全 文 ：文章编号 :100028551 (2007) 022132204
根瘤菌 RAPD 引物筛选及条件优化
何庆元1 ,2 　玉永雄2 　王松华1 　柯亚珍1 　张晓红1
(11 安徽科技学院生命科学学院 , 安徽 凤阳　233100 ; 21 西南农业大学牧草与草食家畜重点实验室 , 重庆　400716)
摘 　要 :用改良的 SDS2CTAB 酶裂解法提取了根瘤菌基因组 DNA 的模板 ,从 100 个 10bp 的随机引物中筛
选出了 16 条在 20 个菌株上均能扩增出清晰的片段。应用 L16 (45 ) 正交表研究了 DNA 模板、Mg2 + 、Taq
酶、dNTPs 和引物浓度对扩增迁移率重现性的影响 ,用这种方法建立的根瘤菌 RAPD2PCR 优化反应体系
为 :20μl 体系中含 215mgΠL 的 DNA 模板、2100mmolΠL 的 Mg2 + 、1100U 的 Taq 酶、0105mmolΠL dNTPs、
0135μmolΠL 随机引物。
关键词 :根瘤菌 ;RAPD ;正交设计 ;条件优化
OPTIMIZATION AND PRIMERS SCREENING OF RAPD REACTION SYSTEM FOR Rhizobia
HE Qing2yuan1 ,2 　YU Yong2xiong2 　WANG Song2hua1 　KE Ya2zhen1 　ZHANG Xiao2hong1
(11 Life Science College of Anhui Science and Technology University , Fengyang , Anhui 　233100 ;
21 Key Laboratory of Forage and Herbivore , Southwest Agricultural University , Chongqing 　400716)
Abstract :The genomic DNA was extracted and purified by advanced SDS2CTAB enzyme cracking method from rhizobia. The
L16 (45 ) orthogonal diagram was applied to study the effects of different concentrations of DNA , Mg2 + , Taq polymerase , dNTPs
and primer on rhizobium . A suitable RAPD reaction system for rhizobium including 215mgΠL genomic DNA templates ,
2100mmolΠL Mg2 + , 1100U Taq polymerase , 0105mmolΠL dNTPs and 0135μmolΠL primer with 20μl reaction solution was
developed.
Key words :rhizobia ; RAPD ; orthogonal design ; condition optimization
收稿日期 :2006206209
基金项目 :国家“973”计划资助项目 (2001CB108905) ;安徽省教育厅资助项目 (2006KJ205B) ;安徽科技学院院项目 (2RC200440)
作者简介 :何庆元 (19782) ,男 ,安徽宿松人 ,讲师 ,硕士 ,主要从事固氮和植物生物技术研究 ,E2mail : heqingyuan1 @1631com　 　随 机 引 物 DNA 多 态 性 ( random amplifiedpolymorphic DNA , RAPD) 技术是用 10 个碱基的多个随机引物对基因组进行随机扩增 ,通过对 PCR 产物的计算机辅助分析来反映基因组 DNA 的多态性[1 ] ,该技术具有简便、快捷和灵敏度高等优点 ,在遗传多样性和系统发育研究中被广泛采用[2 ] 。但该技术对反应条件要求严格 ,不同材料需要的引物不同 ,反应条件也需各自优化 ,才能提高重现性和稳定性[3 ,4 ] 。在反应体系中哪个因素影响了 RAPD 的先定性和重现性还停留在主观判断上 ,如何减少筛选过程的工作量 ,使 RAPD 得到更广泛的应用值得进一步研究。RAPD 在根瘤菌中的研究已见报道[5 ,6 ] ,但怎样筛选出最佳的反应体系尚未见 报道。本研究以 20 株不同根瘤菌为材料 ,从 100 个引物中筛选出了适合所有根瘤菌扩增的引物 16 个 ,利用正交设计探讨了模板 DNA、Mg2 + 、dNTPs、引物、Taq 聚合酶对扩增结果的影响 ,筛选出最佳的扩增体系 ,以期为进一步研究根瘤菌 RAPD 奠定基础。1 　材料与方法111 　材料11111 　供试菌株 　从安徽和山东不同地区分离花生根瘤菌 10 个 ,中国农业大学陈文新院士和西南农业大学玉永雄教授馈赠参比标准菌株 10 个。具体见表 1。
231　 核 农 学 报　2007 ,21 (2) :132～135Journal of Nuclear Agricultural Sciences
1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
表 1 　供试花生根瘤菌和参比菌株
Table 1 　Peanut rhizobia and referenence strains tested
编号
No.
