全 文 ：文章编号 :100028551 (2009) 032454204
秋水仙素诱导青岛百合四倍体研究
张俊芳　刘庆华　王奎玲　刘庆超　孙　阳
(青岛农业大学园林园艺学院 ,青岛　266109)
摘 　要 :以青岛百合试管苗为试验材料 ,采用浸泡法和混培法研究了秋水仙素对青岛百合进行染色体加
倍的诱导效果。结果表明 :以 0105 %的秋水仙素浸泡处理 24h 的诱导效果最佳 ,诱导频率高达 5313 % ;
经秋水仙素诱导的多倍体与正常二倍体植株比较 ,植株叶片变大 ,根系粗壮 ,气孔显著增大而单位面积
气孔数减少。对变异材料的细胞学研究发现 , 四倍体植株的染色体数目为 2 n = 4 x = 48。
关键词 :青岛百合 ; 秋水仙素 ; 四倍体
TETRAPLOID INDUCTION OF Lilium tsingtauense BY COLCHICINE
ZHANGJun2fang 　LIU Qing2hua 　WANG Kui2ling 　LIU Qing2chao 　SUN Yang
( College of Landscape and Horticultural , Qingdao Agriculture University , Qingdao 　266109)
Abstract : Using plantlets of Lilium tsingtauense as materials , the inducing effects of doubling chromosome of Lilium
tsingtauense with colchicines were studied. The results indicated that the best effect was obtained by the treatment of immersing
the shoot tips in colchicines solution at 0105 % for 24h , and its induction rate was 5313 %. Compared with the normal diploid
plants , the colchine2induced polyploid plants had larger leaves , bigger roots , larger stomata and fewer stomata per unit area.
Cytological observation confirmed them to be tetraploids with a chromosome number of 2 n = 4 x = 481
Key words : Lilium tsingtauense ; chochicine ; tetraploid
收稿日期 :2008212202 　接受日期 :2009202217
基金项目 :山东省农业良种工程重大课题 (鲁科农号[2005 ]99 号)
作者简介 :张俊芳 (19822) ,女 ,山东省昌邑人 ,硕士研究生 ,研究方向为园林植物遗传育种。zhangjunfang0827 @1631com
通讯作者 :刘庆华 (19622) ,男 ,山东省乳山人 ,博士 ,教授 ,研究方向为园林植物种质资源与创新。
　　青岛百合 ( Lilium tsingtauense Gilg) 又名崂山百合 ,
是青岛崂山特有植物 ,属百合科 ,百合属 ,其花色艳丽 ,
株型美观 ,具有很高的观赏价值 ,是百合属植物优良的
种质资源。
多倍体具有巨大性、可孕性低、适应性强等特
点[1 ] ,因而受到育种学家重视。我国自黄济明[2 ] 试管
内诱导百合多倍体获得成功以来 ,已有多位育种学家
做过此方面的研究 ,如刘选明[3 ] 等利用秋水仙素诱导
得到龙牙百合四倍体植株 ;何林等[4 ] 用秋水仙素处理
东方百合 Tiber 的鳞茎获得了多倍体植株 ;池坚等[5 ] 以
东方百合 Siberia 试管苗为试验材料 ,研究了秋水仙素
对诱导百合多倍体的影响 ;王艳丽等[6 ] 用秋水仙素处
理气培法获得的兰州百合小鳞茎 ,得到四倍体植株。
这些研究为培育百合新种质奠定了基础。
青岛百合目前还处于野生状态 ,其研究主要集中
于资源分布、繁殖技术等方面 ,而对其诱变育种研究尚
未见报道。本研究以青岛百合组培苗为材料进行多倍
体诱导 ,旨在培育青岛百合四倍体植株 ,以进一步提高
其观赏性、抗逆性 ,进而选育出适合市场需要的花卉新
品种。
1 　材料与方法
111 　材料
以青岛农业大学园林组培室的青岛百合无菌试管
苗为试验材料。
112 　多倍体的诱导
11211 　浸泡法 　选取青岛百合试管苗中切除叶片的
454　 核 农 学 报　2009 ,23 (3) :454～457Journal of Nuclear Agricultural Sciences
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不定芽 ,将其转移到已灭菌、浓度为 0102 %、0105 %和
0110 %的秋水仙素溶液中 ,分别浸泡 12、24 和 36h ,对
