全 文 ：核 农 学 报 2011，25(1):0057 ～ 0061
Journal of Nuclear Agricultural Sciences
文章编号:1000-8551(2011)01-0057-05
响应面法优化桔青霉 F-5-5 核酸酶 P1
发酵培养基碳氮源
梁新乐1 黄莹莹1 张 虹1 陈 敏1 刘 璇2
(1.浙江工商大学生物工程系，浙江 杭州 310035;2. 北海市环境科学研究所，广西 北海 536000)
摘 要:桔青霉(Penicillium citrinum)CICC 4011 菌株经60 Co γ 射线诱变后，由其高产突变株经基因组重
排育种筛选获得核酸酶 P1 高产菌株 F-5-5，在马铃薯葡萄糖培养基中产酶达 978. 6U /ml。经 Placket-
Burman 试验筛选得出影响菌株产酶的 3 个显著因素，为葡萄糖、可溶性淀粉和玉米浆干粉。在此基础
上，采用响应面中心组合设计，对 3 因素最佳水平范围进行研究，利用 Minitab15 软件进行回归分析，结
果表明，葡萄糖、可溶性淀粉和玉米浆干粉的含量分别为 30. 89、42. 46 和 11. 60g /L 时，核酸酶 P1 理论
产量为 1687. 16U /ml，实际发酵单位提高到 1672. 6U /ml。
关键词:桔青霉;培养基优化;核酸酶 P1;响应面法
RESPONSE SURFACE OPTIMAZATION OF CARBON AND NITROGEN SOURCES
FOR NUCLEASE P1 PRODUCTION BY Penicillium citrinum F-5-5
LIANG Xin-le1 HUANG Ying-ying1 ZHANG Hong1 CHEN Min1 LIU Xuan2
(1. Department of Biotechnology，Zhejiang Gongshang University，Hangzhou，Zhejiang 310035;
2. Beihai Institute of Environmental Science，Beihai，Guangxi 536000)
Abstract:Penicillium citrinum F-5-5，a nuclease P1 high-producing strain with 978. 6U /ml in potato glucose medium，
was derived from the original Penicillium citrinum CICC 4011 with 60 Co γ-rays irradiation mutation and then protoplasts
fusion treatment. Culture components were optimized for the nuclease P1 production，and response surface methodology
was applied for the critical medium components (carbon and nitrogen sources)which were preselected by Plackett-
Burman design approach. Glucose，soluble starch and corn steep powder showed significant effects on production of
nuclease. Central composite design was used for the optimization levels by software Minitab 15，and it showed that，the
optimal values for the concentration of glucose，soluble starch and corn steep powder were 30. 89，42. 46 and 11. 60g /
L，respectively. With this medium，an enzyme activity of 1687. 16U /ml could be obtained theoretically. Using this
optimized medium，an experimental enzyme activity of 1672. 6U /ml was reached.
