全 文 ：文章编号 :100028551 (2008) 062907204
调制叶绿素荧光动力学参数及其计量
关系的意义和公理化讨论
张阿宏　齐孟文　张晔晖
(中国农业大学信息与电气工程学院 , 北京　100193)
摘 　要 :叶绿素荧光动力学在农业科学中广泛应用 ,其动力学参量及其应用计量关系的公理化研究在方
法学上尤为重要 ,然而国内这方面的研究工作相对滞后。为此 ,本文尝试从其本质、意义及其正确的使
用条件等方面对调制叶绿素荧光仪的测量参量进行阐述 ,并对应用中的相关计量公式从公理化的角度
进行了演释推导。
关键词 :调制叶绿素荧光仪 ;动力学参数 ;计量公式
A DISCUSSION ON CHLOROPHYLL FLUORESCENCE INDUCTION PARAMETERS AND THEIR MEASUREMENT
ZHANG A2hong 　QI Meng2wen 　ZHANG Ye2hui
( College of Information and Electrical Engineering China Agricultural University , Beijing 　100193)
Abstract :Because of the extensive application of chlorophyll fluorescence kinetics in agricultural sciences , it is particularly
important to study on the axiomatization of it’s kinetic parameters and metrical relationship in methodology. However , the
corresponding research work is relatively backward in China. Therefore , an attempt was made to describe the essence ,
signification and the correct application conditions of measurement parameters of PAM chlorophyll fluoremeter in this paper , as
well as the derivation of relative measurement formula from perspective of axiomatization.
Key words :PAM chlorophyll fluorometer ; kinetics parameters ; measurement formula
收稿日期 :2008205211 　接受日期 :2008206203
作者简介 :张阿宏 (19852) ,男 ,安徽当涂县人 ,硕士 ,专业方向为生物物理。E2mail :cieehertz @yahoo. cn
通讯作者 :齐孟文 (19562) ,男 ,陕西洋县人 ,硕士生导师 ,长期从事核农学教学与科研工作。E2mail :qqmmwv6 @1261com　　绿色植物的叶绿素荧光动力学时变信号是与光合作用系统中光合反应进程密切偶联的荧光现象 ,因此包含详尽的光合作用过程的信息 ,被称为光合作用生理及其过程的有效探针 ,现已被广泛应用于光合作用机理、植物抗逆性光生理和作物产量预测等领域的研究。调制叶绿素荧光仪 ( 脉冲2振幅2调制 Pulse2Amplitude2Modulation ,PAM) 是在野外条件下实现叶绿素荧光谱 (包括快速相及慢速相)动力学参数测定的基本仪器。1983 年 ,WALZ公司首席科学家、德国乌兹堡大学教授 Ulrich Schreiber 博士利用调制和饱和脉冲技术 ,设计制造了全世界第一台调制荧光仪。PAM 采用了调制技术 ,测量不受外界强光背景的干扰 ,同时具有测量快速、操作方便且对胁迫响应灵敏等特点 ,因此成为光合作用研究的一类重要仪器手段。 为了在实际应用中正确使用和操作仪器 ,合理分析和解释相关观测数据 ,本文对叶绿素荧光动力学参量的意义、相关计量公式的公理化条件以及调制叶绿素荧光仪的工作原理和操作过程规范进行了综述。1 　调制荧光仪的结构与工作原理调制叶绿素荧光测定技术 ,就是利用具有一定的调制频率和强度的光源诱导 ,通过饱和脉冲分析方法 ,使叶绿素荧光发射快速处于某些特定状态 ,以进行相应荧光检测记录的技术。与连续激发荧光测定技术相比 ,因其最大限度减小了环境背景光对测量的影响 ,特别适合在野外环境下工作。调制荧光仪主要由光源、光导纤维、样品室、光电信号转换检测及放大与记录等
