全 文 ：　文章编号 :100028551 (2001) 0620336205
胡萝卜悬浮细胞原生质体的培养研究
邵俊明
(中国农业科学院原子能利用研究所 ,北京　100094)
摘要 :继代培养 4～5d 后的胡萝卜悬浮细胞 ,经酶解获得大量原生质体 ,并在不同的
培养基上培养 ,探讨了影响原生质体培养的多种因素。实验表明 : ①原生质体的培养
密度在 5 ×104ΠmL～5 ×105ΠmL 范围内均可 ,以 215 ×105ΠmL 为佳 ; ②对于细胞的分
裂、细胞团的生长 ,以改良的 B5 培养最好 ,N6 培养其次 ,MS 较差 ; ③适当降低原生质
体培养基中的甘露醇浓度 ,有利于细胞的分裂和生长 ; ④在本实验所涉及的培养方法
之中 ,以液体浅层培养为优。
关键词 :胡萝卜 ;原生质体
收稿日期 :2001201220
作者简介 :邵俊明 (1964～) ,男 ,湖北仙桃人 ,中国农业科学院原子能利用研究所助研 ,从事科技扶贪和科技开发工作
胡萝卜是植物组织培养中经典实验材料之一 ,也是近年来进行遗传操作的主要材料。有
关胡萝卜原生质体培养国内外均有不少报道[1 ,3～6 ,8 ] 。以胡萝卜原生质体为受体 ,进行外源基
因导入的研究 ,首先要建立一套稳定、高效的原生质培养系统。由于我们采用的胡萝卜悬浮细
胞系连续继代达 6 年之久 ,源于这种细胞系的原生质体 ,用原有的培养系统已较难于培养 ,并
且分化能力降低。本实验探讨了影响原生质体培养的多种因素。
1 　材料和方法
111 　胡萝卜悬浮细胞继代培养
胡萝卜悬浮细胞系北京农业大学生物学院提供 ,在 28 ℃培养室于 120rΠmin 的摇床上悬浮
培养。培养基是 B5 + 015mgΠL 2 ,4 - D + 015mgΠL 6 - BA + 5mgΠL IAA + 2 %蔗糖 + 012 %水解酪
蛋白 ,每日光照 16h ,每 7d 继代 1 次。
112 　原生质体的分离与纯化
取继代 4～5d 的悬浮物与等体积的酶液 (1 %的纤维素酶 R10、015 %崩溃酶、1 %果胶酶、
015 %半纤维素酶、3mM MES、0135M 甘露醇、5mM CaCl2 、017mM NaH2 PO4 ,pH516) 混合 ,在 28 ℃
培养室 30rΠmin 的摇床上黑暗下振荡酶解 515h ,然后通过 80μm 孔径的尼龙网过滤 ,滤液经
800rΠmin 离心 ,收集沉淀并将之悬浮在 015M 蔗糖溶液中。在蔗糖液上缓慢地加入适量的
015M甘露醇溶液 ,1000rΠmin 离心 ,在蔗糖甘露醇界面收集原生质体。原生质体用培养液离心
洗涤 2 次。
633 　核 农 学 报　2001 ,15 (6) :336～340Acta Agriculturae Nucleatae Sinica
113 　原生质体的培养
净纯化的原生质体分别悬浮于各种原生质体培养基上黑暗培养 ,温度 28 ℃,培养 4d 后按
1∶1 比例加入同种培养基进行稀释 ,待形成细胞团。
2 　结果与讨论
211 　原生质体培养
21111 　原生质体的密度对细胞分裂频率的影响 　将培养 4～5d 的悬浮细胞原生质体置于改
良的 B5 培养基中 (表 1) ,配制成不同的密度 ,于 28 ℃黑暗培养 ,6d 后统计第 1 次和第 2 次分裂
频率 ,发现胡萝卜悬浮细胞原生质体的培养密度范围较宽 ,5 ×104ΠmL～5 ×105ΠmL 均可 ,以 215
×105ΠmL 为最佳。当密度小于 104ΠmL 或大于 1 ×106ΠmL 时 ,再生细胞分裂频率明显下降。
表 1 　实验用原生质体培养基
Table 1 　Some protoplast culture medium used
基本培养基
basic culture medium
激素
hormone
糖
glucose
pH
B5
2 ,42D ,015mgΠL
62BA ,015mgΠL
IAA ,5mgΠL 蔗糖sucrose (2 %)水解酪蛋白
hydrous diary protein (012 %) 515
N6
2 ,42D ,1mgΠL
62BA ,015mgΠL 蔗糖sucrose (2 %) 518
MS 2 ,42D ,1mgΠL 蔗糖
sucrose (3 %)
518
21112 　原生质体在不同培养基上生长的差异 　将原生质体分别悬浮于改良的 B5 、N6 、MS 液体
培养基中 (表 1) ,配制成密度为 4 ×105ΠmL 的悬浮液 ,接种到培养皿中进行浅层培养 ,对其生长
过程进行观察 ,结果 (表 2)表明 ,胡萝卜悬浮细胞原生质体在改良的 B5 培养基上生长较好 ,其
次是 N6 培养基 ,MS 培养基较差。原生质体在不同培养基上生长的差异 ,显然是与各种培养基