Key words:Penicillium citrinum;optimizing medium;nuclease P1;response surface methodology relative
收稿日期:2010-03-03 接受日期:2010-05-17
基金项目:浙江省科技攻关项目(2008C21011)
作者简介:梁新乐(1969 －)，男，湖北江陵人，博士，教授，主要研究方向微生物学。Tel:0571-88071024-8582;E-mail:dbiot@ mail. zjgsu. edu. cn
核酸酶 P1 是一种磷酸二酯酶，可水解单链 DNA
或 RNA 生成单核苷酸。大规模生产 5′-核苷酸是核酸
酶 P1 的主要用途。此外，核酸酶 P1 在分子生物学领
域也有广泛应用。桔青霉(Penicillium citrinum)是核
酸酶 P1 的重要生产菌种［1］。有关核酸酶 P1 高产菌
株选育的研究报道较多，胡丹东等［2］以菌桔青霉
050421 为出发菌株，经过紫外线(UV)、LiCl 诱变处
理，得到遗传稳定性较好的产核酸酶 P1 的突变菌株，
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核 农 学 报 25 卷
酶活力比原始出发菌株提高了约 1. 4 倍。Ying 等［3］
对核酸酶 P1 的固定化过程进行了优化应用。李科德
等［4］通过多次复合诱变，并通过单因子和正交试验对
产酶发酵条件的优化试验，使得桔青霉的产酶水平由
原来的 280U /ml 提高到 1329U /ml。
生产菌株的高产特性不仅由其遗传特性决定，而
且也与培养条件有关。培养基的组成和培养条件对产
酶的影响非常大，因此，培养基的优化设计是发酵生产
的关 键 环 节 之 一。响 应 面 法 ( response surface
methodology)在多变量系统中用于研究变量的作用及
寻找最适条件方面得到广泛应用，包括优化反应条件
和优化发酵条件等［5 ～ 7］，通过响应面法优化培养基提
高发酵产物的实例也有较多报道［8 ～ 11］。
在以前的研究［12］中，我们通过基因组重排育种获
得一系列核酸酶 P1 产量突变株，并对产酶水平与形态
分化进行了报道。以往文献报道中核酸酶 P1 发酵培
养多采用葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨等精细原料作为碳、
氮源，不太适合于生产上廉价粗料的要求;并且这种精
细易利用的碳氮源可能引起代谢物阻遏从而影响产酶
率。本文在以前研究的基础上，对发酵培养基中的碳、
氮源进行筛选和优化，一方面创造适合菌体生长和生
物代谢的最佳条件，充分发挥菌种的生产潜力;另一方
面希望通过选取常用工业级碳、氮源品种，降低生产成
本。通过对单因素进行 Plackett-Burman 优化设计，筛
选出影响显著性因素，再利用响应面法中心组合设计
(central composite design)对关键因素进行优化，以期
提高核酸酶 P1 产量。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 菌种 桔青霉 (Penicillium citrinum)F-5-5 具
有核酸酶 P1 高产性 状 (978. 6U /ml)，由 桔 青 霉
(Penicillium citrinum)CICC 4011(购自中国食品发酵
研究院中国工业微生物菌种保存中心)经过60 Co γ 射
线诱变，再经过基因组重排育种所获得的融合子。
1. 1. 2 培养基 种子培养基为马铃薯培养基(PDA)，
包括马铃薯 200g /L、葡萄糖 20g /L、琼脂 15 ～ 20 g /L、
pH 自然。马铃薯去皮，切成块煮沸 30min，然后用 6
层纱布过滤，再加入葡萄糖及琼脂，溶化后补足水至
1000ml，121℃灭菌 20min。
发酵基本培养基，包括葡萄糖 30g /L、蛋白胨 5g /
L、KH2PO4 0. 5g /L、MgSO4 · 7H2O 0. 4g /L、ZnSO4 ·
H2O 0. 4g /L、MnCl2·4H2O 0. 4g /L、pH6. 5，121℃灭菌
20 min。
1. 2 方法
1. 2. 1 菌种活化 将菌种转接到活化培养基平板
(PDA)上，于 28℃恒温培养，3d 后将孢子用接种环转
接到另一块平板，28℃恒温培养 3d 后转接至试管斜面
(种子培养基)，28℃恒温培养 3d。
1. 2. 2 摇瓶培养 将活化好的菌种接入装有 100ml
发酵培养基的 500ml 三角瓶中，于 28℃、280r /min 摇
床培养 96h 左右，收集发酵液并过滤，滤液用于测定核
酸酶 P1 活力。
1. 2. 3 酶活测定 发酵液滤液放入 65℃ 水中水浴
10min，取出立即放入冰中冷却到 4℃待测。离心管中
