全 文 ：文章编号 :100028551 (2006) 012032204
中国水仙离体诱变研究
庄晓英1 　卢　钢1 　汪志平2 　江鸿飞3
(11 浙江大学园艺系 ,浙江 杭州　310029 ;21 浙江大学原子核农业科学研究所 ,浙江 杭州　310029 ;
31 浙江省舟山普陀区农业局 ,浙江 舟山　316100 )
摘 　要 :以带鳞片叶的鳞茎盘为外植体 ,接种在添加激素的 MS 培养基上 ,通过激素组合筛选合适的培养
基获得不定芽 ,同时对在预分化培养基上接种 7d 的外植体、接种 25d 后转接到分化培养基上 3d 的外植
体、诱导产生的试管小鳞茎进行辐照诱变处理 ,研究了60 Coγ射线对中国水仙丛生芽分化以及小鳞茎生
长的影响。结果表明 ,接种 7d 的外植体更适合作为水仙离体诱变的材料 ,其不分化剂量为 50～60Gy ,半
剂量为 15～20Gy ,在 10 和 15Gy 处理中 ,发现了两种小鳞茎突变类型 ,一种为叶片数增多的矮化突变体 ,
一种为试管小球茎膨大速度加快 ,所以适宜辐射诱变的剂量为 10～20Gy。试管小鳞茎的辐射致死剂量
约为 50Gy ,半致死剂量为 25Gy。
关键词 :中国水仙 ;离体培养 ;辐射
IRRADIATION SYSTEM FOR NARCISSUS TAZETTA in vitro CULTURE
ZHUANG Xiao2ying1 　LU Gang1 　WANG Zhi2ping2 　J IANG Hong2fei3
(11Department of Horticulture , Zhejiang University , Hangzhou , Zhejiang , 310029 ;21 Institute Nuclear Agricultural Science ,
Zhejiang University , Hangzhou , Zhejiang 310029 ; 31Agriculture Bureau of Putuo , Zhoushan , Zhejiang , 316100)
Abstract :In order to breed new germplasm for Narcissus tazetta , the bulb of Narcissus tazetta is used as explants. The
adventitious buds is induced in MS media with hormone combination.γ2ray irradiation treatment of Narcissus tazetta combined
with tissue culture is studied. Three materials ,including the bulb basal plate tissues inoculated for 7 days ,tissues transferred in
fresh differentiation culture medium for three days after inoculated for 25 days ,and small bulbs in vitro ,are studied. The results
show that the suitable material for treatment is the bulb basal plate tissue with a thin part of scales after having been inoculated
for 7 days ,and regeneration dose is 50～60Gy ,the optimum treatment dose for breading is 15～20Gy. In the small bulbs
treated with 15Gy and 20 Gy ,two mutants were selected ,one is shorter with more leaves ,the other expands faster. The lethal
dose of small bulbs is about 50Gy ,and the half lethal dose is 25Gy.
