全 文 ：© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
文章编号 :100028551 (2002) 0220070205
农杆菌对蕉柑 ( Citrus reticulata var. tankan
Hayata)胚性细胞的附着研究
王声斌1 　黄自然2 　余让才1 　邹伟权1
(11 华南农业大学生物技术学院 ,广东 广州　510642 ;21 艺术设计学院 ,广东 广州　510642)
摘要 :农杆菌能够附着蕉柑的胚性细胞。农杆菌对蕉柑胚性细胞的附着曲线表明 ,农
杆菌与蕉柑胚性细胞之间的附着是一个动态过程。农杆菌在蕉柑胚性细胞上的附着
量受共培养介质中乙酰丁香酮 (As)和表面活性物质影响较小 ,而与共培养介质中的
农杆菌浓度呈正相关。
关键词 :蕉柑 ;胚性细胞 ;农杆菌 ;吸附
收稿日期 :2001207223
基金项目 :本研究得到农业部“高新技术与基础研究”(952农215203202202)项目资助。
作者简介 :王声斌 (1967～) ,男 ,安徽巢湖人 ,博士 ,华南农业大学生物技术学院生物物理教研室讲师 ,主要从事同位素
应用及生物技术研究工作
农杆菌与受体材料的附着是成功实现外源基因转化的基础 ,国内外研究者对此进行了广
泛的研究[1～4 ] 。对农杆菌与受体材料附着过程的了解及影响因素的研究将为农杆菌介导的外
源基因转化提供重要的参考依据。本文首次对农杆菌与蕉柑胚性细胞之间的附着及其影响因
素进行了探讨 ,为利用农杆菌介导的方法将外源基因导入蕉柑胚性细胞打下基础。
1 　材料与方法
111 　材料
蕉柑胚性愈伤组织、胚性悬浮细胞由本实验室诱导与建立。
112 　农杆菌的活化培养
挑农杆菌单菌落于 LB1 (LB + Km50mgΠL + Cm25mgΠL + Str70mgΠL + Spe70mgΠL) 液体培养基
中 ,28 ℃培养过夜 ,取 500μl 菌液于新鲜LB1 或LB1 + As200μmolΠL 液体培养基中培养约 16h ,备
用。
113 　农杆菌的32 P2Na H2 PO4 标记
取 500μl 新鲜农杆菌菌液于LB1 液体培养基中 ,同时加入32 P2NaH2 PO4 。32 P2NaH2 PO4 的引
入量分别为 11169 ×105BqΠml (处理 1) 、21338 ×105BqΠml (处理 2) 、41677 ×105BqΠml (处理 3) ,同
时设对照。28 ℃培养 24h 后 ,各取 115ml 离心收集菌体 ,用无菌水反复冲洗 ,再用 015ml LB 液
体培养基重新悬浮 ,取其中 011ml 于放射性测量碟 ,在盖革计数器上分别测量 cpm 值。
07 　核 农 学 报　2002 ,16 (2) :70～74Acta Agriculturae Nucleatae Sinica
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114 　标记农杆菌与蕉柑胚性愈伤组织、胚性悬浮细胞的附着实验
11411 　标记农杆菌与蕉柑胚性愈伤组织附着动态实验 　将 113 中处理 3 获得的标记农杆菌
与蕉柑胚性愈伤组织按 108 个菌∶100mg 细胞比例在 MT液体培养基中共培养 ,每隔 115、215、
4、8、12、24h 离心收集胚性细胞 ,用 0115molΠL 的无菌 NaCl 溶液反复冲洗 ,除去游离及非特异性
吸附的农杆菌后 ,烘干胚性细胞 ,在盖革计数器上测定 cpm 值 ,绘制附着曲线。
11412 　影响农杆菌与蕉柑胚性细胞附着的因素
(1)乙酰丁香酮 (As) 、吐温220 对农杆菌附着蕉柑胚性悬浮细胞的影响 :将标记农杆菌与蕉
柑胚性悬浮细胞按 108 个菌∶100mg 细胞比例分别在 MT、MT + As200μmolΠL、MT + As200μmolΠL
+ 1 滴吐温220、MT + As200μmolΠL + 2 滴吐温220 介质中共培养 4h ,按 11411 方法离心收集胚性
细胞 ,分别测定 cpm 值。
(2)共培养比例对农杆菌附着蕉柑胚性悬浮细胞的影响 :将标记农杆菌与蕉柑胚性悬浮细
胞按 107 个菌 :100mg 细胞、108 个菌∶100mg 细胞、109 个菌∶100mg 细胞比例在 MT + As200μmolΠ