照用无菌水处理 24h ,共计 10 个处理组合 ,每种组合处
理 30 株。处理完后的不定芽用无菌水清洗 ,接种到
MS+ 62BA 115mgΠL + NAA 012mgΠL 培养基上培养约
20d ,恢复生长后接于 1Π2MS + 015mgΠL NAA 培养基中
生根 ,待根长约 115cm 时进行染色体倍性鉴定。
11212 　混培法 　将青岛百合试管苗中切除叶片的不
定芽 ,转接到添加有浓度分别为 0102 %、0105 %和
0110 %的秋水仙素溶液的培养基上 ,分别处理 7、14 和
21d ,共计 9 个处理组合 ,每种组合处理 30 株 ,处理完
后转入不含秋水仙素的培养基上继续培养约 20d ,生
根 ,待得到完整植株后进行倍性鉴定。
113 　多倍体的鉴定
11311 　气孔鉴定 　取相同培养状态下的二倍体及鳞
片明显肥大植株的展开叶片 ,撕取其下表皮 ,经 I22KI
染色后制片 ,在Olympus 显微镜 20x 物镜下观测比较叶
片气孔大小及密度。以气孔显著增大作为变异的初步
鉴定指标。
11312 　染色体鉴定 　对气孔显著增大的变异株 ,取根
尖采用改良苯酚品红染色法制片 ,在显微镜下观察并
摄像。根据染色体数目判断其倍性。
2 　结果与分析
211 　秋水仙素对青岛百合多倍体诱导的影响
21111 　浸泡法 　从表 1 可以看出 ,青岛百合试管苗在
不同浓度秋水仙素溶液中浸泡一定时间后 ,均能产生
一定比例的变异 ,同时 ,试管苗的生长和分化也在不同
程度上受到抑制 ,甚至死亡。以气孔显著增大作为多
倍体变异的初步指标 ,则以 0105 %的秋水仙素浸泡
24h 时无菌苗的变异率最高 ,达到 5313 %。随着秋水
仙素浓度的增加和浸泡时间的延长 ,试管苗的死亡率
升高。可见浸泡法诱导青岛百合多倍体时以 0105 %
秋水仙素处理 24h 为宜。
经秋水仙素溶液浸泡处理过的试管苗在接种初期
生长缓慢 ,大约在 20d 左右会陆续出现“烂心现象”。
烂心从基部开始 ,由中心向外围逐渐腐烂 (图 1) ,应及
时将烂掉的部分切除 ,剩余的组织可接到分化培养基
上继续培养分化成苗。否则 ,任其继续生长最终会造
成整株植株完全死亡。
21212 　混培法 　从表 2 可以看出 ,在培养基中添加不
同浓度的秋水仙素对诱导青岛百合四倍体有一定效
果 ,变异率随着处理时间和浓度的变化而变化。处理
　　　表 1 　秋水仙素溶液浸泡对青岛百合多倍体诱导的影响
Table 1 　Effect of immersing adventitious in colchicines
on inducing polyploids of Lilium tsingtauens
秋水仙素
colchicines
( %)
处理时间
treating time
(h)
处理数
number of
treated buds
死亡数
death
number
死亡率
death
rate ( %)
变异数
number of
mutation
变异率
mutational
rate ( %)
0 24 30 0 0 0 0
0102 12 30 0 0 0 0
24 30 0 313 1 313
36 30 2 313 4 1313
0105 12 30 2 317 6 2010
24 30 7 2313 16 5313
36 30 13 4313 11 3617
011 12 30 9 3010 11 3617
24 30 16 5313 9 3010
36 30 23 7617 5 1617
图 1 　秋水仙素诱导后青岛百合的“烂心现象”
Fig. 1 　Decay phenomenon of Lilium tsingtauense
after inducement by colchicines
表 2 　培养基添加秋水仙素对青岛百合多倍体诱导的影响
Table 2 　Effects of adventitious cultured in colchicines
medium inducing polyploids of Lilium tsingtauens
秋水仙素
colchicines
( %)
处理时间
treating time
(h)
处理数
number of
treated buds
死亡数
death
number
死亡率
death
rate ( %)
变异数
number of
mutation
变异率
mutational
rate ( %)
0 14 30 0 0 0 0
0102 7 30 0 0 0 0
14 30 1 313 0 0
21 30 2 617 2 617
0105 7 30 2 617 1 313
14 30 5 1617 8 2617
21 30 7 2313 6 2010
011 7 30 6 2010 3 1010
14 30 8 2617 3 1010
21 30 15 5010 2 617
时间短 ,秋水仙素浓度低 ,变异率低 ;处理时间延长 ,秋
水仙素浓度增加 ,变异率随之增加。当培养基中添加
0105 %的秋水仙素溶液处理 14d 时 , 变异率达到
2617 %。但随处理时间继续延长、秋水仙素浓度继续
