全 文 ：© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
　文章编号 :100028551 (2001) 0120011204
脐橙离体辐射增强耐寒性研究
陈力耕　胡西琴　沈立晓
(浙江大学园艺系　浙江 杭州　310029)
摘　要 :经γ射线辐照的大三岛脐橙胚状体和愈伤组织增强了耐寒性 ,表现为在低温
下细胞活力明显提高 ,相对应的半致死温度分别为 - 418 ℃和 - 519 ℃,比未辐照处理
的降低 116 ℃和 118 ℃;可溶性糖含量、游离脯氨酸含量、SOD 和 CA T 活性都有不同
程度的提高。
关键词 :脐橙 ;离体培养 ;γ射线辐照 ;耐寒性
收稿日期 :2000207201
基金项目 :浙江省自然科学基金资助项目 (397247)
作者简介 :陈力耕 (19 　～) ,
脐橙是世界上最优良的柑桔品种之一 ,我国自 20 世纪 80 年代中期以来发展迅速。但因
其耐寒性较弱 ,低温冻害常是大面积栽培的限制因子。1991 年 12 月与 1999 年 12 月的两次
冻害使长江中下游各省的脐橙蒙受重大损失。因此 ,选育耐寒脐橙对柑桔业有非常重要的意
义。迄今为止国内外尚无人进行过耐寒脐橙选育的研究。以组织培养为基础的离体诱变技术
能有效地筛选并可再生出遗传性稳定的突变植株[1 ] ,Nito 等为选育优良的柑桔突变体着重研
究了γ射线辐射对愈伤组织和体胚发生的影响[2 ] 。Kochba 等[3 ]和邓占鳌等[4 ]用γ射线诱变
甜橙和酸橙胚性愈伤组织 ,获得耐盐的愈伤组织和突变系。郭安熙、杨保安等[5 ]采用γ射线与
组培相结合 ,先后育成了 14 个菊花新品种 (系) 。许多研究表明 ,离体诱变技术有利于缩短育
种周期 ,提高育种效率。本研究试图通过γ射线辐照脐橙愈伤组织和胚状体以期提高其耐寒
性 ,进一步为筛选耐寒突变体提供育种素材。
1 　材料与方法
111 　材料
试材为浙江大学园艺系柑桔网室中的枳砧大三岛脐橙 ( Cit rus si nensis Osb. ) 。
112 　方法
1997～1999 年进行 ,取大三岛脐橙盛花后 4 周的幼果 ,在无菌条件下剥取胚珠 ,接种于
M T + BA 5mg/ L 的培养中 ,在 25 ℃±1 ℃下暗培养获得胚状体。由于脐橙极难从胚珠直接诱
导产生愈伤组织 ,因此将上述胚状体接种于 M T + AgNO3 5mg/ L 的培养基中 ,使之从胚状体
基部边缘产生愈伤组织 ,再进行切割继代增殖。
γ射线处理在本校核农所辐照中心进行。剂量率为 8 Gy/ min ,照射剂量设 0150、100、
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150 Gy 4 种处理 ,每处理 40 瓶。照射后将培养材料重新转接到新鲜培养基中。转接时每处理
取 10 瓶称出初始重量 ,求其每瓶培养材料的平均值。1 个月后再统计不同处理每瓶培养材料
的平均重 ,求出相对生长量 ,同时进行耐寒性及相关生理指标的测定。
113 　耐寒性及相关生理指标测定
胚状体与愈伤组织的耐寒性测定采用 TTC 还原法[6 ] ;可溶性糖含量按向曙光等的方法测
定[7 ] ;游离脯氨酸含量按张殿忠等的方法测定[8 ] ; SOD 活性测定采用 NB T 光化还原法[6 ] ;
CA T 活性测定采用滴定法[9 ] 。可溶性蛋白含量测定参照 Schuster 和 Davies 的方法[10 ] 。
2 　结果与分析
211 　γ射线辐射对胚状体和愈伤组织生长的影响
γ射线辐射后 ,胚状体和愈伤组织的生长都受到不同程度的抑制 ,随着辐照剂量的提高抑
制增强 (表 1) 。从相对生长率来看 ,半致死剂量在 100～150 Gy 之间。50 Gy 辐照对生长略有
抑制作用 ,存活的愈伤组织和胚状体继代后能基本保持正常的分裂和生长 ,而 100 和 150 Gy
辐照后 ,存活的愈伤组织与胚状体继代后生长速率相对缓慢 ,个别胚状体出现褐变或畸形。
表 1 　γ射线辐照对脐橙愈伤组织和胚状体生长的影响
Table 1 　Effect of gamma irradiation on callus and embryoid growth in navel orange
培养材料
material
i n vit ro
剂量
radiation dose
( Gy)
初始重量 a
initial weight a
(mg)
1 个月后收量 b
yield after a month b
(mg)
b/ a
　
　
相对生长率
relative
growth
愈伤组织
callus
胚状体
embryoid
0 56 137716 2416 10010
50 58 127012 2119 8910
100 55 84115 1513 6212
150 54 60418 1112 4515
0 45 23215 512 10010
50 43 20414 418 8119
100 42 13015 311 5616
150 45 11417 215 4913
212 　辐照处理对耐寒性的影响
选取 100 Gy 辐照后存活的愈伤组织和胚状体 ,与对照同时在相同培养基上继代培养 ,增
殖 3 代后进行耐寒性测定。供试材料先在 5 ℃下锻炼 10d ,然后分别在 - 2 ℃、- 3 ℃、- 4 ℃、
- 5 ℃和 - 6 ℃下处理 12h ,进行 TTC 测定。以细胞活力 50 %所对应的温度为半致死温度 ,用
半致死温度表示耐寒性的强弱。结果表明 ,在 - 2 ℃下 ,辐照和对照的细胞活力都超过 70 % ,
- 3 ℃时 ,对照胚状体的细胞活力已降至 5218 % ,对照愈伤组织则在 - 4 ℃时细胞活力接近
