全 文 ：文章编号 :100028551 (2000) 0320184205
作物转 Bt 抗虫基因育种研究进展
严建民
(江苏省农业科学院　江苏 南京　210014)
摘要 :本文概述了 Bt 抗虫基因的特性及其人工合成和转导技术 ,并根据转 Bt 基因作
物种质的特点和遗传缺陷 ,总结了进行转 Bt 基因作物育种改良的策略 ,介绍了国内
外转 Bt 基因植株鉴定、筛选技术和育出的优良品系及商业化生产状况 ,讨论了 Bt 抗
虫基因在育种应用中存在的问题及其解决途径。
关键词 :Bt 基因 　转基因作物 　育种策略
收稿日期 :1998209220
基金项目 :江苏省自然科学基金资助项目 (B K97231)
作者简介 :严建民 (1963 —) ,男 ,江苏人 ,博士 ,江苏省农业科学院原子能所副所长 ,从事同位素示踪技术在农作物育种
中的应用研究。
常规的作物杂交育种 ,其遗传资源的重组只限于物种内部 ,或者至多扩展到远缘关系较近
的种属。但随着生物分子技术的发展 ,用基因工程改良品种 ,其基因资源几乎可以不受这种限
制。作物转 Bt 抗虫基因育种就是将细菌中的一种毒性蛋白基因转入作物 ,使作物产生抗虫特
性 ,达到作物高产、优质的目的。
植物 Bt 抗虫基因来源于苏云金芽孢杆菌 ,苏云金芽孢杆菌属于革兰氏阳性土壤杆菌。在
芽孢形成过程中 ,苏云金杆菌可产生大量的伴胞晶体 ,伴胞晶体由具有高度特异杀虫活性的结
晶蛋白组成 ,这种毒性蛋白进入昆虫的消化道后 ,释放出分子量为 27～140kDa 的 ICP 原毒
素 ,在蛋白酶的水解作用下 ,原毒素转型为毒性多肽分子 ,其与昆虫中肠道上皮纹缘细胞表面
的特异受体相互作用 ,诱导细胞膜产生一些孔道 ,扰乱细胞的渗透平衡 ,并引起细胞肿胀甚至
裂解而导致昆虫死亡。
自 1901 年发现苏云金芽孢杆菌以来 ,现已分离到上万个 Bt 菌种 ,已报道了 34 个血清型 ,
50 多个亚种 ,分离测定了 45 个杀虫晶体蛋白基因序列。根据杀虫谱不同 ,可将 Bt 杀虫基因
分为 4 大类。类型 Ⅰ(Cry Ⅰ)基因型编码对鳞翅目昆虫有特异毒杀作用的 130～140kDa 的蛋
白 ;类型 Ⅱ(Cry Ⅱ)编码约 65kDa 晶体蛋白 ,对鳞翅目和双翅目昆虫有毒杀作用 ;类型 Ⅲ(Cry
Ⅲ)编码的晶体蛋白约为 72kDa ,对鞘翅目昆虫有特异毒杀作用 ;类型 Ⅳ(Cry Ⅳ) 编码对双翅目
昆虫有毒杀作用的晶体蛋白。由于现在菌系已有了增加 ,所以把 Bt 毒素划分成了更多的类 (7
大类 ,或 29 个亚类) ,现已查明有些新菌系对线虫、螨类或其它昆虫也有抗生。
自 1987 年比利时植物遗传系统公司将 Cry ⅠA 基因导入烟草以及 1989 年中国农科院谢
道昕等转育 Bt 毒性蛋白基因获得成功以后 ,国内外利用日趋成熟的生物工程技术 ,对 Bt 基因
进行改造和克隆 ,并导入水稻、棉花、玉米、油菜、烟草等多种植物中 ,进行转 Bt 抗虫基因的作
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物育种工作 ,取得了显著的成效。
1 　作物 Bt 抗虫基因的人工合成及其转导技术
由于野生 Bt 基因和大多数植物基因常用的优化密码子的序列有所不同 ,直接影响野生
Bt 杀虫基因在植物细胞中的 mRNA 的运转速率、翻译速率以及 mRNA 的稳定性和它的二级
结构 ,因此必须对野生 Bt 基因序列进行改造 ,才能供植物利用。1991 年 ,美国 Perlak 等人在
不改变野生 Bt 杀虫晶体蛋白氨基酸序列的情况下 ,采用 2 种途径按照植物基因组常用的优化
密码子进行的 Bt 基因的人工改造和合成。一是部分改造基因的方法 ,即更换野生 Bt 基因中
不稳定核苷酸引物片段 ,经定点诱变使原来野生型的 Cry ⅠA (b)基因序列中的 315 %的核苷