Key words : Narcissus tazetta L. var. Chinensis Roem ; in vitro culture ;radiation breading
收稿日期 :2005201204
作者简介 :庄晓英 (19782) ,女 ,山东青岛人 ,在读研究生 ,研究方向为植物细胞与分子生物学 , Email :xyzhuang @126. com。卢钢为通讯作者 ,Tel :
0571286971349 ; Email :glu @zju. edu. cn　　中国水仙 ( Narcissus tazetta L. var. Chinensis Roem)隶属石蒜科水仙属 ,是中国十大传统名花之一。当前 ,随着世界花卉产业竞争越来越来激烈 ,中国水仙由于繁殖速度较慢、种球退化、花色单一 ,已不能满足市场需求。除依靠高效栽培管理措施和建立快繁体系外 ,更为重要的是需进行花卉品种改良。但中国水仙为同源三倍体 (3n = 30) ,遗传背景复杂 ,自然界种质资源有限 ,难 以用有性杂交方式改良和选育新品种[1 ] 。辐射诱变是创造植物新种质的重要手段之一 ,国内外在花卉辐射育种上已取得大量成果 ,特别是利用60 Coγ射线诱发花卉变异积累了丰富的经验。近年来 ,组织培养技术和辐射诱变的综合应用受到广泛关注。组织培养是一种较为成熟的细胞工程技术 ,与辐射诱变技术相结合可增大突变频率 ,扩大变异谱 ,为无性繁殖植物 ,尤其是观赏植物
23　 核 农 学 报　2006 ,20 (1) :32～35Journal of Nuclear Agricultural Sciences
提供新的育种途径[2 ,4 ] 。早期辐射育种主要以 X射线为
诱变源 ,20 世纪 60 年代后γ射线、中子应用渐广 ,20 世
纪 80 年代以来 ,氦、氖激光、离子束不断应用于花卉品
种培育 ,但60 Coγ射线仍是花卉和农作物上最常用的辐
射诱变源。有关中国水仙的辐射育种所见报道很少 ,而
且全部采用整个鳞茎球诱变的方式。辐射对株型矮化
有明显效果 ,中国科学院花卉中心对水仙鳞茎进行辐
射 ,得到了株型矮化的矮化水仙花[5 ] 。本试验以带鳞叶
的鳞茎盘为外植体进行组织培养 ,并结合辐射育种技
术 ,初步建立水仙的离体诱变体系 ,为探索水仙的复合
育种技术提供研究基础。
1 　材料与方法
111 　中国水仙丛生芽的诱导
采自浙江舟山地区 1、2 或 3 年生的中国水仙鳞茎
球 (生长期或休眠期) ,置于冰箱中 4 ℃下冷处理 40 d
作为供试材料。剥除外层的鳞片叶 ,切除鳞茎盘底部
的腐烂干枯部分 ,流水冲洗干净后转移到无菌条件下
进行消毒处理。具体消毒程序如下 :75 %的酒精处理
1min ,把鳞片叶切掉 3Π4 ,011 %升汞处理 15～20min ,转
移到无菌瓶中用 55 ℃～60 ℃的无菌水处理 2min ,再用
011 %升汞处理 5min ,无菌水冲洗 4 次后于无菌滤纸上
切取带 013cm 鳞片叶的鳞茎盘 ,接种备用。
将带鳞片叶的鳞茎盘纵切成 016cm ×013cm 的组
织块 ,接种在含不同浓度激素的培养基上 ,培养基组成
为 MS + BAP (0～15mgΠL) + NAA (0～2mgΠL) + 蔗糖
30gΠL + 琼脂粉 7gΠL 的预分化培养基上 ,每瓶接种 9 个
组织块 (来自 3 个不同的鳞茎) ,每处理接种 18 瓶 ,6 瓶
为一个重复 ,25d 后转接到分化培养基MS + BAP 5mgΠL
+ NAA 011mgΠL + 蔗糖 40gΠL + 琼脂 7gΠL 上 ,30d 后统
计分化率和增殖率。其中 ,分化率 ( %) = (分化外植体
数Π接种外植体数) ×100 % ,繁殖系数 = 分化芽数Π接
种外植体数。培养条件为温度 (25 ±2) ℃,光照 14hΠd。
112 　辐照处理
选择的两种辐照材料分别为在预分化培养基上接
种 7d 的外植体和接种 25d 后转接到分化培养基上 3d
的外植体。在预备试验中比较了 2 种材料对60 Coγ射
线的耐受性 ,初步对辐射剂量和辐射材料所处的分化
时期进行了筛选 ,选择上述两种外植体作为本试验的
辐射材料 ,剂量率为 1GyΠmin ,剂量为 0、5、10、15、20、
40、60Gy。另外 ,在分化培养基上培养 45d 诱导产生的
试管小鳞茎为进行辐照 ,辐照剂量为 0、5、10、25、50、
75、100、200Gy。辐照处理在浙江大学原子核农科学研
究所辐照中心进行。辐射材料于辐射当日或次日转移