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系统组成 ,其结构示意见图 1 :
调制荧光仪的光源由测量光、光化光、饱和光和远
红光组成。其中调制测量光是由发光二极管产生的微
弱红光 ,用于诱导荧光发生 ,控制在弱光下以便只激发
色素的本底荧光而不引起任何的光合作用 ,以真实地
记录初始荧光 F0 ,其 PFD (photon flux density ,光量子通
量密度) < 012μmol·m - 2·s - 1 ,波长 650nm ,调制频率可
变 ,如在低频 (600Hz)和高频 (20kHz) 间自动切换 ;光化
光 (光合生物实际可吸收利用进行光合作用的可见
光) ,是光合作用系统在光适应条件下处于激励状态的
光源 ,由卤素灯 (白光) 或一系列可产生多种光 (红色 ,
蓝色 ,白色) 的发光二极管提供 ,其 PFD 一般为几百
μmol·m - 2·s - 1 ,采用对一定波长具有高度选择性的放
大系统可以避免非荧光信号的干扰 ;饱和光由卤钨灯
发出 ,其 PFD 可以达到 10000μmol·m - 2·s - 1 ,能够将原
初 PS Ⅱ电子受体侧的 QA 快速地由非光化学猝灭的氧
化 QA 还原为光化学猝灭的还原态 Q - 1A ,使反应中心暂
时完全关闭 ;远红光 ,735nm ,用来激发 PSI ,通过两个
光学系统 PS I和 PSII间的线性传递 ,迅速消耗掉在 PQ
(photochemical quenching)累积的电子 ,以促使 QA 快速
还原 ,使 PSII反应中心在光适应条件下完全关闭。荧
光信号经光电传感探头 (如数码 CCD)检测并由后面的
电子学系统记录与处理。
图 1 　调制荧光仪结构原理图
Fig. 1 　Block diagram of PAM
调制荧光仪通过利用以上 4 种不同波长范围 ,不
同脉冲强度 ,在不同时相内发生作用的辅助光 ,即调制
光的作用 ,使叶绿素光合作用系统处于相应的光化学
反应及电子传递链状态 ,进而测定特定态荧光产量 ,以
实现对叶绿素荧光动力学参数的测量与分析。
2 　测定参量和计量关系量及其意义
叶绿素荧光过程因与光合作用系统的光合作用过
程偶联 ,因此荧光强度表现为具有明显特征的时相变
动的动力学特点。整个诱导荧光在对数时间尺度上的
变化曲线 ,根据国际统一命名划分为以下几个相
(phase) :O(原点) →I(偏转) →D (小坑) 或 PL (台阶) →
P(最高峰) →S(半稳态) →M(次峰) →T(终点) ,有时在
O 和 I 之间还可辨认出一个被称为 J 相的拐点。荧光
动力学响应可分为快慢两个时相 ,曲线上升部分 O2P
相应光合作用系统的光反应阶段为快相 ,持续数百毫
秒 ;曲线的下降部分 P2T相应的暗反应阶段为慢相 ,一
般持续数秒。用调制荧光仪调制诱导的叶绿素荧光状
态及发射谱示意如图 2 所示 ,其相应诱导曲线位相点
的 5 种发光状态由荧光产量符号表征 (如 F0 和 Fm ) ,
ML 为调制弱测量光 (约 6 º ·mol·m - 2·s - 1 ,660nm) ;SP
为饱和光脉冲 (约 10000 º ·mol·m - 2 ·s - 1 ,400nm < l >
700nm ,012～2s) ;AL 为连续光化光 ; FR 为远红外光
(约 6 º ·mol·m - 2·s - 1 , l > 700nm) 。
为正确理解调制荧光仪的直接测量物理量及其计
量关系的物理量本质及意义 ,规范学术名词 ,为相关公
式的公理化创造条件 ,以减小使用中可能的意义混淆 ,
调制叶绿素荧光仪的直接测量物理量和相关计量关系
公式简述和演释如下 :
211 　直接测量物理量
F0 :固定荧光 ,或初始荧光 (minimal fluorescence) ,
在暗适应后 PS 反应中心完全打开时 ,于测量光 (弱光)
下测定的荧光产量 ,此时 PS Ⅱ天线色素捕获的光尚未
传到其反应中心 P680 ,因此主要反映了激发能在捕获
色素间传递的平衡过程[6 ] ,在一定测量光强下 ,主要与
叶绿素浓度有关 ; F′0 表示光适应下的最小荧光。
Fp : P 位相点 (峰值) 荧光。暗适应后于饱和光激
发诱导使 PS 反应中心完全关闭时的荧光产量 ,表示为
FM ;光适应条件下于饱和光激发诱导的荧光产量 ,表
示为 FM′。
FT :稳态荧光 ,以 O2I2D2P2T表象的荧光动力学曲
线值 T点荧光强度趋于稳态的产量 ,响应光合作用在