50 % ,而辐照处理的胚状体和愈伤组织细胞活力明显提高 ,相对应的半致死温度分别为
- 418 ℃和 - 519 ℃,分别比对照降低 116 ℃和 118 ℃(图 1) 。
213 　相关生理指标的测定
经辐照处理后 ,胚状体与愈伤组织的 SOD 和 CA T 活性、可溶性糖和游离脯氨酸含量均比
对照增加 ,尤以 SOD 活性增加较为显著 ,而可溶性蛋白含量则两者没多少差异 (表 2) 。
21 核　农　学　报 15 卷
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图 1 　γ射线辐照对愈伤组织和胚状体细胞活力的影响
Fig. 1 　Effect ofγ irradiation on activity of cell in callus and embryoids
表 2 　γ射线辐照与对照若干生理指标的差异
Table 2 　Difference in several physiological indexes between gamma irratiation and CK
处理
treatment
SOD 活性
SOD activity
(unit/ g FW)
CAT 活性
CAT activity
(mg/ g·min)
可溶性糖含量
soluble sugar
( %)
游离脯氨酸
free proline
(mg/ g)
可溶性蛋白
soluble protein
(mg/ g)
辐照胚状体
irradiated embryoid
197130 15136 1138 47162 32110
对照胚状体
CK embryoid 159170 11187 1112 42130 32190
辐照愈伤组织
irradiated callus 186190 14156 1131 46171 33110
对照愈伤组织
CK callus
151114 11102 1104 41152 32170
3 　讨 　论
本实验结果表明 ,适当剂量的γ射线处理可以提高愈伤组织和胚状体的耐寒力 ,比相同低
温条件下的对照细胞活力明显提高 ,半致死温度分别降低 116 ℃和 118 ℃,其中愈伤组织比胚
状体更耐辐射。在相同照射剂量和相同低温下 ,愈伤组织的细胞活力显著高于胚状体 ,半致死
温度也要低 111 ℃左右。因此 ,脐橙离体诱变以愈伤组织为材料似乎更为适宜 ,但脐橙胚性愈
伤组织的诱导十分困难[11 ] ,我们将胚状体接种于添加 AgNO3 的 M T 培养基上才获得了足够
试验用的愈伤组织。为此 ,有必要深入研究如何快速建立脐橙愈伤组织细胞系的问题。
为了进一步验证γ射线辐照后愈伤组织和胚状体耐寒性提高的可靠性 ,本实验又选择了
与耐寒性密切相关的可溶性糖、游离脯氨酸、可溶性蛋白质、SOD 和 CA T 活性等 5 种生理指
标进行测定。结果表明 ,γ射线辐照后的愈伤组织和胚状体 ,其可溶性糖和游离脯氨酸含量、
SOD 和 CA T 活性都高于对照 ,尤以 SOD 活性提高最为明显 ,这也足以证明γ射线处理对提高
脐橙愈伤组织和胚状体的耐寒性是有效的和可行的 ,但可溶性蛋白质含量则与对照没有明显
差异 ,这可能意味着γ射线处理尚不能有效地促进蛋白质合成。γ射线辐照提高耐寒性的机
理比较复杂 ,但从本实验的结果可初步认为 ,可能既存在脯氨酸、可溶性糖等物质参与的渗透
31　1 期 脐橙离体辐射增强耐寒性研究
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调节作用机制 ,也存在抗氧化酶活性加强的防御机制 ,更重要的可能还存在抗寒基因表达与调
控机制[12 ] 。进一步的研究尚在进行之中。
参考文献 :
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ENHANCED COLD TOLERANCE BY GAMMA IRRATIATION
OF in vit ro NAVEL ORANGE
CHEN Li2geng 　HU Xi2qin 　SHEN Li2xiao
( Depart ment of Horticult ure , Zhejiang U niversity , Hangz hou , Zhejiang prov . 　310029)
ABSTRACT :Exposure to gamma irratiation enhanced the cold tolerance of embryoid and callus
in Omishima navel orange , and marked increase of the cell activity under lower temperature was
shown. For embryoid and callus , the LT50 were - 418 ℃and - 519 ℃respectively , 116 ℃and
118 ℃lower than those without irratiation respectively. At the same time , the content of soluble
sugar , free prol ine , the activity of SOD and CAT were increased when treated by gamma irratia2
tion.
Key words :navel orange ; i n vit ro ; gamma irratiation ; cold tolerance
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2001 ,15 (1) :11～14