全 文 ：文章编号 :100028551 (2004) 032221204
辐射对耐辐射球菌 ( Deinococcus radiodurans)
抗氧化酶活性提高的影响
田　兵　高冠军　徐步进　华跃进 3
(浙江大学原子核农业科学研究所 ,农业部核农学重点实验室 ,浙江 杭州　310029)
摘 　要 :利用低剂量 (50～1500Gy)的60 Coγ射线辐照处于稳定早期的耐辐射球菌培养物 ,考察了
辐照剂量和辐照后培养时间对菌体中抗氧化酶 ,即超氧化物歧化酶 (SOD)和过氧化氢酶 (CAT)
含量的影响。结果表明 ,在一定辐照条件 (200～1000Gy) 下 ,经过 30～60min 的辐照后培养 ,菌
体中 SOD 和 CAT酶活性显著提高 ,其中 1000Gy 辐照且辐照后培养 30min 的 SOD 酶活性达到
149169 UΠmg ,CAT酶活性达 1855101 UΠmg。分别比对照 (未辐照) 提高了 75159 %和 60198 %。
低水平辐照 (0～1000Gy)对菌体生物量的影响不明显。
关键词 :耐辐射球菌 ;γ射线辐射诱导 ;超氧化物歧化酶 ;过氧化氢酶
ENHANCEMENT OF ANTIOXIDANT ENZYMES’ACTIVITIES BY IRRADIATION
IN Deinococcus radiodurans
TIAN Bing 　GAO Guan2jun 　XU Bu2jin 　HUA 　Yue2jin 3
( Institute of Nuclear2Agricultural Sciences , Zhejiang University , Hangzhou , Zhejiang , 310029)
Abstract :Cultures of Deinococcus radiodurans at early stage of stable phase were treated by low doses ofγ2ray (50
～1500Gy) and the effects ofγ2ray irradiation on activities of antioxidant enzymes , superoxide dismutase (SOD)
and catalase ( CAT) , were investigated. The results indicated that SOD and CAT activities in cells increased
significantly during the post2incubation (30～60min) after the irradiation (200～1000Gy) . At 30min after the
irradiation of 1000Gy , SOD and CAT activities reached 149169 UΠmg and 1855101 UΠmg , respectively , which were
75. 59 % and 60198 % higher than those of controls (without irradiation) respectively. Low doses of irradiation (0
～1000Gy) were found to have little effects on cell mass.
Key words : Deinococcus radiodurans ;γ2ray irradiation induction ; superoxide dismutase ; catalase
收稿日期 :2003204230
作者简介 :田兵 (1970～) ,男 ,助理研究员 ,从事食药用菌育种和核农技术研究。3 通讯作者超氧化物歧化酶 (superoxide dismutase ,SOD)和过氧化物酶 (catalase , CAT) 是生物体中重要的抗氧化酶 ,SOD 的生理作用是将超氧阴离子自由基通过歧化反应生成过氧化氢和氧分子 ,而 CAT 可以将过氧化氢转变成水和氧 ,从而防止活性氧自由基对机体中生物大分子 (DNA、蛋白质等) 的氧化损伤。SOD 和CAT具有重要的应用价值 ,目前主要应用于延缓人体衰老、防止紫外线辐射引起的色素沉着、清除局部炎症等保健品及化妆品方面。耐辐射球菌 ( Deinococcus radiodurans)是由美国科学家 Anderson 等从辐射灭菌后仍然发生变质的肉类罐头中分离得到一种革兰氏阳性非孢子菌 ,与其他物种相比 ,该菌具有超强的耐辐射能力和 DNA 修复能力 ,其抗辐射能力比大肠杆菌高出 200 多倍[1 ] ,该菌经 15kGy 辐照仍然能够生存 ,而且不发生任何变异。辐射引起细胞内水辐解 ,形成活性氧自由基 ,攻击生物大分子。DNA 的辐射损伤主要是由水辐
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解自由基的间接作用引起的[2 ] 。因此 ,活性氧自由基对生物大分子氧化损伤是导致辐射损伤的一个重
要原因 ,耐辐射球菌的超强耐辐射能力与其抗氧化酶 (主要是 SOD 和 CAT) 存在着密切的联系。Ping
Wang 和 Herb Schellhorn 发现耐辐射球菌的 SOD 活性比大肠杆菌高出 6 倍 ,对过氧化氢的抗性也明显高
于大肠杆菌[3 ] 。研究发现 ,在一定剂量的辐照条件下 ,耐辐射球菌的 DNA 修复能力和耐辐射能力显著
高于未经辐照时的表现[4 ,5 ] 。因此 ,本研究的目的是探讨辐射对菌体抗氧化酶合成的影响以及辐射与菌
体生长、抗氧化酶合成之间的关系和酶合成的最佳辐照条件。
1 　材料与方法
111 　菌种及培养
采用耐辐射球菌野生型菌株 R1。将该菌划线接种于 TGY固体培养基上 (蛋白胨 5gΠL ,酵母提取物
3gΠL ,葡萄糖 1gΠL) ,32 ℃下培养 48h。挑取单一菌落接种于三角瓶中 ,摇瓶培养至对数生长期 (30h 以
