全 文 ：紫云英根瘤菌培养基的选择与优化
陈海荣，郭照辉，刘前刚，刘清术
（湖南省微生物研究所，湖南 长沙 410009）
摘 要：以中慢生华癸根瘤菌 13004#菌株为供试菌株，进行 YMA、SM、63#、TY和 BSE 5种培养基筛选、碳氮源利用试验和正交设
计试验。结果表明：该根瘤菌株在 YMA中生长良好，最佳碳源为蔗糖，最佳氮源为酵母粉，最佳培养基成分配方为：蔗糖 10 g/L，酵
母粉 3 g/L，K2HPO4 0.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.02 g，NaCl 0.1 g/L，CaSO4 0.2 g/L，Rh微量元素液 4 mL/L，pH 6.8～7.0。
关键词：紫云英根瘤菌；培养基筛选；培养基优化；正交试验；验证
中图分类号：S541 文献标识码：A 文章编号：1006-060X（2011）01-0013-03
Selection and Optimization of Medium for Rhizobium astragali
CHEN Hai-rong, GUO Zhao-hui, LIU Qian-gang, LIU Qing-shu
(Hunan Institute of Microbiology, Changsha 410009, PRC)
Abstract: The middle-low growing strain Mesorhizobium huakuii 13004# was taken as experimental strain to conduct
medium selection with five media (YMA medium, SM medium, 63# medium, TY medium and BSE medium), utilizing
experiments of carbon source and nitrogen source and orthogonal experiment. The results showed that the Mesorhizobium
huakuii 13004# grew greatly in the YMA medium; the optimum carbon source is sucrose; the optimum nitrogen source is
yeast powder; the optimum ingredients of medium is as follows: sucrose 10 g/L, yeast powder 3 g/L, K2HPO4 0.5 g/L,
MgSO4·7H2O 0.02 g/L, NaCl 0.1 g/L, CaSO4 0.2 g/L, microelement liquid of Rh 4 mL/L and pH 6.8～7.0.
Key words: Rhizobium astragali; medium selection; medium optimization; orthogonal experiment; validation
紫云英又名红花草，豆科黄芪属植物，主要分
布在长江中下游和华南地区，在海拔 400～3 000 m
的地带生长良好，是一种重要的绿肥、饲料兼用作
物。人们发现，根瘤菌与豆科植物共生固氮体系是自
然界固氮效率最高、固氮量最大的生物固氮体系[1-2]。
我国陈华癸和徐明光最先获得紫云英根瘤菌有效
菌株[3]。随后，人们对紫云英根瘤菌进行了多方面的
研究，发现采用紫云英根瘤菌剂接种能使作物增产
20%～30%，效果显著。在初次栽种紫云英的土壤中
接种有效根瘤菌是种植成败的重要因素，多年种植
紫云英的地区接种优良菌株也能促进地上部分增
产[4]。因此，开发一类高效的紫云英固氮菌剂对提高
紫云英的产量，增加稻田土壤肥力具有重要意义。
根瘤菌接种效果与根瘤菌株的的固氮能力、竞争结
瘤能力和活菌数有关。笔者以中慢生华癸根瘤菌
13004#菌株为供试菌株，筛选优质高效的培养基，
提高根瘤菌的活菌数，以期为根瘤菌剂的生产提供
科学依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 菌 株 中慢生华癸根瘤菌（Mesorhizobium
huakuii）13004#菌株，为紫云英中慢生根瘤菌，从中
国农科院菌种保藏中心引进。
1.1.2 培养基 YMA培养基：甘露醇 10 g/L，酵母
粉 1 g/L，K2HPO4 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，NaCl
0.1 g/L，CaSO4 0.2g/L，Rh微量元素液 4 mL/L（Rh微
量元素液：H3BO3 5 g/L，Na2MnO4 5 g/L），pH 6.8～7.0。