加入 1. 9ml 底物(内含 1% RNA，0. 125mol /L pH 5. 1
醋酸缓冲液，1 × 10 － 3 mol / L ZnSO4)在 67℃恒温水浴
中保温 10min，加入预先稀释的酶液 0. 1ml，准确计时，
15min 后取出离心管，冰水浴数秒，迅速加入 2. 0ml 预
冷的核酸沉淀剂(0. 25% 钼酸铵 ～ 2. 5% 高氯酸)，冰
浴 20min，3000r /min 离心 5min，取 0. 1ml 上清液加至
4. 9ml 蒸馏水中。另做对照:底物在 67℃保温 25min，
加入预冷的沉淀剂，再加入酶液，方法同上。在 260nm
测定样品与对照光密度差(△OD)260nm。每分钟所
生成的核苷酸量使得在 260nm 的光密度差(△OD)为
1. 0 时定义为 1 个酶活单位(U)。发酵液的酶活计算
公式为:
酶活(U /ml) = ΔOD × a × 4 × 500. 1 × 15
，
式中 a 为酶液测定活力前预先稀释的倍数。
1. 2. 4 Placket-Burman 设计 PB 法主要用于试验因
子显著性筛选。采用 12 试验次数筛选 8 个因子。试
验结果采用最小二乘法来拟合一次方程模型:
Y = b0 + b1X1 + b2X2 + b3X3 +
b4X4 + b5X5 + b6X6 + b7X7 + b8X8
式中 Y 为酶活力预测值，b0，b1，b2，b3，b4，b5，b6，b7，
b8分别为回归系数，X1，X2，X3，X4，X5，X6，X7，X8 分
别代表变量符号的水平。
1. 2. 5 中心组合试验设计 优化过程中所有试验设
计、数据处理及模型建立皆采用 Minitab 15 软件进行。
根据 Plackett-Burman 设计筛选出的显著因子，以
Minitab 15 软件设计中心组合试验，拟合数据得到描
述因变量(酶活力)与自变量(培养基组份)关系的二
阶经验模型式:
y = β0 +∑β i x i +∑β ij x i x j +∑β ii x2ii
式中:y 为预测响应值，即核酸酶 P1 活力(U /ml );β0
为回归系数;xi 为自变量的编码水平。用 Minitab 15
85
1 期 响应面法优化桔青霉 F-5-5 核酸酶 P1 发酵培养基碳氮源
软件对试验数据进行回归拟合，并对拟合方程作显著
检验和方差分析。
表 1 试验设计中各参数的编码值及其质量浓度
Table 1 Code and concentration of parameters
in Plackett-Burman (PB)design
变量 variable 水平 level (g /L)
符号
symbol
因子
factor
低 low
(－ 1)
高 high
(+ 1)
X1 葡萄糖 glucose 20 40
X2 可溶性淀粉 soluble starch 20 60
X3 米粉 rice powder 10 40
X4 蔗糖 sucrose 10 30
X5 玉米浆干粉 corn steep powder 7 15
X6 豆粕粉 soybean oil meal 10 30
X7 豆粉 soybean meal 10 30
X8 豆胨 soybean peptone 10 30
2 结果与分析
2. 1 采用 PB 试验设计筛选显著单因素
根据 PB 试验设计，在发酵 96h 后取样测定发酵
液中核酸酶 P1 活力。PB 试验设计见表 2，拟合一阶
模型为:
Y = 1076. 14 + 31. 01X1 + 56. 42X2 + 15. 76X3 +
4. 57X4 + 26. 43X5 + 11. 69X6 － 5. 59X7 － 13. 22X8
对模型进行方差分析(ANOVA 见表 3)。F 值和 P 值
分别为 12. 04 和 0. 033，表明模型具有统计学意义
(96%)。模型的 R2 值(0. 9698)表明变量响应值的
表 2 PB 试验设计及其筛选结果
Table 2 Experimental design by Plackett-Burman and
the derived results
试验
test
变量 variable
酶活性
nuclease
activity
X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 Y
1 1 － 1 1 － 1 － 1 － 1 1 1 991. 3
2 1 1 － 1 1 － 1 － 1 － 1 1 1107. 2
3 － 1 1 1 － 1 1 － 1 － 1 － 1 1125. 5
4 1 － 1 1 1 － 1 1 － 1 － 1 1067. 5
5 1 1 － 1 1 1 － 1 1 － 1 1174. 3
6 1 1 1 － 1 1 1 － 1 1 1226. 1
7 － 1 1 1 1 － 1 1 1 － 1 1122. 4
8 － 1 － 1 1 1 1 － 1 1 1 1018. 7
