93 - 15 - 32 ,效价 200μgΠml 左右。
112 　培养基
斜面培养基采用高氏 1 号琼脂 ;发酵培养基以黄豆饼粉、淀粉为主体 ,辅以一些无机盐组
成。
113 　离子注入操作
离子源采用 N + ,能量 20keV ,I = 20mA。注入操作在离子器水冷底座上进行 ,控制温度在
50 ℃以下 ,脉冲式注入。具体操作有以下 3 种 :
涂孢法 :采用高氏 1 号琼脂平皿 ,将供试菌孢子涂布其上 ,置于离子器靶室 ,真空抽干后注
入荷能离子。
802 　核 农 学 报　2002 ,16 (4) :208～211Acta Agriculturae Nucleatae Sinica
干孢法 :用无菌水将菌种斜面上的供试菌孢子冲刮下 ,涂布于空培养皿中 ,于超净台上用
无菌空气吹干水分 ,然后置于离子器靶室 ,注入荷能离子。
培养法 :采用高氏 1 号琼脂平皿 ,接种供试菌 ,培养至形成菌落并产生大量孢子 ,将平皿置
于离子器靶室 ,真空抽干后注入荷能离子。
114 　效价测定
以鸡白痢病原菌 ( Salmonella pullorum)为检测菌 ,以之江菌素纯品为标准品 ,采用杯碟法测
定[6 ] 。
115 　中试研究
采用 400L 发酵罐 ,在浙江省农业科学院生物制品厂中试车间进行。
2 　结 　果
211 　离子注入处理方法研究
采用不同剂量处理之江菌素产生菌 ,考察处理后供试菌的存活率。结果表明 ,干孢法处
理 ,注入 3 ×1015N + Πcm2 剂量时 ,存活率为 7619 % ,剂量为 6 ×1015 N + Πcm2 时是 4911 % ,9 ×1015Π
cm
2 时是 4211 % ,12 ×1015N + Πcm2 时是 2416 % ,15 ×1015N + Πcm2 时是 1112 % ,18 ×1015N + Πcm2 以
上剂量则全部死亡 ;涂孢法处理 ,注入剂量为 3 ×1015 N + Πcm2 时 ,存活率 7212 % ,10 ×1015 N + Π
cm
2 时为 4412 % ,20 ×1015 N + Πcm2 以上剂量则菌全部死亡 ;培养法处理 ,各剂量对供试菌存活
率影响不大 ,即使注入 45 ×1015N + / cm2 的高剂量仍有很高的存活率。这可能是由于荷能离子
注入深度有限 ,只能影响琼脂表层 ,不能影响琼脂层内部。因此 ,我们一般选用干孢法或涂孢
法处理 ,剂量为 3 ×1015～15 ×1015N + Πcm2 。涂孢法和培养法处理 ,真空抽干过程中的水蒸气对
离子器产生损害 ,而采用干孢法 ,因水分吹干过程在超净台上进行 ,因而能有效避免水蒸气对
离子器的损害。
212 　离子注入诱变效应研究
5 年来 ,先后进行了 9 批离子注入处理实验。将效价为出发菌株的 90 %及以下的菌株视
为负突变株 ,将 110 %及以上的菌株视为正突变株 ,90 %～110 %之间的视为不变异株。用 5 种
剂量处理之江菌素产生菌 ,其突变率统计于表 1。
表 1 　N+ 注入处理之江菌素产生菌的诱变效果
Tabel 1 　The mutagenic effects of Streptomyces roseoflavus subsp . with N + implantation
剂量
dose (N + / cm2)
总变异率
total mutation rate ( %)
负突变率
negative mutation rate ( %)
正突变率
positive mutation rate ( %)
3 ×1015 42. 4 36. 6 5. 8
6 ×1015 55. 2 47. 6 7. 6
9 ×1015 64. 4 45. 7 18. 7
12 ×1015 73. 0 34. 8 38. 2
15 ×1015 66. 4 35. 8 30. 6
由表 1 可以看出 ,N + 离子注入之江菌素产生菌 ,能明显诱发供试菌突变 ,总变异率为
4214 %～7310 % ,其中正突变率为 518 %～3812 %。12 ×1015～15 ×1015N + Πcm2 剂量范围具有很
902　4 期 等离子体处理选育之江菌素产生菌
好的正突变效果 ,其突变率高达 30 %以上。
213 　菌种诱变选育结果
经 9 批离子注入处理及数次亚硝酸、γ射线等理化处理 ,得到之江菌素高产菌种 2 株 ,分
别为 97249 和 97256 菌株 ,其摇瓶效价分别达 890 和 780UΠml。其中 97249 菌株已经 5 代传代 ,
能稳定遗传 ,效价比出发菌株 93 - 15 - 32 提高 4 倍多。在这一过程中 ,离子注入处理的贡献
率累计达 70 %左右。
214 　高产菌种中试研究
以 97 - 49 菌株为生产菌 ,在本院生物制品厂中试车间进行了连续 3 批发酵中试试验 ,为
期 20d。发酵培养液以甘薯淀粉、黄豆饼粉为主 ,并加少量蛋白胨 (5 号配方) 。发酵温度为
2815～2910 ℃,转速 180rΠmin ,装量 60 %～70 % ,罐压 015kgΠcm2 。菌种培养 22～24h ,接种量为
1 %左右。接种 20h 左右 ,菌丝开始增长形成小网状 ,30h 左右菌丝大量增长形成大网状 ,40h
后菌丝体增长逐渐减慢 ,45h 左右放罐。