SM 培养基：甘露醇 10 g/L，K2HPO4 0.5 g/L，
MgSO4·7H2O 0.2 g/L，NaCl 0.1 g/L，CaCl2 0.05 g/L，
KNO3 0.5 g/L，Rh微量元素液 4 mL/L（配方同上），混
合维生素液 1 mL（混合维生素液：硫胺素 10 mg/L，
烟酰胺 10 mg/L，泛酸钙 10 mg/L，生物素 1 mg/L），
pH 6.8～7.0。
63#培养基（中国农科院网站提供）：蔗糖 10
g/L，酵母粉 1 g/L，K2HPO4 0.5 g/L，MgSO4·7H2O
0.2 g/L，NaCl 0.1 g/L，CaSO4 0.2 g/L，1% H3BO3 1
mL/L，1% Na2MnO4 1 mL/L，1%柠檬酸铁 1 mL/L，
1% MnSO4 1 mL/L，pH 6.8～7.0。
TY培养基：胰蛋白胨 5 g/L，酵母粉 3 g/L，CaCl2
1.3 g/L，pH 6.8～7.0。
BSE 培养基：甘露醇 10 g/L，K2HPO4 0.5 g/L，
MgSO4·7H2O 0.2 g/L，NaCl 0.1 g/L，CaCl2 0.05 g/L，Rh
收稿日期：2010-10-13
基金项目：湖南省农业厅资助项目
作者简介：陈海荣（1978-），女，湖南资兴市人，助理研究员，
主要从事微生物农业应用研究。
湖南农业科学 2011，（1）：13~15 Hunan Agricultural Sciences
DOI:10.16498/j.cnki.hnnykx.2011.01.015
微量元素液 4 mL/L（配方同上），豆芽汁 1 000 mL，
pH 6.8～7.0（豆芽汁配方：500 g鲜豆芽加入 1 500
mL水煮沸 30 min后，用纱布过滤即得）。
种子培养基：用 YMA培养基作为种子培养基。
活菌数计数培养基：YMA固体培养基（YMA液体
培养基+2%琼脂粉）。
1.2 试验方法
1.2.1 根瘤菌菌株的分离活化、传代、接种和培养
在 YMA固体培养基平板上分离根瘤菌株，将单菌
落接入斜面传代培养作为菌种。然后将斜面的菌种
接入种子培养基中，30℃，160 r/min培养 18 h。最后
按 2%的接种量将种子培养基中菌液接种到液体培
养基，恒温振荡培养箱内，160 r/min，30℃培养。
1.2.2 根瘤菌在 5 种培养基中生长情况的测定
培养 24 h后开始计数，每 6 h计数一次。计数采用
平板计数法，稀释倍数取 107、108、109 3个梯度，每
个梯度 3个平行，取菌落数在 30～150个的平板读
数，计算 3个平板的平均值。
1.2.3 培养基碳源的筛选 以 5个培养基中活菌
数最高的培养基为母本，进行碳源筛选试验。分别
用等量的蔗糖、葡萄糖、甘露醇、麦芽糖及甘油进行
试验，培养基其他成分不变。按 2%接种量从种子培
养基中接入上述培养基，取 24、36、48 h 3个时间点
进行活菌数测定，选出最佳碳源。
1.2.4 培养基氮源的筛选 确定最佳碳源后，将培
养基中的氮源用等量的酵母粉、蛋白胨、大豆粉、鱼
粉进行试验，培养基其他成分不变。按 2%接种量从
种子培养基中接入上述培养基，取 24、36、48 h 3个
时间点进行活菌数测定，选出最佳氮源。
1.2.5 正交设计优化选定培养基主要成分 对培
养基中的碳源、氮源、磷源及 MgSO4 4种主要成分
进行 L9（34）正交设计试验。培养 48 h后，用分光光
度计测定其 600 nm下的 OD值，分析 4种物质对
根瘤菌的影响度及最佳剂量组合。
1.2.6 验证试验 用 1.2.5中得到的最佳培养基与
试验中的活菌数最高的培养基进行活菌数比较，验
证正交试验结果是否准确。
2 结果与分析
2.1 紫云英根瘤菌在 5种不同培养基中生
长状况比较
根据 13004# 根瘤菌在 YMA、SM、63#、TY 和
BSE培养基中的生长情况所测的的活菌数绘制曲
线，结果如图 1所示。由图 1可知，13004#菌株在 5
种培养基中均能生长，在 YMA、63#和 BSE培养基
中生长速度较快，活菌数较高，但在 SM和 TY培养
基中表现较差。比较 3种表现较好的培养基，BSE
中豆芽受季节条件限制，不利于生产；63#培养基成
本较高，因此，YMA培养基是紫云英根瘤菌 13004#
菌株较为理想的培养基。
2.2 根瘤菌对不同碳源的利用情况
YMA培养基其它成分不变，碳源分别用等质
量的甘露醇、蔗糖、葡萄糖、麦芽糖及甘油做对比试
验，平板计数法测得 24、36和 48 h活菌数，结果如
图 2所示。由图 2可知，13004#根瘤菌在甘露醇和
蔗糖中生长较好，甘露醇略优于蔗糖，在麦芽糖中
次之，在葡萄糖和甘油中成长较差。因甘露醇在生
产成本上要远高于蔗糖，故选定蔗糖为根瘤菌培养
基碳源。