上) 。将液体种子按 5 %接种量 ,接入发酵液体培养基 (TGY)中 ,于 32 ℃培养 42h。
112 　菌体生物量和蛋白质含量测定
菌体生物量用单位体积培养液所含菌体干重 (mgΠml)表示。用预先干燥称重的 115ml 离心管取 1ml
培养液在 5000rpm 条件下离心 10min 后得沉淀菌体 ,用 50mM pH710 的磷酸缓冲液 ( PBS) 和双蒸水各洗
涤菌体 1 次 ,然后真空干燥 (Savant Speed Vac Plus SC210A concentrator ,Savant Instruments INC. ,USA) ,称重
并计算菌体干重。菌体蛋白质含量采用 Bradford 法测定[5 ] 。
113 　辐照和辐照后培养
收获培养到稳定早期 (42h ,菌浓度 > 108Πml ,菌体形态多数呈二联体) 的菌细胞 ,按不同的剂量处理
分装 (50mlΠ管) ,在室温下经γ射线照射 (60 Co 辐射源) ,剂量率为 1000GyΠh。菌体接受照射的总剂量对照
组为 0Gy 和 5 个实验组分别为 50、200、500、1000 和 1500Gy ,每组菌体总体积为 150ml。各组菌体经辐照
后 ,在 32 ℃条件下培养一段时间。按不同辐照后培养时间 ,每个实验组又分为 :0、30、60、90 和 120min 5
个组 ,每组菌体体积为 30ml。
图 1 　不同剂量γ射线辐照和辐照后培养
时间对菌体生物量的影响
Fig. 1 　Effects of irradiation and post2incubation
time on cell mass
114 　酶活性分析
菌液离心 (5000rpm ,4 ℃) 10min ,收集菌体沉淀。用 50mM PBS(pH710)洗涤 2 次 ,离心收集菌体细胞。
按每克湿菌体加入 3 倍体积缓冲液制成菌悬液 ,在 600W 功率条件下超声波破碎细胞 (处理时间 8min) ,
每处理 2s ,间隔 4s。4 ℃下离心 (12000rpm) 20min ,收集上清液为粗酶液 ,保存于冰上待用。SOD 酶活性
采用邻苯三酚自氧化法分析[7 ,8 ] 。CAT酶活性按 Beers & Sizers 法测定[9 ] 。
2 　结果与分析
211 　不同辐照剂量和辐照后培养时间对菌体生物量
的影响
菌体培养物经不同剂量 (0～1500Gy)γ射线辐照
和辐照后培养 0～120min ,菌体生物量 (用菌体干重表
示 ,mgΠml)测定结果如图 1 所示。在相同辐照后培养
条件下 (0～90min) ,菌体干重在 10～12mgΠml 范围内
波动 ,不同剂量辐照对菌细胞干重影响较小。但在
1500Gy 条件下 ,细胞干重均有减少。而在相同的辐照
剂量条件下 ,不同的辐照后培养时间对菌体生物量影
响较大。辐照后经过 0～30min 培养的菌体生物量较
高 ,而培养超过 60min 后 ,菌体生物量有所减少。
222 核　农　学　报 18 卷
212 　不同剂量辐照和辐照后培养时间对菌体内蛋白质含量的影响
表 1 为菌体蛋白质含量测定结果。在相同辐照后培养条件下 ,菌体蛋白质含量随着辐照剂量的增
加均有减少趋势。其中 ,未辐照后培养 (0min) 的菌体蛋白经过 1500Gy 照射处理后下降显著 (与 0Gy 对
照比较 , P < 0105) 。另外 ,当辐照剂量相同时 ,菌体蛋白经过 30min 的辐照后培养有显著增加 (与 0min
对照比较 , P < 0105) 。但辐照后培养超过 1h 以上 ,菌体蛋白含量随着时间增加而逐步减少 ,这与前面
菌体生物量的变化趋势一致。
表 1 　辐照剂量和后培养时间对菌体蛋白质含量的影响
Table 1 　Effects ofγ2ray doses and post2incubation time on intracellular protein content
辐照剂量
irradiation dose ( Gy)
培养时间 culture time (min)
0 30 60 90 120
0 11028 ±0104 11144 ±0110 11032 ±0108 11003 ±0106 01859 ±0103
50 01928 ±0105 11044 ±0104 11019 ±0105 01966 ±0105 01881 ±0113
200 01905 ±0101 11139 ±0102b 11013 ±0109 01975 ±0108 01828 ±0110
500 01913 ±0101 11076 ±0103b 11025 ±0112 01994 ±0104 01894 ±0109
1000 01909 ±0102 01987 ±0101b 01981 ±0113 01919 ±0108 01918 ±0101
1500 01871 ±0101a 11032 ±0101 01963 ±0112 01914 ±0101 01674 ±0112
注 :a. 在辐照后培养时间相同条件下 ,与对照 (辐照剂量 = 0Gy)比较 ,蛋白质含量具有显著性差异 ( P < 0. 05) ;b. 在辐照剂量相同条件下 ,
与对照 (辐照后培养时间 = 0min)比较 ,蛋白质含量具有显著性差异 ( P < 0. 05) 。
Note :a. At the same condition of post2incubation time ,protein content showed significant difference ( P > 0105) comparing with the control (irradiation dose
= 0Gy) ;b. At the same condition of irradiation ,protein content showed significant difference ( P < 0105) comparing with the control (post2incubation
time = 0min) .