L 介质中共培养 4h ,按 11411 方法离心收集胚性细胞 ,分别测定 cpm 值。
(3)农杆菌与蕉柑胚性愈伤组织、胚性悬浮细胞附着的比较实验 :将标记农杆菌与蕉柑胚
性愈伤组织、胚性悬浮细胞按 108 个菌∶100mg 细胞比例分别在 MT、MT + As200μmolΠL 介质中
共培养 4h ,按 11411 方法离心收集胚性细胞 ,测定 cpm 值。
2 　结果与分析
211 　放射性32 P2Na H2 PO4 标记农杆菌
21111 　LB 液体培养基中放射性32 P2NaH2 PO4 对农杆菌生长的影响 　将32 P2NaH2 PO4 加入到接
种了农杆菌的LB 液体培养基中 ,在 28 ℃、200rΠmin 培养农杆菌 ,每隔一段时间测定液体培养基
的 OD 值 ,结果如表 1。
表 1 　LB培养基中32 P2Na H2 PO4 对农杆菌生长的影响
Table 1 　Effects of 32 P2NaH2 PO4 in LB medium on the growth of Agrobacterium tumef aciens
取样时间
time (h)
波长
wavelength (nm)
对照 OD 值
CK OD
处理 1OD 值
treatment 1 OD
处理 2OD 值
treatment 2 OD
处理 3OD 值
treatment 3 OD
2 660 01005 01006 01007 01006
2 560 01017 01017 01017 01017
4 660 01075 01084 01098 01085
4 560 01110 01123 01141 01125
8 660 01230 01277 01276 01255
8 560 01314 01387 01380 01356
12 660 01453 01439 01463 01447
12 560 01614 01614 01631 01620
24 660 01642 01622 01610 01620
24 560 01876 01851 01830 01845
注 :对照加入同体积无菌水 ;处理 1、2、3 32 P 的引入量分别为 11169 ×105BqΠml、21338 ×105BqΠml、41677 ×105BqΠml。
Note :CKwith equal volume of sterilized water ; 32 P is 11169 ×105BqΠml ,21338 ×105BqΠml and 41677 ×105BqΠml respectively for treatment
1 ,2 and 3.
OD 值是目前广泛采用的衡量液体培养基中细菌密度的标准方法。表 1 结果表明 ,在不同
17　2 期 农杆菌对蕉柑 ( Citrus reticulata var. tankan Hayata)胚性细胞的附着研究
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时间、不同波长下取样测定的 OD 值在不同处理间基本一致 ,说明本实验在液体培养基中添加
的32 P 对农杆菌生长没有造成明显不良影响 ,用此种方法标记农杆菌是可行的。
21112 　32 P2NaH2 PO4 引入量对农杆菌的标记效果 　离心收集培养 24h 的标记农杆菌 ,用无菌水
反复冲洗 ,再用无32 P2NaH2 PO4 的LB 液体培养基重新悬浮 ,在盖革计数器上测定 cpm 值 ,结果
如表 2。
表 2 　32 P2Na H2 PO4 引入量对农杆菌标记的影响
Table 2 　Effect of 32 P in LB medium on radiolabeled Agrobacterium tumef anciens
处理
treatment
对照
CK
处理 1
treatment 1
处理 2
treatment 2
处理 3
treatment 3
cpm 49 ±3 3510 ±39 5193 ±17 6085 ±27
注 :CK、处理 1、2、3 同表 1。
Note :CK,treatment1 ,2 ,3 are same as table 1.