酸改变 ,降低了富含联串的 (A + T)保守序列 ,使植物偏爱的 G + C 密码子含量由 32 %提高到
4115 % ,大大提高了 Bt 基因在转基因植株中的表达量 ,由原来的 1ng/ 50μg 植物可溶性总蛋白
提高到 10ng/ 50μg。二是人工全合成基因的方法 ,即更换野生 Bt 基因中所有不稳定的成分 ,
同时尽可能的将野生 Bt 基因中的优化密码子更换成植物基因组中的优化密码子 ,使 G + C 含
量由 37 %提高到 49 % ,合成的 Bt 基因比原野生 Bt 基因在植体内的表达量提高了 30～100
倍。1992 年美国 Monsanto 公司将人工合成的 FMCry ⅠA (b)基因导入玉米 ,使抗玉米螟能力
达到 100 % ,该公司 Fishhof 等人用 FMCry ⅠA (b)基因转化棉花 ,使杀虫晶体蛋白在棉花中的
表达量由原来的 01001 %提高到 0105 %～011 %。1993 年 , Perlak 等人将人工合成的 FMCry
ⅣA 基因导入马铃薯植株 ,杀虫晶体蛋白的表达量由原来的 01001 %提高到 0105 %～013 % ,
抗虫能力达到 90 %以上。
1991 年 ,国内在 863 高新技术计划的资助下 ,也开始了 Bt 杀虫基因 Cry ⅠA 的人工合成。
1992 年底 ,中国农业科学院生物技术研究中心郭三堆等领导的研究组 ,在国内首先合成了 Cry
ⅠA 杀虫晶体蛋白结构基因。中国科学院微生物研究所田颖川、中国科学院上海植物生理所
白永延等也先后合成和部分改造了 Cry ⅠA 杀虫晶体蛋白结构基因 ,并导入烟草、甘兰 ,获得
抗虫基因植株。
将 Bt 外源基因导入受体细胞并获得转基因植株是作物转 Bt 基因育种的关键步骤之一 ,
目前正在研究和使用的转导方法主要有以下几种 : (1)载体法 :以土壤农杆菌 Ti 质粒 (或病毒)
为载体 ,运用重组 DNA 技术 ,把 Ti 质粒上的转移 DNA 序列 ( T2DNA) 与 Bt 目标基因、标记基
因和启动子等组合 ,再感染植物组织、细胞或原生质体 ,从而使 Bt 目标基因借助 T2DNA 整合
到植物的染色体上。山西农科院利用该方法成功地将 Bt 基因导入到晋棉 7 号中去。这是目
前最常用的方法。
(2)直接导入法 :借助于显微操作仪 ,用微针将 Bt 基因直接注入植物细胞、原生质体或愈
伤组织中 ;或用基因枪轰击受体细胞 ,将外源基因直接导入植物获得转基因植株。1990 年 ,俄
亥俄州立大学 Finer 等用显微注射法将外源基因直接注射到陆地棉悬浮培养细胞中 ,并通过
胚状体发生途径得到了转基因植株。
(3)花粉管通道法 :中国科学院上海生物化学所、江苏农业科学院经济作物所、中国农业科
学院等单位 ,以棉花种胚细胞为受体 ,将 Bt 抗虫基因经胚珠珠心的花粉管通道导入胚囊 ,转化
受精前后的卵细胞 ,将该抗虫基因转入泗棉 3 号、中棉 12 号等棉花品种中 ,获得多个转 Bt 基
因棉花株系。
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(4)原生质体法 :用 PEG或脂质体介导 ,或采用电击穿孔等手段使原生质体直接摄取或融
合外源 DNA 分子。
(5)其它方法 :如碳化硅纤维介导法、激光微束转化技术、超声波方法等 ,也在 Bt 基因的转
导过程中得以试用。
2 　作物 Bt 抗虫基因植株的鉴定及其表现特性
目前 ,鉴定作物转 Bt 基因植株常用的方法有 3 种 : (1) 标记基因法 :1994 年 ,中国科学院
上海生物化学所和江苏农业科学院经作所等单位 ,用3 H 标记的外源 DNA 导入棉花来验证外
源 DNA 在棉花中的整合。1992 年 ,美国 Praher 等用报告基因 GFP (荧光蛋白基因) 来鉴定外