9 － 1 － 1 － 1 1 1 1 － 1 1 994. 3
10 1 － 1 － 1 － 1 1 1 1 － 1 1076. 7
11 － 1 1 － 1 － 1 － 1 1 1 1 1040. 1
12 － 1 － 1 － 1 － 1 － 1 － 1 － 1 － 1 969. 9
96. 98%都可由此方程来反映(Adj R2 = 0. 8893)。根
据 t 检验表明，葡萄糖、可溶性淀粉和玉米浆干粉具有
显著性影响(P < 0. 005)，其次是豆粉，其它因素则影
响较小。因此选择葡萄糖、可溶性淀粉和玉米浆干粉
作为响应面优化的因子。
表 3 PB 试验设计回归分析结果
Table 3 Regression analysis of the
Plackett-Burman design
符号
symbol
效应
effect
系数
coefficient
标误
SE
t 值
t-value
p 值
P-value
b0 1076. 14 7. 534 142. 84 0. 000
X1 62. 02 31. 01 7. 534 4. 12 0. 026
X2 112. 85 56. 42 7. 534 7. 49 0. 005
X3 31. 52 15. 76 7. 534 2. 09 0. 128
X4 9. 15 4. 57 7. 534 0. 61 0. 587
X5 52. 87 26. 43 7. 534 3. 51 0. 039
X6 23. 38 11. 69 7. 534 1. 55 0. 219
X7 － 11. 18 － 5. 59 7. 534 － 0. 74 0. 512
X8 － 26. 43 － 13. 22 7. 534 － 1. 75 0. 178
2. 2 中心组合试验
根据 PB 试验结果，选择葡萄糖、可溶性淀粉和玉
米浆干粉作为响应面优化的因子，选择中心试验点为
3，星号臂长为 1. 633。各自变量水平见表 4。试验数
据(表 5)采用 Minitab 软件进行二次回归分析，得出以
下回归方程:
Y = 1684. 77 + 9. 24X1 + 17. 94X2 + 11. 96X3 －
51. 86X21 － 73. 65X
2
2 － 40. 18X
2
3
通过方差分析(ANOVA)验证模型及各参数的显
著性见表 6。由方差分析可知，其 F 值为 21. 89，概率
(Pr > F)值为 0. 000，表明模型具有显著性。模型的
R2 值(0. 9517)表明，变量响应值的 95. 17%都可由此
方程来反映(Adj R2 = 0. 9082)，回归方程的拟合程度
良好。
表 4 中心组合实验设计参数水平
Table 4 Levels of the variables tested in CCD
变量 variable
编码水平 level of code
－ 1. 633 － 1 0 1 1. 633
葡萄糖 glucose，X1 13. 67 20 30 40 46. 33
可溶性淀粉 solulbe starcch，X2 17. 34 20 40 60 72. 66
玉米浆干粉 corn steep powder，X3 4. 47 7 11 15 17. 53
响应面三维图示如图 1，图中分别表示了 3 因素
间的相互作用。根据模型的分析结果以及二次回归方
程，对回归方程一阶偏导等于 0 求最大值。得点 X1
(0. 089)、X2(0. 123)、X3(0. 149)，即为曲面最大点，
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表 5 中心组合试验设计及结果
Table 5 Experimental design and results of CCD
试验
test
变量 variable
X1 X2 X3
酶活
nuclease activity
Y (U /ml)
1 － 1 － 1 － 1 1440. 6
2 1 － 1 － 1 1484
3 － 1 1 － 1 1510. 6
4 1 1 － 1 1519
5 － 1 － 1 1 1494. 5
6 1 － 1 1 1505
7 － 1 1 1 1529. 5
8 1 1 1 1547
9 － 1. 633 0 0 1556. 1
10 1. 633 0 0 1582. 7
11 0 － 1. 633 0 1493. 8
12 0 1. 633 0 1528. 8
13 0 0 － 1. 633 1589
14 0 0 1. 633 1612. 1
15 0 0 0 1679. 8
16 0 0 0 1664. 2
17 0 0 0 1672. 3
18 0 0 0 1668. 6
19 0 0 0 1657
20 0 0 0 1681. 4
注:CCD:中心组合试验。
Note:CCD:central composite design.