菌株
strains
宿主
host
分离地和来源
region or source
1 CH Arachis hypogaca Hanshan , Chaohu
2 HB Arachis hypogaca Duji , Huaibei
3 GC Arachis hypogac Dongzhi , Guichi
4 FY1 Arachis hypogac Xiaoxihe , Fengyan
5 WH Arachis hypogac Wuhu , Wuhu
6 SZ Arachis hypogac Lingbi ,Suzhou
7 CZ Arachis hypogac Dingyuan , Chuzhou
8 HF Arachis hypogac Feixi , Hefei
9 QD Arachis hypogac Jimei , Qingdao , Shandong
10 HA Medicago falcata Fengyan , Chuzhou
11 CQ Medicago sativas Beibei , Chongqing
12 XJ Medicago sativas Shihezi , Xinjiang
13 05289 Arachis hypogac Chen Wenxin
14 05272 Arachis hypogac Chen Wenxin
15 USDA1002 Medicago sativas Chen Wenxin
16 S . meliloti102 F28 Medicago sativas Chen Wenxin
17 S . xinjiangensisCCBAU110 Glycine max Chen Wenxin
18 UBAU105 Glycine max Chen Wenxin
19 B15 Glycine max Chen Wenxin
20 USDA6 + Glycine max Chen Wenxin
11112 　试剂及仪器 　10bp 的随机引物 100 条、Taq 酶、
dNTPs 购自华美生物工程公司 ,用 Eppendorf AG22331
型 PCR 进行扩增 ,用 AlphalmagerTM 502643 型凝胶成像
系统拍照分析。
112 　方法
11211 　根瘤菌的捕获、分离和纯化 　在不同地区收集
的土样上种植经表面灭菌的花生种子 ,用无菌水浇灌。
从花生根上摘下一个粉红色根瘤 ,表面灭菌后捣碎 ,在
CR YMA 培养基[7 ]上划线分离 ,待菌落长丰后 ,选取单
菌落再划线分离 ,得到纯菌株。
11212 　总DNA 的提取及测定 　将菌株在 YMB 液体培
养基中培养至对数生长期 ,连续两次离心收集菌体并
溶解于 TE缓冲液 550μl ,用蛋白酶 K和溶菌酶破碎蛋
白和裂解细胞壁 ,用 SDS2CTAB (十六烷基三甲基溴化
铵)沉淀细胞碎片和多糖 ,氯仿Π异戊醇和氯仿Π苯酚Π异
戊醇抽提蛋白 ,用异丙醇沉淀总 DNA[8 ] ,DNA 沉淀溶
于缓冲液 (100μl ×TE) ,电泳检测后 - 20 ℃保存备用。
将 DNA 稀释 150 倍后 ,在 756 型分光光度计测定 260
和 280nm 的吸收值 ,计算其浓度和纯度。
11213 　PCR 扩增和凝胶成像 　20μl 的反应体系中添
加 25mgΠml 的牛血清白蛋白 1μl ,对 5 因素 (模板 DNA、
Mg2 + 离子浓度、Taq 酶浓度、dNTPs 浓度、引物浓度) ,设
4 水平进行正交试验 (见表 2)每处理重复 3 次。
表 2 　RAPD 反应体系的正交设计表
Table 2 　Orthogonal design for RAPD2PCR system
处理号
No. of
treatment
模板 DNA
tempLate
DNA(mgΠL) Mg2 + 浓度Mg2 +concentration(mmolΠL) Taq 酶Taqpolymerase(U) dNTPs(mmolΠL) 引物primer(μmolΠL)
1 110 1150 0150 0105 0120
2 110 2100 0175 0110 0125
3 110 2150 1100 0115 0130
4 110 3100 1125 0120 0135
5 115 1150 0175 0115 0135
6 115 2100 0150 0120 0130
7 115 2150 1125 0105 0125
8 115 3100 1100 0110 0120
9 210 1150 1100 0120 0125
10 210 2100 1125 0115 0120
11 210 2150 0150 0110 0135
12 210 3100 0175 0105 0130
13 215 1150 1125 0110 0130
14 215 2100 1100 0105 0135
15 215 2150 0175 0120 0120
16 215 3100 0150 0115 0125
　　PCR 反应程序包括 94 ℃预变性 2min ,进入第 1 个
循环 ,95 ℃变性 1min ,37 ℃退火 1min , 72 ℃延伸 2min ;
然后进行 40 个循环 ,每个循环 94 ℃变性 1min ,37 ℃退