在发酵过程中糖氮利用和 pH 变化为 :总糖消后为 6 % ,发酵 16h 时为 4 % ,25h316 % ,40h
116 % ,放罐时为 112 % ;还原糖消后为 013 % ,16h 时为 0124 % ,25h 为 013 % ,40h0126 % ,放罐时
为 0122 % ;氨基氮消后为 5010μgΠml ,16h 为 10917μgΠml ,25h 23112μgΠml ,40h 30212μgΠml ,放罐时
34318μgΠml ;pH消后为 612 ,16h 为 612 ,25h 611 ,40h613 ,放罐时 613。3 批发酵中试试验 ,效价分
别为 890、903 和 847UΠml。中试结果表明 ,97 - 49 菌株发酵工艺易于放大 ,且生产性能稳定 ,具
备规模生产能力。
3 　结果与讨论
离子束是 80 年代兴起的一种材料表面处理新技术 ,余增亮等将这一技术应用于作物品种
改良的诱变选育研究 ,取得了良好效果[7 ,8 ] 。我们将这一技术作为微生物诱变育种手段率先应
用于之江菌素高产菌种的选育研究 ,结果表明 ,N+ 离子注入处理对之江菌素产生菌具有明显
的诱变效果 ,总变异率达 4214 %～7310 % ,其中正突变率达 518 %～3812 %。而且变异菌种的
性状 (产素能力)能稳定遗传 ,筛选到的优良菌种成功通过中试 ,具实际应用能力。因此我们认
为 ,离子注入是一种很有潜力的微生物诱变选育新方法。
通过透变选育具有优良性状的微生物菌种 ,是发酵工业的关键一环。一株生产菌种 ,一般
经过数种常规生物理化手段无数次处理 ,其生产性能的进一步提高非常困难 ,离子注入技术作
为微生物菌种选育的一种新方法 ,对整个微生物发酵业生产水平的进一步提高具有现实意义。
致谢 :本研究中离子注入操作由中国科学院等离子体物理研究所协助完成 ,在此致以衷心感谢。
012 核　农　学　报 16 卷
参考文献 :
[ 1 ] 　施跃峰 ,等. 抗鸡白痢抗生素 633B 的分离和鉴别. 浙江农业学报 ,1992 ,4 (2) :79～82
[ 2 ] 　施跃峰 ,等. 之江菌素的分离、性质和化学结构. 生命科学进展. 北京 :科技出版社 ,1995. 410～414
[ 3 ] 　吴国栋 ,等. 633 菌饲防治鸡 肠炎下痢及促进鸡增重效果试验. 上海畜牧兽医通讯 ,1991 , (2) :9～10
[ 4 ] 　何永强 ,等. 之江菌素防治鸡白痢临床实验. 浙江农业科学 ,1994 , (6) :290～291
[ 5 ] 　黄文彩 ,等. 农用抗生素 633 研究———产生菌分类鉴定. 中国抗生素杂志 ,1991 ,16 (3) :209～212
[ 6 ] 　卫生部药典委员会编. 中华人民共和国药典. 二部 ,附录 ,1990 :113～116
[ 7 ] 　余增亮 ,等. 离子注入水稻诱变育种机理初探. 安徽农业科学 ,1989 , (1) :12～16
[ 8 ] 　吴跃进 ,等. 离子束注入水稻诱变效应的研究. 安徽农业科学 ,1989 , (2) :10～13
SCREENING FOR EXCELLENT MUTANTS OF Streptomyces roseoflavus
SUBSP. BY N+ IMPLANTATION
SHI Yue2feng 　SANGJin2long 　ZHU Li2hong 　WU Wen2juan
YAO Hang2li 　XIA Zhan2en 　HUANG Wen2cai
( Institute of Microbiology , Zhejiang Academy of Agricultural Sciences , Hangzhou , Zhejiang prov. 　310021)
ABSTRACT :The biological effects of Streptomyces roseoflavus subsp. hangzhouensisn. Subsp. with
N+ implantation are reported. The total and postitive mutation rates with various doses( 3 ×1015～
15 ×1015 N+ Πcm2 ) were 4214 %～7310 % and 518 %～3812 %,respectively. Mutant 97249 with po2
tency over four times more than that of the parental strain was obtained through N+ implantation
and showed good genetic stability. These results showed that ion implantation was an effective
method for microbe mutagenesis.
Key words :ion implantation ; mutagenesis; streptomyces ; Zhijiangmycin
112Acta Agriculturae Nucleatae Sinica
2002 ,16 (4) :208～211