源基因在植株上的转化。在棉花转 Bt 基因植株鉴定上通常采用的标记基因是 Gus 基因 ,在紫
外灯下 ,这种基因能表达出肉眼能识别的转化细胞。其它的标记基因还有卡那霉素、新霉素、
潮霉素、氯霉素、抗除草剂基因等 ,将这些标记基因添加到 Bt 结构基因中 ,用来鉴定 Bt 基因的
表达。
(2)分子杂交和免疫学法 :中国农业科学院生物技术中心利用 DNA 的双链的解离和恢
复 ,通过 PCR (DNA 扩增)的手段 ,以 Bt 基因引物来钓出转化植株中的 Bt 基因。美国 Ragbur
和 Gill 等人采用传统的原位分子杂交法 ,用放射性标记或荧光素标记的 DNA 或 RNA 探针 ,
与植物体内 Bt 目标基因的 DNA 进行杂交 ,来对 Bt 基因植株进行检测。
免疫学方法则是以 Bt 基因在植株体内表达的产物作抗原 ,以该基因产物 (蛋白质) 的免疫
血清作抗体 ,通过专一性强、灵敏度高的抗原抗体反应来检测植株体内的 Bt 基因。
(3)生物学鉴定法 :在转 Bt 基因作物育种实践中 ,由于中、低世代材料多、群体大 ,国内诸
多单位 ,如中国农业科学院棉花所、植保所、山西农业科学院、江苏农业科学院、南京农业大学
等皆通过饲喂昆虫来进行转基因植株的生物抗性鉴定。与其它方法相比较 ,这种方法大大节
省投资和工作量 ,其准确率也可达到 70 %以上。
国内外转化结果表明 ,抗虫棉属显性单基因控制 ,抗性遗传基础狭窄 ,同时转 Bt 基因抗虫
棉的抗虫性苗期强 ,后期弱 (南京农业大学 ,1996) ,抗性基因的表达也因棉株的不同组织或部
位而有差异 (江苏农业科学院 ,1995) 。
不同的作物或同一作物不同的品种 ,对 Bt 基因转化的难易程度不一。美国 Monsanto 公
司的研究结果认为 ,棉花品种 Cocker312 容易转化 ,但其它大多数品种的转化是极其困难的。
并且初育成的转 Bt 基因抗虫棉种质种子瘦小 ,子指 7g 左右 ,苗小而弱 ,蕾少、铃小 ,后期吐絮
不畅、烂铃多 (郭香墨 ,中国农业科学院棉花研究所 ,1997) ,难以直接利用。因此应采取一定的
育种策略 ,才能使转 Bt 基因品种有使用价值。
3 　转 Bt 抗虫基因作物品种的育种策略及其商品化生产
转 Bt 抗虫基因作物育种应是生物技术和育种技术等研究的有机结合 ,转基因植物的获得
不是育种最终目的。只有通过一定的育种方法 ,将转基因植物进行商品化生产 ,才能实现其经
济价值。
美国 Monsanto 公司用 Cry ⅠA (c)基因转化了 Cocker312 品种 ,随后又将它与现代品种杂
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交并进行了几次回交 ,将 Bt 抗虫基因导入正在生产上应用的岱字棉系统中 ,在生产中得到推
广。
中国农业科学院棉花研究所通过选择综合性状优良的常规棉新品系与转 Bt 基因种质进
行杂交、回交和复合杂交 ,后代处理采用系谱法、混合选择法和混合系谱法等手段 ,在保持 Bt
基因表达强度的基础上 ,进一步提高综合农艺性状 ,提高了抗虫棉育种水平和效率。其中
R9323、R9326、114、KC22 等优良品系在全国抗虫棉生产试验中表现突出 ,即将投入大面积生
产。
表 1 　国外 Bt 转基因作物的商品化情况
国家 作物 公司 (允许出售年份) 基因
美国 玉米 Ciba (1995) Cry ⅠA(b)
玉米 Northrup King(1996) Cry ⅠA(c)
玉米 Monsanto (1996) Cry ⅠA(b)
棉花 Monsanto (1996) Cry ⅠA(c)
马铃薯 Monsanto (1996) Cry ⅢA(a)
澳大利亚 棉花 Monsanto Cry ⅠA(c)
加拿大 玉米 Mycogen (1996) Cry ⅠA(b)