表 2 的数据表明 ,用32 P2NaH2 PO4 标记农杆菌 ,在一定范围内 ,农杆菌的标记强度与引入量
呈正相关 ,放射性引入强度越大 ,农杆菌的标记强度也越大。
21113 　标记农杆菌对蕉柑胚性愈伤组织的附着动态 　将处理 3 获得的标记农杆菌与蕉柑胚
性愈伤组织在 MT液体培养基中共培养 ,每隔一段时间离心收集胚性细胞 ,测定 cpm 值 ,结果
如图 1。
图 1 　标记农杆菌对蕉柑胚性愈伤组织的附着动态
Fig. 1 　Time course of attachment of radiolabeled
Agrobacteriun tumef anciens to citrus embryonic callus
图 1 表明 ,标记农杆菌对蕉柑胚性愈伤
组织的附着有一个明显的峰值。此峰值出
现在共培养 215～4h 左右 ,说明此时农杆菌
对蕉柑胚性愈伤组织的附着量达到了最大
值。
21114 　影响农杆菌附着蕉柑胚性愈伤组织、
胚性悬浮细胞因素 　(1) 表面活性物质和乙
酰丁香酮 (As) 对农杆菌附着蕉柑胚性悬浮
细胞的影响 :将处理 3 获得的标记农杆菌与
蕉柑胚性悬浮细胞在添加有吐温220 和 As
的 MT液体培养基中共培养 ,4h 后离心收集胚性悬浮细胞 ,分别测定 cpm 值 ,结果如表 3。
表 3 　表面活性物质和 As 对农杆菌附着蕉柑胚性悬浮细胞的影响
Table 3 　Effect of tween220 and As on attachment of radiolabeled Agrobacterium tumef anciens
to citrus embryonic callus
添加物
additive CK
As
(200μmolΠL) As(200μmolΠL) +tween220 (1 drip) As(200μmolΠL) +tween220 (2 drip)
cpm 103 ±4 102 ±2 102 ±3 101 ±1
　　表 3 显示 ,从 cpm 值来看 ,几种处理间没有显著差别 ,说明表面活性物质吐温220 以及 As
对农杆菌在蕉柑胚性悬浮细胞上的附着量可能没有影响。
(2)农杆菌与蕉柑胚性悬浮细胞共培养比较 :将处理 3 获得的标记农杆菌与蕉柑胚性悬浮
细胞按不同比例 ,在 MT + As200μmolΠL 液体培养基中共培养 ,4h 后离心收集胚性悬浮细胞 ,分
27 核　农　学　报 16 卷
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别测定 cpm 值 ,结果如表 4。
表 4 　共培养比例对农杆菌附着蕉柑胚性悬浮细胞的影响
Table 4 　Effect of ratio of bacteriumΠsuspension cell on attachment of radiolabeled
Agrobacterium tumef anciens to citrus embryonic callus
共培养比例
ratio of bacteriumΠ
suspension cell
107 个菌∶100mg 悬浮细胞
107 bacterium∶100mg
suspension cells
108 个菌∶100mg 悬浮细胞
108bacterium∶100mg
suspension cells
109 个菌∶100mg 悬浮细胞
109bacterium∶100mg
suspension cells
cpm 20 ±1 102 ±2 619 ±7
　　表 4 表明 ,农杆菌在蕉柑胚性悬浮细胞上的附着量与共培养比例呈正相关 ,菌Π细胞比越
大 ,附着量越多。
(3)农杆菌对不同材料的附着 :将处理 3 获得的标记农杆菌分别与蕉柑胚性愈伤组织及胚
性悬浮细胞在MT和MT + 200μmolΠL As 液体培养基中共培养 ,4h 后离心收集胚性悬浮细胞 ,测
定 cpm 值 ,结果如表 5。
表 5 　农杆菌对蕉柑胚性愈伤组织及胚性悬浮细胞的附着
Table 5 　Attachment of radiolabeled Agrobacterium tumef anciens to citrus embryonic callus
and citrus embryonic suspension cells
材　料 material 共培养介质 co2cultivation medium cpm
胚性愈伤组织　embryonic callus MT 106 ±1
胚性愈伤组织　embryonic callus MT + 200μM As 99 ±1
胚性悬浮细胞　embryonic suspension cells MT 103 ±4
胚性悬浮细胞　embryonic suspension cells MT + 200μM As 102 ±2
　　表 5 表明 ,几种处理间的 cpm 值没有显著差异 ,说明无论是在 MT共培养介质还是在 MT
+ 200μmolΠL As 共培养介质中 ,就附着量而言 ,农杆菌对蕉柑胚性愈伤组织及胚性悬浮细胞的
附着没有显著差别。
3 　讨 　论
农杆菌对受体材料的附着是成功实现外源基因转化的必要条件。早在 1978 年 Walter
Glogowski [5 ]就用实验证明了根癌农杆菌与马铃薯叶盘的附着是冠瘿瘤形成的前提。此后 ,
Matthysse[3 ]对农杆菌与胡萝卜细胞之间的附着进行了研究 ,表明农杆菌对胡萝卜细胞的附着
呈典型的饱和曲线。Douglas[2 ]用14 C 标记农杆菌研究了不同菌株农杆菌与烟草悬浮细胞之间
的附着 ,认为就附着量而言 ,不同菌株农杆菌对烟草悬浮细胞的附着存在差异。Neff[4 ] 用35 S 标
记农杆菌研究了农杆菌与西红柿悬浮细胞之间的吸附 ,结果表明 ,农杆菌对悬浮细胞的附着量