到相应新鲜培养基上 ,培养条件同上 ,30d 后统计分化
结果。
2 　结果与讨论
211 　不同激素配比对不定芽分化的影响
表 1 　激素组合对鳞茎盘不定芽诱导的影响
Table 1 　The effect of hormone combinations on adventitious
buds initiated from bulbscales
植物激素
phytohormon(mgΠL)
NAA BAP
分化率
regeneration rate ( %)
增殖系数
propagation coefficient
0 77. 78 ±9. 62 abc 0. 93 ±0. 16 hijk
1. 0 85. 18 ±13. 98 abc 1. 22 ±0. 20 ghi
0 2. 0 87. 04 ±3. 21 abc 2. 17 ±0. 29 cdef
5. 0 87. 04 ±16. 98 abc 1. 56 ±0. 20 efgh
10. 0 90. 74 ±8. 49 ab 1. 41 ±0. 27 fgh
15. 0 64. 82 ±8. 48 cde 1. 00 ±0. 06 hig
0 87. 04 ±3. 21 abc 1. 50 ±0. 15 fgh
1. 0 100. 00 ±0. 00 a 1. 89 ±0. 11 defg
0. 1 2. 0 100. 00 ±0. 00 a 2. 83 ±0. 15 bc
5. 0 72. 22 ±16. 67 bcd 1. 07 ±0. 06 ghi
10. 0 90. 74 ±8. 49 ab 1. 67 ±0. 11 efgh
15. 0 77. 78 ±11. 11 abc 1. 31 ±0. 12 ghi
0 83. 33 ±14. 70 abc 1. 15 ±0. 08 ghi
1. 0 100. 00 ±0. 00 a 2. 59 ±0. 18 jklm
0. 5 2. 0 100. 00 ±0. 00 a 2. 70 ±0. 17 def
5. 0 98. 15 ±3. 21 a 3. 09 ±0. 50 bcde
10. 0 100. 00 ±0. 00 a 5. 76 ±0. 48 a
15. 0 100. 00 ±0. 00 a 2. 63 ±0. 33 cdef
0 81. 48 ±8. 49 abc 1. 33 ±0. 17 jklm
1. 0 100. 00 ±0. 00 a 2. 37 ±0. 08 efg
1. 0 2. 0 98. 15 ±3. 21 a 4. 55 ±0. 54 b
5. 0 53. 70 ±16. 97 de 1. 06 ±0. 20 klm
10. 0 68. 52 ±16. 97 bcde 1. 28 ±0. 19 jklm
15. 0 90. 74 ±16. 04 ab 2. 70 ±0. 12 bcde
0 50. 00 ±16. 67 de 1. 24 ±0. 18 jklm
1. 0 87. 04 ±13. 98 abc 3. 11 ±0. 42 bc
2. 0 2. 0 96. 30 ±6. 41 a 2. 65 ±0. 21 cdef
5. 0 48. 15 ±16. 98 e 0. 54 ±0. 14 no
10. 0 18. 52 ±13. 98 f 0. 20 ±0. 17 o
15. 0 11. 11 ±9. 62 f 0. 11 ±0. 10 o
注 :字母表示显著水平 (0101) ;每个处理外植体数为 54 个.
Note: Letters indicate significance ( 0. 01 ) ; 54 explants were used for each
treatment .
　　本研究在改进消毒方法 ,使污染率降低到 5 %以
下的基础上考察了不同激素配比对鳞茎盘分化的影响
(表 1) 。由表 1 可见带鳞片叶的鳞茎盘的分化对培养
基的选择不是很严格 ,在不添加激素的基本 MS 培养
33　1 期 中国水仙离体诱变研究
基上也会诱导丛生芽的发生。对芽的诱导速度、诱导
率、繁殖系数、丛生芽的质量等几方面作出比较 ,芽的
诱导以在预分化培养基 MS + BAP 10mgΠL + NAA
015mgΠL 上培养 25d 后 ,转接到分化培养基上的诱导效
果最好。在上述培养茎条件下 ,外植体接种 5d 时 ,鳞