光反应与暗反应达到平衡时的荧光产量。
212 　计量关系物理量
根据以上直接测量物理量 ,可进一步计算如下计
量关系物理量。
FvΠFm = ( Fm - F0 )ΠFm (1)
　　式 ( 1 ) 表示 PS 的最大量 子 产 额 ( maximal
photochemical efficiency of PS in the dark) , 可用于表征
PS反应中心内光能的转换效率。该物理量的意义可
以进行如下演释 :
019 核　农　学　报 22 卷
图 2 　荧光产量随时间变化曲线图
Fig. 2 　diagram of fluorescence yield changing with time
　　光合作用吸收的能量共有三种去向 ,分别为光化
学猝灭 ( P) 、非光化学猝灭 ( D ,即热耗散) 和荧光发射
( F) ,根据能量守恒定律有 : P + D + F = 1。用短饱和
光脉冲光使 PS 反应中心完全关闭时 ,有 P = 0 , F =
Fm , D = Dm , Dm = 1 - Fm 。假设对于上升的可变荧光
有 DΠF = DmΠFm 关系成立 ,则 D = F·DmΠFm ,进而 PS
的量子产量 : P = 1 - F - D = ( Fm - F)ΠFm ,因此 FvΠ
Fm 实际表示光合作用系统的潜在最大量子产率。
F′vΠF′m = ( F′m - F′0 )ΠF′m (2)
　　式 (2) 表示光适应下的最大光化学量子产率
(photochemical efficiency of PS in the light) ,表征在实际
光适应条件下 PS反应中心原初光能捕获效率。
qP = ( F′m - FT)Π( F′m - F′0 ) (3)
　　式 ( 3 ) 表示光适应下的光化学猝灭系数
(photochemical quenching in the light , qP) ,要保持一定
的化学猝灭 ,就必须要使 PSII 反应中心处于开放状
态 ,因此 ,qP 与 PS 反应中心的相对开放程度成正比。
qN = 1 - ( F′m - F′0 )Π( Fm - F0 ) (4)
式 ( 4 ) 表示光适应下的非光学猝灭系数 ( non2
photochemical quenching , qN) 。非光学猝灭示数表示
PSII 吸收的光能中以热能形式耗散的比率。
Yield = ( F′m - Ft )ΠF′m (5)
　　式 (6)表示 PS Ⅱ光合作用系统实际光合量子产量
(actual photochemical efficiency of PS Ⅱin the light) ,表征
在光适应条件下 PS Ⅱ的原初光能捕获效率。
ETR = Yield ×0184 ×015 ×PAR (6)
　　式 (7) 表示表观光合电子传递速率 (photosynthetic
electron transport rate) ,其中系数 0184 为叶片对光的吸
收比率 ;015 是因为光合作用系统包括两个中心 ,1 个
电子的传递需要吸收 2 个光子 ; PAR 则为光合有效辐
射。
3 　调制荧光仪的操作过程与应用简介
调制荧光仪的种类丰富 ,其中 PAM2000 系列调制
叶绿素荧光仪使用广泛 ,其测量常用两种可任选的程
序 ,一般操作过程如下 :1) 叶片经暗适应 (30min) 后 ,用
测量光测定初始荧光 F0 ,随后用饱和脉冲 (6000 º ·mol
·m - 2·s - 1 ,017s)闪照后测暗适应下的最大荧光 Fm ,接
着在自然光下适应一定时间 (20min) ,待荧光稳定后测
定光适应下的稳态荧光 FT ,接着将叶片短暂遮光 (3s)
并打开远红外光 (5s) 后 ,测定光适应下的最小荧光
F′0 ;2)测定 F0 和 Fm 后 ,在自然光或光化光下序列饱和
脉冲光 (6000 º ·mol·m - 2·s - 1 ,2s) ,记录每次测得的 FT
和 Fm ,直至序列终止 ,对最后 6 次的结果取平均作为
测量值 (10 次脉冲后就基本达到了稳态) 。随后关闭
光化光 ,将叶片遮光 (3s) 并打开远红外光 (5s) ,测定光
适应下的最小荧光 F′0 。
调制荧光仪的问世使叶绿素荧光分析技术能够走
向野外 ,扩展了其应用范围。目前 ,国内调制荧光仪的
应用发表文献最多的领域之一是植物抗逆性研究[8 ] 。
研究表明 ,在一定的胁迫环境下 ,FvΠFm 呈现出显著的
下降 ,叶绿素荧光参数可作为植物抗逆反应的指标之
一[9 ] 。
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