增大 ,变异率反而降低。因此要获得较高的变异率 ,处
554　3 期 秋水仙素诱导青岛百合四倍体研究
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理时间和秋水仙素浓度至关重要。混培法以添加
0105 %的秋水仙素处理 14d 效果最佳。总体上混培法
对百合材料的毒害较小但多倍体的诱导效果没有浸泡
法好。
212 　多倍体的鉴定
21211 　外部形态 　诱导后的青岛百合四倍体试管苗
比二倍体生长旺盛 ,叶片宽大肥厚 ,叶色深绿 ,部分叶
形有所变化 (图 2) ;鳞片比二倍体肥大且具明显斑点
(图 3) ;根系粗壮 (图 4) ;新生小种球也显著增大。
图 2 　二倍体 (中)与四倍体 (两侧)叶片比较
Fig. 2 　Comparisons of leaf size between diploid
(middle) and tetraploid (sides)
图 3 　四倍体鳞茎
Fig. 3 　The tetraploid bulb
图 4 　二倍体 (左)与四倍体 (右)根的比较
Fig. 4 　Compared roots of diploid (left)
with the tetraploid (right)
21212 　气孔鉴定 　气孔大小及其密度是鉴定二倍体
与多倍体的间接指标。观测结果表明 (图 5) :四倍体
气孔明显较二倍体的大 ,单位面积内的气孔数目显著
减少。二倍体气孔保卫细胞长 ×宽 = 979164μm ×
756129μm ,平均气孔密度为 53168 个Π视野 ;四倍体气
孔保卫细胞长 ×宽 = 1672144μm ×1165150μm ,平均气
孔密度为 36172 个Π视野 (数据为放大后的相对长度和
宽度) 。二倍体与四倍体植株的叶下表皮气孔密度及
气孔保卫细胞长、宽差异均达到了极显著的水平。
21213 　染色体鉴定 　分别切取二倍体和初步鉴定为
四倍体的植株的根尖进行染色体制片。观察显示 ,二
倍体的染色体数目为 2 n = 2 x = 24 ,四倍体染色体数目
为 2 n = 4 x = 48 (图 6) ,进一步证明了诱导后的植株为
四倍体。在染色体观察中还发现 ,大部分变异株为嵌
合体 ,即细胞中既有 2 n = 2 x = 24 的二倍体细胞 ,也有
2 n = 4 x = 48 的四倍体细胞。
3 　讨论
多倍体诱导技术是一种有效的育种手段 ,是创造
图 5 　青岛百合二倍体 (左)和四倍体 (右)气孔大小比较
Fig.5　Stoma size of Lilium tsingtauense of diploid (left) and tetrapoid(ringht)
654 核　农　学　报 23 卷
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图 6 　诱变处理后的细胞染色体数目
Fig. 6 　Chromosome number of cells after induction treatment
新种质 ,培育优良品种的有效途径。前人对其他百合
品种的倍性育种研究表明 :四倍体植株茎杆、叶片、花
朵均显著大于原有二倍体类型[5 ,6 ] 。本研究证明青岛
百合易于进行多倍体诱导 ,且其植株、叶片明显大于二
倍体植株 ,其观赏价值与抗性是否有提高需进一步观
察。
秋水仙素是诱导多倍体的常用试剂 ,在多种植物
试验中均取得明显效果[7～9 ] 。秋水仙素浸泡和混培 2
种方法在诱导青岛百合多倍体的过程中均出现“烂心”
现象 ,原因可能是秋水仙素毒性较大 ,处理一定时间后
毒性完全渗透到材料细胞 ,造成细胞死亡。这说明青
岛百合对秋水仙素非常敏感 ,秋水仙素对百合的伤害
难以避免。Van Tuyl [10 ]研究小组在研究秋水仙素的替
代品时指出 ,浓度范围为 01001 %～01010 %的 Oryzalin
和秋水仙碱比较 ,有较高的加倍率 ,而对植物生长的抑
制作用较小。但石亮[11 ]在研究 Oryzalin 对百合多倍体
效果时发现 ,不同百合对 Oryzalin 处理的反应不同 ,其
中东方系列百合对 Oryzalin 敏感 ,很容易死亡。因此 ,
Oryzalin 能否替代秋水仙素诱导青岛百合多倍体 ,减少
诱导时对不定芽的伤害需深入探讨。
浸泡和混培两种方法相比 ,混培法对鳞片的伤害
程度较低 ,表现为处理后死亡率低 ,但诱变效果不如浸
泡法 ,且成本较高。因此 ,浸泡法对诱导青岛百合多倍
体较为适宜。
一般认为 , 秋水仙素诱导后的植株大部分为嵌合
体。嵌合体若不经过分离稳定则会产生回复突变 , 最
后变成正常的二倍体。本研究发现变异植株中大部分
为嵌合体 ,选取形态明显变异的鳞片在 MS + 115 mgΠL
62BA + 012mgΠL NAA 的培养基上可再次诱导产生不定
芽 , 然后通过多次继代培养 , 可分离出稳定的多倍体
植株。
在染色体观察鉴定过程中 , 在变异植株中发现部
分细胞染色体为非整倍体 ,如染色体数目为 56 , 对其
产生的原因及影响有待进一步的研究。
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