表 6 中心组合试验设计回归分析
Table 6 Regression analysis of CCD
来源
source
F-值
F value
prob > F
模型 model 21. 8891 < 0. 0001
X1 1. 845872 0. 2041
X2 6. 951405 0. 0249
X3 3. 092833 0. 1091
X1X2 0. 158811 0. 6986
X1X3 0. 114741 0. 7418
X2X3 0. 158811 0. 6986
X1* X1 57. 56648 < 0. 0001
X2* X2 116. 0914 < 0. 0001
X3* X3 34. 55555 0. 0002
剩余失拟纯误差
residual lack of fit pure error
30. 41856 0. 0009
即在葡萄糖浓度为 30. 89g / L，可溶性淀粉浓度
42. 46g / L，玉米浆干粉浓度为 11. 6g / L 时，模型有最
大响应值(Y = 1687. 16)。
2. 3 验证试验
为检验响应面法的可靠性，采用上述最优化培养
基成分，进行相同条件发酵，进行 5 组重复试验，核酸
酶 P1 活力达到 1672. 6U /ml，与预测值相近。说明响
应面优化得到的发酵培养基成分参数准确可靠，具有
实用价值。
图 1 葡萄糖(X1)－可溶性淀粉(X2)－玉米浆干粉(X3)对核酸酶 P1 产率的响应面分析图
Fig. 1 Response surface plots of nuclease P1 yield as a function of glucose (X1)，
soluble starch (X2)and corn steep powder (X3)
3 讨论
在微生物代谢产物的研究中，微生物培养基的优
化起着重要作用，其中碳源和氮源的种类及水平的选
择优化对发酵生产的成败起着至关重要的影响。我们
在以前报道［12］中认为桔青霉的核酸酶 P1 是组成型
酶，与菌种的生长相关联。本试验标明，较高初始浓
度、易利用碳源(葡萄糖和可溶性淀粉)以及氮源(玉
米浆)组合有利于酶的合成，在一定程度上也表征出
组成酶的特性，因此在培养基优化中不需要特别关注
葡萄糖(淀粉)的分解代谢物阻遏作用。本试验还表
明，米粉作为碳源对产酶也有促进作用。对于菌株 F-
5-5，较佳的产酶氮源是玉米浆，其次是豆粕粉;高水解
度的氮源(如豆胨)不利于酶的合成，这与徐正军报
道［14］的蛋白胨作用相类似。因此氮源的代谢物阻遏
作用是否存在还有待进一步深入研究。玉米浆作为一
种工业常用氮源，除含有丰富的蛋白质外，还含有大量
微生物生长所需要的各种生长因子，玉米浆的促进作
用除了玉米浆中含有较多的可以促进 P1 酶发酵的氨
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基酸，如丙氨酸，甘氨酸等［14］原因外，其中各种生长因
子的影响也不应被忽视。
葡萄糖与可溶性淀粉作为混合碳源，有利于菌种
在接种初期的快速生长，另一方面淀粉相对廉价，有利
于降低成本。玉米浆和豆粕粉是发酵工业上最常用的
氮源，单因素试验结果表明，玉米浆对产酶的影响更显
著。由此可见，采用响应面方法优化工业用粗碳源、氮
源，对于核酸酶 P1 的生产具有重要意义。本文仅对培
养基碳氮源进行分析，其他营养成份的优化与筛选还
有待进一步的探讨。
参考文献:
［1 ］ 宋 威，张 芹，李欢庆，李桂玲 . 复合载体固定化细胞发酵生
产核酸 P1 的对比研究［J］. 河南工业大学学报，2008，29(3):
51 － 54
［2 ］ 胡丹东，崔玉娟 . 一株高产核酸酶 P1 菌株的诱变选育［J］. 西北
师范大学学报(自然科学版)，2008，44(6):79 － 81
［3 ］ 李科德，韩木兰 . 5’－ 磷酸二酯酶高产菌株的选育和发酵培养
条件的优化［J］. 微生物学杂志，2001，21(9):28 － 30
［4 ］ Ying Q Q，Shi L E，Zhang X Y，Chen W，Yi Y. Characterization of
Immobilized Nuclease P1［J］. Appl Biochem Biotechn，2007，136
(1):119 － 126
［5 ］ Zhou B，Wang J F，Pu Y W，Zhu M J，Liu S M，Liang S Z.