随共培养介质中农杆菌浓度的提高而增加。农杆菌与柑橘胚性细胞之间的附着还未见有详细
的报道 ,本实验对此进行了研究。结果表明 ,在一定放射性强度范围内 ,用32 P2NaH2 PO4 标记农
杆菌是可行的。这种标记方法为后面实验中的放射性测量带来了方便。32 P 标记的农杆菌与
蕉柑胚性细胞之间的附着曲线表明 ,农杆菌与蕉柑胚性细胞之间的附着存在一个动态过程 ,附
着曲线的最大值出现在农杆菌与蕉柑胚性细胞共培养 4h 左右 ,说明此时农杆菌对蕉柑胚性细
胞的附着量达到了最大。本实验获得的农杆菌与蕉柑胚性细胞动态附着曲线与 Matthysse[3 ] 及
37　2 期 农杆菌对蕉柑 ( Citrus reticulata var. tankan Hayata)胚性细胞的附着研究
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Douglas[2 ]等研究者的饱和曲线不同 ,可能是由于本实验中标记农杆菌与蕉柑胚性细胞共培养
时间较长 ,标记农杆菌的细胞分裂导致了附着有标记农杆菌的蕉柑胚性细胞放射性强度降低。
Robin[6 ]曾指出农杆菌由LB 培养基转移到植物组织培养的培养基后 ,有一个 2～3h 的生长滞
后期 ,此后农杆菌开始分裂增殖。
本实验对农杆菌附着蕉柑胚性细胞的影响因素进行了研究 ,认为就附着量而言 ,农杆菌对
蕉柑胚性细胞的附着受共培养介质中农杆菌的浓度影响显著 ,而受共培养介质中乙酰丁香酮
(As)及表面活性物质影响较小。关于乙酰丁香酮 (As) 对农杆菌附着植物细胞的影响 ,杨剑
波[1 ]曾报道共培养介质中的 As 能显著提高农杆菌对水稻、玉米、小麦等禾谷类作物的悬浮细
胞附着量。这与我们在蕉柑悬浮细胞上得出的结论不同。农杆菌对植物细胞的附着主要受其
染色体基因控制 ,而 As 的主要作用是诱导 Ti 质粒上的毒基因表达。As 对农杆菌附着植物细
胞的影响在不同植物上可能存在差异。
参考文献 :
[1 ] 　杨剑波 ,许智宏 ,卫志明 ,等. 阳性根癌农杆菌附着禾谷类作物培养细胞的因素. 实验生物学报 ,1993 ,26 (1) :1～6
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[3 ] 　Matthysse A G, Kathryn V H , Robin H G. Elaboration of cellulose fibrils by Agrobacterium tumefaciens during attachment to carrot
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tion on potato discs. Plant Physiol ,1978 ,61 :1031～1033
[6 ] 　Robin H G,Lamb P W ,Matthysse A G. Involvement of carrot cell surface proteins in attachment of Agrobacterium tumefanciens . Plant
Physiol . 1987 ,83 :564～568
STUDY ON ATTACHMENT OF Agrobacterium tumefanciens WITH
Citrus reticulata Var. tankan Hayata EMBRYOGENIC CELLS
WANG Sheng2bin1 　HUANG Zi2ran2 　YU Rang2cai1 　ZOU Wei2quan1
(11 College of Life Science , South China Agricultural University ;
21 College of Art Design , South China Agricultural . University , Guangzhou Guangdong prov. 　510642)
ABSTRACT :32 P2Na H2 PO4 in LB medium had no negative effect on the growth of Agrobacterium
tumefanciens when below the concentration of 1. 169 ×105 BqΠml , indicating that Agrobacterium tu2
mefanciens could be radiolabeled with 32 P2Na H2 PO4 . The kinetic experiment showed that attach2
ment of Agrobacterium tumefanciens to citrus embryogenic cells was a dynamic binding. The num2
ber of bacteria attached to embryogenic cells was correlated with bacterial population and was not
affected by Acetosyringone( As) or Tween220 in the co2cultivation medium.
Key words : Citrus reticulata Var. tankan Hayata ; embryogenic cell ; Agrobacterium tumef anciens ; at2
tachment
47 Acta Agriculturae Nucleatae Sinica
2002 ,16 (2) :70～74