叶开展 ,鳞叶边缘出现白色绒状物质 ;到 15d 时 ,在少
数叶腋处可观察到白色的突起 ;转接到分化培养基上
以后 ,外植体膨大趋于停止 ,逐渐进入分化旺盛阶段 ,
6d 后叶腋处产生大量的突起 ,原来的突起形成芽 ,30d
后调查 ,繁殖系数为 4113 ±0156 (白色的芽状体不计) ,
分化率达到 100 % ,每个外植体上最多可以分化出 16
个芽 ,并且随着培养时间的延长分化的芽数有继续增
多的趋势。
212 　不同分化时期外植体的辐射敏感性
经不同剂量60 Coγ射线照射的两种外植外与对照
相比 ,均分别表现为分化能力的降低 ,但随着辐射剂量
的增加 ,分化率与辐射剂量之间并不是呈简单的反比
关系 ,在低于 10Gy 时 ,分化率降低较少 ,而高于这个剂
量时辐射对不定芽分化的抑制非常明显。由表 2 可以
看出 :1)接种 7d 的外植体 25d 后转接的外植体 ,不分
化剂量在 50～100Gy ;半分化剂量 (大约有一半外植体
不分化)在 10～50Gy 间。2) 接种 7d 的外植体的耐辐
射能力比培养 25d 后转接的鳞茎盘强 ,在低辐射剂量
处理下 ,虽然两种材料均有较高的分化率 ,但接种 7d
的外植体的繁殖系数高于培养 25d 后转接的材料 ,并
且后者分化的芽很可能是在辐射处理前已经存在的 ,
表 2 　辐射以及处理时期对中国水仙鳞茎盘不定芽分化的影响
Table 2 　Effect of radiation and treatment time after
inoculating on regeneration of adventitious buds
外植体类型
explant type
剂量
dose ( Gy)
分化率
regeneration
rate ( %)
繁殖系数
propagation
coefficient
接种 7d 的鳞茎切片
bulb scales in 7th day
after inoculation
接种 25d 转接 3d 的鳞茎切片
bulb2scales in 3th day after
transferring following 25d
in vitro culture
0 93. 75
5 83. 33 2. 02
10 64. 58 1. 08
50 6. 25 0. 06
100 0. 00 0. 00
200 0. 00 0. 00
0 93. 75 2. 63
5 95. 83 1. 00
10 87. 50 0. 94
50 29. 17 0. 31
100 0. 00 0. 00
200 0. 00 0. 00
注 :外植体数为 48。
Note :No. of explants is 48.
而不是在辐射处理后分化出来的 ,所以处于接种早期
的材料更适合作为水仙离体辐射的诱变材料。
213 　辐射对试管小鳞茎成活率的影响
辐射剂量的大小直接影响试管小鳞茎的成活率
(表 3) 。经不同剂量的60 Coγ射线处理后 ,小鳞茎的生
长受到明显抑制 ,剂量越大 ,抑制作用越明显。75Gy
以上的剂量处理使小鳞茎不能成活 ,10Gy 处理的有
66167 % 存活下来 ,但是经生根培养后的移栽成活率
明显低于没有辐照的对照小鳞茎。从小鳞茎的外部形
态表现来看 ,经辐照处理后的小鳞茎随辐照剂量的增
大 ,外植体的褐化程度逐渐加重 ,受 50Gy 以上γ射线
处理后的小鳞茎 ,上部不抽生新的叶片 ,经不断的转接
培养仍不能恢复 ,最后整体褐化死亡。可以基本确定
试管小鳞茎的辐射致死剂量约为 50Gy ,半致死剂量为
25Gy。
表 3 　不同辐射处理对试管小鳞茎成活率的影响
Table 3 　Effect of radiation on the survival
percent of the bulblets in tube ( %)
剂量
dose ( Gy)
试管成活率
survival percent in tube
移栽成活率
survival percent of transplant
0 100. 00 93. 75
5 81. 25 56. 25
10 66. 67 39. 58
25 52. 08 31. 25
50 2. 08 0. 00
75 0. 00 0. 00
100 0. 00 0. 00
200 0. 00 0. 00
214 　辐射对接种 7d 的外植体不定芽分化的影响
5Gy处理对切口不定芽分化作用不明显 ,随着辐