图 2 　不同剂量γ射线辐照和辐照后培养
时间对 SOD 活性的影响
Fig. 2 　Effects of irradiation and post2incubation
time on SOD activity
图 3 　不同剂量γ射线辐照和辐照后培养时间
对 CAT活性的影响
Fig. 3 　Effects of irradiation and post2incubation
time on CAT activity
213 　不同剂量辐照和辐照后培养时间对超氧化物歧化酶( SOD)活性的影响
γ射线辐照和辐照后培养对菌体内 SOD 活性的影响分析结果见图 2。经 200～1000Gy 辐照并经过
30～60min 的辐照后培养 ,菌体的 SOD 活性高于未经诱导处理的对照 (0Gy) 。经 1000Gy 辐照并辐照后
培养 30min 的 SOD 酶活性达到 149169 UΠmg ,比对照 (0Gy)提高了 75159 %。但是当辐照剂量达到 1500Gy
以上时 ,SOD 活性明显下降。从图 2 还可以看出 ,辐照后培养对于菌体 SOD 的合成有重要影响。在没
有辐照后培养 (0min)时 ,菌体的 SOD 活性随着辐照剂量的增加而下降。当辐照后培养超过 60min 以上
时 ,经辐照细胞中的酶活性提高不明显。由此得出提高菌体 SOD 活性的最佳条件是 1000Gy 辐照且辐照
后培养 30min。
214 　不同剂量辐照和辐照后培养时间对过氧化氢酶( CAT)活性的影响
在 0～1500Gy 剂量辐照和 0～120min 的辐照后培养条件下 ,分别考察了菌体细胞内的过氧化氢酶
(CAT)活性 ,结果如图 3。在相同的辐照后培养时间内 (0～60min) ,辐照能够提高菌体内过氧化氢酶的
322　3 期 辐射对耐辐射球菌( Deinococcus radiodurans)抗氧化酶活性提高的影响
活性。在 1000Gy 辐照和 30min 的辐照后培养条件下 ,CAT酶活性达到了 1855101 UΠmg ,比未经辐照的对
照 (1152131 UΠmg)提高了 60198 %。
与菌体 SOD 辐照结果不同的是 ,菌体 CAT 酶活性在较高剂量 ( > 1000Gy) 辐照处理后降低比较缓
慢。这可能是由于胞内辐射形成的自由基 O -2 ·发生歧化反应以及羟基自由基相互作用形成了大量的
H2O2 [2 ] ,而且辐照剂量愈高这种转化反应形成的 H2O2 愈多 ,刺激了细胞过氧化氢酶的合成。
3 　讨论
在较低剂量离子辐射条件下 (0～1000Gy) ,γ射线对耐辐射球菌的生长没有明显影响 ,这与有关文
献报道的剂量2存活率研究结果相符合[10 ] 。菌体经辐照处理后 ,在 1h 内菌体生物量变化不大 ,比较适合
于菌体的收获和酶的分析。菌体经γ射线辐照处理后 ,蛋白质合成代谢受到一定影响 ,可能是部分蛋白
质发生了降解 ,或者某些蛋白质的合成受到阻遏。在辐照后培养 (30min) 后 ,菌体蛋白合成出现了恢复
和增加 ,这可能是菌体内对外界辐照以及由此产生的自由基氧化压力的一种反馈机制 ,刺激菌体在短时
间内合成大量的防御 (抗氧化酶等) 和修复成分。由于γ射线辐照使菌体胞内形成超氧阴离子自由基
O -2 ·和 H2O2 [11 ] ,刺激了细胞防御体系 ,促使 SOD 和 CAT大量合成 ,清除活性氧自由基。有关辐射刺激
- 酶合成的这种反馈机制和抗氧化酶合成的调控途径还有待进一步深入研究。
菌体内抗氧化酶在辐照条件下活性的提高 ,进一步证实了耐辐射球菌的超强耐辐射能力与其胞内
抗氧化酶 (SOD、CAT)的作用有着密切的联系。另外 ,利用辐射诱导法提高菌体的抗氧化酶活性和含量
在微生物制备抗氧化酶有着重要的应用价值。
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