2.3 根瘤菌对不同氮源的利用情况
确定以蔗糖为碳源后，将 YMA中的氮源用等
质量的蛋白胨、酵母粉、大豆粉及鱼粉代替，其它成
分不变，做对比试验。平板计数法测得 24、36和 48
h活菌数，结果如图 3所示。由图 3可知，根瘤菌在
以酵母粉为氮源的培养基中生长效果最好，蛋白胨
次之，大豆粉和鱼粉的利用效果差。
2.4 正交优化结果
在确定蔗糖、酵母粉分别为碳源和氮源后，对培
养基中 4种主要成分：蔗糖、酵母粉、K2HPO3、Mg－
甘露醇
蔗糖
葡萄糖
麦芽糖
甘油
60
50
40
30
20
10
0
活
菌
数
（
10
8
个
/m
L）
24 36 48
图 2 根瘤菌在供试碳源中不同时期的活菌数
培养时间（h）
第 1期湖南农业科学
图 1 不同培养基中根瘤菌活菌数的变化
60
50
40
30
20
10
0
活
菌
数
（
10
8
个
/m
L）
24 30 36 42 48 54 60 66 72
培养时间（h）
YMA
63#
TY
SM BSE
14
表 1 根瘤菌 L9（34）培养基优化正交试验设计及结果
1
2
3
4
5
6
7
8
9
K1
K2
K3
R
最优水平
因素主次顺序
编号
因素（g）
OD值A
（蔗糖）
10
10
10
15
15
15
20
20
20
1.101
0.862
0.732
0.369
A1
B
（酵母粉）
1
3
5
1
3
5
1
3
5
0.864
1.006
0.824
0.182
B2
C
（K2HPO4）
0.5
1.0
1.5
1.0
1.5
0.5
1.5
0.5
1.0
0.966
0.878
0.850
0.116
C1
D
（MgSO4·7H2O）
0.1
0.2
0.3
0.3
0.1
0.2
0.2
0.3
0.1
0.866
0.923
0.905
0.057
D2
1.103
1.213
0.986
0.815
0.889
0.881
0.674
0.915
0.606
A＞B＞C＞D
新培养基
2号培养基
YMA培养基
图 4 三种培养基不同时间活菌数的比较
70
60
50
40
30
20
10
0
活
菌
数
（
10
8
个
/m
L）
培养时间（h）
24 36 48
蛋白胨
酵母粉
大豆粉
鱼粉
图 3 根瘤菌在供试氮源中不同时期的活菌数
60
50
40
30
20
10
0
活
菌
数
（
10
8
个
/m
L）
培养时间（h）
24 36 48
SO4·7H2O做正交设计试验，以确定最佳组合剂量。
正交设计方案及结果如表 1 所示。由表 1 可知，
13004#根瘤菌株在 2号培养基中生长最好，其次为
1号培养基，在 9号培养基中生长最差。经极差分
析，4 种培养基成分对菌株生长结果的影响顺序
为：蔗糖＞酵母粉＞K2HPO4＞MgSO4·7H2O，培养基最
佳剂量组合为 A1B2C1D2，即蔗糖 10 g，酵母粉 3
g，K2HPO4 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.2 g。
2.5 验证试验
以正交设计得到的 A1B2C1D2配方做培养基，
与正交试验中生长最好的 2 号培养基以及原始
YMA培养基做对比试验，培养基其它成分以 YMA
培养基为参考。菌株在培养 24、36、48 h用平板计
数法测定 3种培养基中活菌数，结果如图 4所示。
由图 4可以看出，经过正交试验得到的培养基在
24、36、48 h的活菌数均高于其他两种培养基，可以
初步判断，正交试验结果准确，得到的新培养基比
原始培养基好。
3 总结与讨论
关于根瘤菌培养基的优化问题，不少学者已
作过研究[5-8]，但主要集中在大豆和花生等经济作物
上，对紫云英根瘤菌的研究相对较少。本试验证明
YMA培养基比较适合紫云英根瘤菌 13004#菌株。
碳源和氮源利用试验表明，甘露醇和蔗糖是该
菌株比较理想的碳源，因甘露醇价格相对较高，选择
蔗糖作为碳源，性价比更高；而酵母粉是该菌株优秀
的氮源选择。正交试验及活菌数验证得出培养基最
佳配方如下：蔗糖 10 g，酵母粉 3 g，K2HPO4 0.5 g/L，
MgSO4·7H2O 0.2 g/L，NaCl 0.1 g/L，CaSO4 0.2 g/L，Rh
微量元素液 4 mL/L，pH 6.8～7.0。
选择高活菌数的培养基是生产优质紫云英根
瘤菌肥的第一步，保持菌肥中长期高效的活菌数是
生产根瘤菌肥的关键。在菌肥的剂型上，固态菌肥
保质期长，活菌数较少，易污染程度高；液态菌肥活
菌数高，保质期短，交通运输不便，如何把两者的优
点有机地结合起来还需要进一步的研究。
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（责任编辑：高国赋）
第 1期 陈海荣等：紫云英根瘤菌培养基的选择与优化 15