射剂量的增加 ,不定芽分化受到明显抑制 ,增殖系数和
转接成活率明显降低。从表 4 可以看出 ,中国水仙接
种 7d 的外植体的半分化剂量在 15～20Gy ,不分化剂量
在 50～60Gy。根据对接种 7d 的外植体辐射的结果和
半分化剂量效应可以推断水仙外植体的辐射诱变适宜
剂量为 10～20Gy。在不同处理中分化得到的小鳞茎 ,
从植物学形态上来看主要有两种变异类型 ,一种为叶
片数增多的矮化变异株 ,另一种为分化形成的离体小
鳞茎膨大速度明显快于对照 ,这两种变异主要发生在
15 和 20Gy 处理中。对得到的突变苗进行分切增殖继
代培养 ,其突变性状并没有随继代次数的增加而消失 ,
但变异的稳定性还需要进一步观察。
43 核　农　学　报 20 卷
表 4 　辐射处理对不定芽分化的影响
Table 4 　Effect of radiation on regeneration of adventitious buds
剂量
dose ( Gy)
辐照外植体数
No. of explants
分化外植体数
No. of regenerants
分化率
regeneration rate ( %)
分化芽数
No. of regeneration
繁殖系数
propagation coefficient
0 (CK) 60 60 100. 00 265 4. 42
5 100 87 87. 00 212 2. 12
10 120 83 69. 17 126 1. 05
15 120 65 54. 17 76 0. 63
20 100 46 46. 00 52 0. 52
40 60 9 15. 00 13 0. 22
60 60 0 0. 00 0 0. 00
3 　讨论
辐射结合生物技术 ,可在短期间内能有效地诱发
突变。利用水仙鳞茎盘切片在试管中诱导产生小鳞茎
的研究已有一些报道[6～8 ] ,但由于水仙萌动需低温处
理 ,且鳞茎盘及鳞叶消毒不便 ,愈伤组织的诱导培养和
外植体直接诱导生长都较困难 ,故一直没能有效地建
立水仙的高频再生系统。本研究表明水仙鳞茎盘芽的
诱导以在预分化培养基 MS + BAP10mgΠL + NAA015mgΠ
L 上培养 25d 后 ,转接到分化培养基上的诱导效果最
好 ,转接 30d 后分化率可达 100 % ,平均每个外植体可
产生 5176 个芽。
建立一个良好的辐射诱变体系是获得突变体的前
提和基础 ,利用γ射线建立中国水仙离体诱变体系以
获得突变体的研究还未见报道。辐射育种中除对剂量
的考察外 ,关键是对辐照材料和辐照时期的选择 ,不同
生理过程和不同发育时期的花卉对射线辐照的敏感性
差异很大[9 ] 。根据对接种 8d 内的外植体的细胞学观
察和组织培养过程中外植体表现 ,接种 7d 的外植体处
于分化的准备阶段 ,大量分裂旺盛的细胞 (细胞核大 ,
细胞小而紧密)聚集一团 ,而接种 25d 后转接的材料处
于分化大量启动的阶段 ,所以我们选择接种 7d 的外植
体、在预分化培养基上培养 25d 后转接到分化培养基
上 3d 的外植体以及已分化形成的试管外植体等 3 种
不同时期的离体材料作为辐射处理材料。通过比较 3
种试管材料对不同辐射剂量的反应 ,结果表明 ,合适的
诱变材料为接种 7d 的带鳞片叶的外植体。同时得出
了其半致死剂量和致死剂量分别为 15～20Gy、50～
60Gy ,所以接种 7d 的外植体的辐射诱变适宜剂量为 10
～20Gy。本试验中发现了两种小鳞茎突变类型 ,一种
为叶片数增多的矮化突变体 ,一种为试管小球茎膨大
速度加快。在预分化培养基上 25d 后转接的材料以及
试管小鳞茎对辐射较敏感 ,而李震华[10 ] 研究表明 ,水
仙活体鳞茎球对γ射线辐射剂量适应范围较广 ,2～
6kGy 属适宜剂量。
现有辐照产生的试管苗生根后已部分移栽入大
田 ,并对单株进行了蛋白和分子标记分析 ,进一步需通
过田间观察和实验室手段验证突变株系 ,达到提前筛
选的目的 ;另一方面由于辐射诱发的营养突变体多以
嵌合体的形式存在 ,因此要对试管里的无菌苗进行分
切增殖 ,继代培养 ,使突变细胞萌发突变芽 ,通过对其
无性系后的筛选 ,得到有观赏价值和研究价值的突变
体。
致谢 :本研究承蒙浙江大学核农所辐照中心赵小俊老
师的帮助 ,特此致谢。
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