Optimization of culture medium for yellow pigments production with
Monascus anka mutant using response surface methodology［J］. Eur
Food Res Technol，2009，228(6):895 – 901
［6 ］ Barrington S，Kim J W. Response surface optimization of medium
components for citric acid production by Aspergillus niger NRRL 567
grown in peat moss［J］. Bioresour Technol，2008，99 (2):368 －
377
［7 ］ 呼晓姝，王建中 . 响应面法优化分子蒸馏提纯神经酸工艺的研
究［J］.中国粮油学报，2009，24(6):123 － 128
［8 ］ Deepak V，Kalishwaralal K，Ramkumarpandian S. Optimization of
media composition for Natokinase production by Bacillus subtilis
using response surface methodology［J］. Bioresour Technol，2008，
99 (17):8170 － 8174
［9 ］ Singh G，Ahuja N，Batish M. Bioleaching of wheat straw rich soda
pulp with alkalophilic laccase from gamma proteobacterium JB:
optimization of process parameters using response surface
methodology［J］. Bioresour Technol，2008，99 (16):7472 － 7479
［10］ Wang Z W，Liu X L. Medium optimization for antifungal active
substances production from a newly isolated Paenibacillus sp. using
response surface methodology ［J］. Bioresour Technol，2008，99
(17):8245 － 8251
［11］ 王 普，孙立明，何军邀 . 响应面法优化热带假丝酵母 104 菌株
产羰基还原酶发酵培养基［J］. 生物工程学报 . 2009，25(6):
863 － 868
［12］ 梁新乐，寿 谦，张 虹，陈 敏，刘 璇 . 桔青霉形态分化与核酸酶 P1
产量突变关系研究［J］.核农学报，2009，23(4):606 － 611
［13］ 徐正军，肖林平，吕 浩，谢宁昌，应汉杰 . 实验设计法优化核酸酶
P1 的发酵培养基［J］. 过程工程学报，2003，3(5):433 － 437
(责任编辑 王媛媛
櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀
)
(上接第 56 页)
［12］ Pan J，Wang J，Zhou Z F，et al. IrrE，a global regulator of extreme
radiation resistance in Deinococcus radiodurans， enhances salt
tolerance in Escherichia coli and Brassica napus［J］. PLoS ONE，
2009，4(2):e4422
［13］ Matera A G，Frey M R，Margelot K，Wolin S L. A perinucleolar
compartment contains several RNA polymerase III transcripts as well
as the polypyrimidine tract － binding protein，hnRNP I［J］. J Cell
Biol，1995，129:1181 － 1193
［14 ］ Xingou Chen， Anne Marie Quinn， Sandra L Wolin. Ro
ribonucleoproteins contribute to the resistance of Deinococcus
radiodurans to ultraviolet irradiation［J］. Genes Dev，2000，14:
777 － 782
［15］ Maniatis T， Fritsh E F， Sambrook J. Molecular Cloning. A
Laboratory Manual， Cold Spring Harbor Laboratory Press， Cold
Spring Harbor，NY，1989
［16］ O’Brien C A and Wolin S L. A possible role for the 60 － kD Ro
autoantigen in a discard pathway for defective 5S ribosomal RNA
precursors［J］. Genes，1994，8:2891 – 2903
［17］ Hincha D K，Hagemann M. Stabilization of model membranes during
drying by compatible solutes involved in the stress tolerance of plants
and microorganisms［J］. Biochem J，2004，383:277 － 283
(责任编辑 王媛媛)
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