的成分密切相关。就 MS 培养基而言 ,较高浓度的氨态氮和蔗糖可能是导致胡萝卜原生质体
分裂、生长不良的关键因素。在 MS 培养基中生长的原生质体 2d 后有出芽现象 ,4d 后有些呈
现不健康的棕褐色 ,而且在以后的培养中不分裂 ,继而死亡。
21113 　原生质体对不同渗透压的反应 　将原生质体配制成密度为 4 ×105ΠmL 悬浮液 ,分别培
养于 B5 a、B5 b、B5 c、B5 d、B5 e 液体培养基中 (表 3) 。培养 2d 后观察变形细胞 ,即椭圆形、棒形细
胞的百分率。4d 后统计细胞的分裂频率。
从表 3 可看出 ,在不同渗透压的 B5 培养基中 ,原生质体表现不同。在 B5 a 和 B5 b 中 ,2d 后
细胞呈椭圆形、棒形 (表明已有细胞壁产生)的百分率最低 ,同时细胞体积也较其他培养基中的
细胞小 ,这是由于高渗透压引起细胞失水的缘故。在 B5 e 中 ,2d 后有些原生质体发生了破裂。
而在B5 c 和B5 d 中 ,未见这种现象 ,4d 后细胞分裂频率也最高。这表明培养基中的渗透压对原
733　6 期 胡萝卜悬浮细胞原生质体的培养研究
生质体培养的成功有一定关系。以往原生质体培养的报道中 ,最低的甘露醇浓度为 014M ,最
高则达 018M。本实验采用 013M 的甘露醇 ,对胡萝卜悬浮细胞原生质体的培养产生良好效果。
此外还发现在 013M 甘露醇为渗透压的 B5 培养基中 ,即使不补充新鲜培养基和调整渗透压浓
度 ,胡萝卜原生质体也能分裂、形成少量细胞团 ,甚至形成肉眼可见的愈伤组织。这说明 ,适时
补充新鲜培养基 ,适当降低渗透压 ,能加速细胞生长。
表 2 　不同培养基对原生质体生长的影响
Table 2 　Effect of different culture medium on protoplast growth
培养基
culture medium
4d 后的分裂频率
percent of division after 4 days( %)
7d 后形成细胞团的百分率
percent of cell cluster after 7 days( %)
B5 39. 2 5. 9
N6 33. 6 5. 1
MS 28. 7 4. 5
表 3 　原生质体对不同渗透压的反应
Table 3 　Reaction of protoplast to different osmotic pressure
B5 培养基
B5 culture medium
B5a B5b B5c B5d B5e
甘露醇浓度
mannitol concentration
016M 015M 014M 013M 012M
2d 后原生质体
protoplast after 2days
1415 1813 8614 9112 2114
变形细胞的百分率
modified cell percent ( %)
细胞较小
small cell
细胞较小
small cell
有破裂
broken
4d 后分裂频率
division percent after 4 days( %) 119 213 311 315 016
在胡萝卜原生质体培养中 ,不宜过早地降低渗透压以防细胞破裂。
21114 　不同培养方式对原生质体培养的影响 　分别采用 (1)浅层液体培养 ; (2) 固液结合的双
层培养法 ; (3)小岛式的固液结合法 ; (4)铁丝网支持的小岛法 ; (5)平板法。将原生质体培养在
改良的 B5 培养基中 ,密度为 3 ×105ΠmL。其中 (1) 、(3) 、(4) 法在培养 6、12d 后分别用新鲜培养
基稀释 ; (2)法培养 6、12d 后用移贴法转移到新鲜固体培养基上 ;所谓小岛式的固液结合法就
是将原生质体与融化的固体培养基 (用低溶点琼脂糖固化) 混合后分 3 处滴于培养皿中 ,形成
以固体为小岛、周围加液体培养基的培养体系 ;铁丝网支持的小岛法就是将固体培养基融化后
和原生质体混合滴在铁丝网上 ;其他方法同 (3) 。采用的液体、固体培养基均为薄层 ,以利于显
微镜观察。
由表 4 可见 ,胡萝卜原生质体采用 (1)法培养最为合适 ,其他几种培养方法差别不很大 ,其
中 (2)法稍好 , (3)法与 (4)法无明显差异 , (5) 法略差。这可能是在胡萝卜原生质体培养中 ,气
体交换和群体效应很重要。液体培养时原生质体能充分交换营养物质 ,通气性好。固体培养
基中原生质体物质的交换不如液体培养基 ,且通气性差。另外用固体法时 ,原生质体液体与固
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体培养基应均匀混合以减少原生质体集聚。