马铃薯 Monsanto (1996) Cry ⅢA(a)
阿根廷 玉米 Ciba Cry ⅠA(b)
玉米 Monsanto Cry ⅠA(b)
玉米 Northrup King Cry ⅠA(b)
日本 玉米 Ciba ,Northrup King Cry ⅠA(b)
马铃薯 Monsanto Cry ⅢA(a)
江苏农业科学院和中国农业科学院生
物技术中心 ,通过转 Bt 基因的抗虫棉泗棉
3 号与其它的棉花品种配制杂交种 ,选育
出高产、优质、抗虫的杂交棉组合 ,在生产
上得到推广。
目前 ,国内外主要通过 ①选择高产、优
质、抗病的推广品种或即将推广的作物品
系作为 Bt 基因转导的受体 ; ②采用杂交、
回交和配制杂交组合等育种技术 ,培育转
Bt 基因作物品种。近 10 年来已有 70 多
个作物种得到了遗传改良 ,有 56 个不同作
物在田间进行了试验。首先实现商品化的
转基因作物是烟草 ,它是 1990 年在我国培
育成功的。至今 ,已有玉米、油菜、棉花、马铃薯、番茄、甜瓜、南瓜和烟草等 8 种作物实现了商
品化生产 (表 1) 。
4 　转 Bt 抗虫基因作物育种的风险与对策
Bt 毒蛋白基因是目前应用最广、最有潜力的一个抗虫基因 ,目前已分离得到的众多的 Bt
基因 ,其抗虫谱几乎覆盖了所有鳞翅目害虫 ,但具体到每一种 Bt 基因而言 ,其抗虫谱则较为狭
窄 ,而且昆虫易对其产生耐受性。
1988 年 ,Mc Gauhey 报道了印度谷螟在 Bt 选择压力下 ,繁殖 15 代后 ,对 Bt 杀虫剂的抗性
增加 90～100 倍。烟草夜蛾对转 Bt 杀虫基因的假单胞杆菌产生了 20 倍抗性。同时转基因作
物高抗株系的子代有抗虫性分离和不稳定的现象出现 (丰嵘 1996 ,王武刚 1997) 。因此 ,欲使
作物转 Bt 基因育种顺利进行 ,必须着力解决昆虫对其产生的耐受性问题。
目前 ,转基因育种工作者已设计几种对策 ,来解决 Bt 基因抗性丧失的问题 : (1) Bt 复合基
因的利用 :同时使用两个以上的 Cry Bt 抗虫基因来转化作物。昆虫对两种基因同时产生抗性
的可能性较小 ,可防止或缓解昆虫对 Bt 抗虫转基因植株产生抗性 (郭三堆 ,1995) 。
(2)多种抗虫基因的联合作用 :中国农业科学院范云六、中国科学院上海生物化学所龚蓁
蓁 ,江苏农业科学院黄骏麒等将 Bt 杀虫蛋白基因和豇豆胰蛋白酶抑制剂基因 (CPTI) 、慈菇蛋
白酶抑制剂基因 (APT)同时导入作物品种中 ,并成功地获得了多种基因导入的抗虫棉品系。
(3)种植一定的供昆虫繁殖的保护区 :播种一定面积 (5 %左右) 非转 Bt 基因作物区 ,不采
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用昆虫的防治措施 ,确保大量敏感性昆虫总是与附近的一些抗性昆虫交配 ,达到防止抗性群体
产生的目的。或采用控制 Bt 基因表达的时间或部位的方法 :让 Bt 基因只在植株易受伤的部
位 (如玉米螟的危害场所茎杆部位)或植株发育的关键时期 (如结果期) 得到表达 ,其目的是降
低昆虫暴露于毒素的时间 ,允许大量敏感性昆虫正常繁殖。
(4)提高转 Bt 基因抗虫棉的水平抗性 :中国农业科学院棉花研究所郭香墨 (1997) 提出 ,利
用 Bt 基因的抗虫性应与其它的形态、生化抗性方法相结合 ,减少昆虫对 Bt 基因产生抗性的几
率 ,使抗虫棉长期、高效地应用于生产。
近年来 ,作物转 Bt 基因抗虫育种已取得了可喜的成果 ,育出了一批抗虫性好 ,丰产、优质
的转基因抗虫作物。随着植物分子育种学的深入发展和多种学科工作者的联合攻关 ,我们相
信 ,作物转 Bt 基因抗虫育种必将在生产上产生巨大的经济和社会效益。
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