表 4 　几种培养方法对原生质体培养的影响
Table 4 　Effect of some culture method on protoplast culture
培养方法
culture method
浅层液体培养 (1)
thin layer
liquid culture
固液结合的
双层法 (2)
double layer
solid2liquid 小岛式的固液结合法 (3)little islandlikesolid2liquid 铁丝网支持的小岛法 (4)little island supportedby iron net 平板法 (5)plate
1d 后形成细胞壁百分率
cell wall formation percent
after 1 day( %)
90. 4 85. 1 74. 3 77. 1 70. 2
4d 后第 1 次分裂
the first divistion percent
after 4 days( %)
38. 6 29. 5 27. 9 28. 5 27. 3
7d 后第 2 次分裂
the second division percent
after 7 days( %)
31. 2 19. 4 16. 3 18. 8 15. 5
13d 后细胞团形成
cell cluster formation percent
after 13 days( %)
28. 3 21. 1 19. 8 20. 5 19. 2
图版 Ⅰ　胡萝卜悬浮细胞原生质体培养
Plate 1 　The culture of protoplasts from carrot suspension
11 分离的原生质体 ( ×750) ;21 第 1 次分裂 ( ×750) ;31 经 2 次分裂 ( ×750) ;419d 后的细胞团 ( ×750)
11isolated protoplasts( ×750) ;21the first division ( ×750) ;31the second division( ×750) ;41cell cluster after 9 days( ×750)
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STUDY ON THE CULTURE OF PROTOPLASTS FROM CARROT SUSPENSION CELL
SHAO Jun2ming
( Institute of Atomic Energy Application , Chinese Academy of Agricultural Sciences , Beijing 　100094)
ABSTRACT :Large number of protoplasts were isolated enzymatically from 4 to 5 days old carrot
suspension cells and cultured in different media . Cultured protoplasts could divide. Various factors
affecting the protoplast culture were disocussed. The results showed : ①culture densities ranging
from 5 ×104ΠmL to 5 ×105ΠmL were suitable for carrot protoplasts , with 215 ×105 mL being the
best ; ②for carrot protoplast division and cell cluster growth , modified B5 medium was the best ,
followed by N6 medium , MS medium was not suitable ; ③properly lowering the concentration of
mannitol in the protoplast culture medium was beneficial to the division and growth of cells; ④
among the culture methods involved in the experiment ,thin2layer liquid culture was the most suit2
able one.
Key words :carrot ; protoplasts
043 Acta Agriculturae Nucleatae Sinica
2001 ,15 (6) :336～340