火 1min ,72 ℃延伸 1min ;最后 94 ℃变性 1min ,37 ℃退火
1min ,72 ℃延伸 5min ;获得的 PCR 产物于 4 ℃下保存。
扩增产物在含 015μgΠml 溴化乙锭的 113 %琼脂糖凝胶
中电泳 ,点样 16μl (含 1μl 点样缓冲液) 。以 EcoRI +
Hind Ⅲ双酶切λDNA 作 Marker (华美生物工程公司 ,
014μgΠμl) ,每孔点样 5μl。稳压 5VΠcm ,当点样缓冲液
的溴酚兰电泳至凝胶尾端约 1cm 时停止电泳 ,约需
3h。电泳完毕观察、照相 ,用随机配送软件对图像进行
分析。
11214 　数据获取与分析 　用凝胶成像系统随机软件
统计每个处理扩增得到的 DNA 片段数 ,片段亮度 ,片
段面积 ,相对迁移率 ;对片段重现性分析 ,用 SPSS 进行
方差分析。
重现率 ( %) = (三重复中迁移率一致的片段数Π总
扩增出的片段数) ×100 %
2 　结果与分析
211 　根瘤菌基因组 DNA 的质量
经电泳检测 ,提取的 DNA 只有 1 条带 ,说明其具
有良好的完整性 ,经紫外分光光度计检测 ,其 OD260Π
OD280 的值在 116 左右 ,可用作 RAPD 的模板。
212 　引物的筛选
331　2 期 根瘤菌 RAPD 引物筛选及条件优化
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在 20μl 的反应体系中分别加 40ng 模板 DNA、Taq
酶 1U、使 Mg2 + 浓度达到 310mmolΠL、dNTPs 达到
0115mmolΠL、引物达到 0130μmolΠL ,最后加入 1μl 25mgΠ
ml 的 BSA。在 PCR 中按以上程序扩增后 ,电泳检测结
果。共有 40 条引物能扩增出片段。对 40 条引物进一
步检测表明 , 有 29 条能在所以的 22 个菌株中扩增出
片段 ,其中有 16 条引物扩增片段多 ,亮度大 ,可用于分
子标记和遗传分析 (见表 3 和图 1) 。
213 　正交设计各处理扩增结果的分析
21311 　最佳体系的选择 　用凝胶成像随机软件分析 ,
第 14 处理迁移率重现率达到 100 % , 1 和 7 处理为
75 % ,2 为 60 % ,13 处理为 50 % ,4 和 11 处理为 33 % ,8
处理为 30 % ,5 处理为 2713 % ,3、7、9、10、12、15 和 16
处理重现性都为 0 % ,迁移率差异明显 ,因此认为 14
处理是最佳体系 ,可以作为 RAPD 的扩增体系。各处
理结果见图 2 ,其 PCR 反应体系中各组分的量见表 2。
表 3 　引物筛选的结果
Table 3 　The results of primer screening
序号
serial No.
引物
primer
序列
sequence
序号
serial No.
引物
primer
序列
sequence
1 S1501 CTACGGCTTC 16 S201 GGGCCACTCA
2 S1461 TGAGGGCCGT3 17 S2021 ACACTGGCTG
3 S1322 GGGAGGCAAA 3 18 S2143 GGAGCAGCAA 3
4 S262 ACCCCGCCAA 3 19 S301 CTGGGCACGA 3
5 S1042 TCGCACAGTC 20 S282 CATCGCCGCA 3
6 S1021 GGCATCGGCT3 21 S1081 TGTGACGAGG
7 S241 ACGGACGTCA 3 22 S1480 TTGACCCCAG
8 S501 TGCGGGTCCT 23 S302 TTCCGCCACC
9 S1102 ACTTGACGGG3 24 S2043 GGCTTGACCT
10 S162 GGAGGAGAGG 25 S181 CTACTGCGCT3
11 S1062 CCATCGGAGG3 26 S1203 GTGAGGCGCA 3
12 S101 GGTCGGAGAA 3 27 S482 TCTGTCGGTC
13 S2155 GAGAACGCTG3 28 S2002 TGCTCGGCTC
14 S1022 AGCCGTTCAG3 29 S2148 ACGGAGGCAG
15 S1441 CAAGGGGCGG3
注 : 3 表示扩增效果好的引物序列
Note : 3 indicates the primer sequence having good amplification result
图 1 　29 条引物在 HB 菌株上扩增的效果
Fig. 1 　The amplification result of 29 primers in HB strain
泳道编号与表 3 引物序号一致
Numbers of lines are same as the No. of primer in Table 3
图 2 　正交设计扩增的结果
Fig. 2 　The amplification result of orthogonal design
泳道编号与表 2 的处理编号一致
Numbers of lanes are same as the No. of primen in Table 2
21312 　PCR 各组分浓度对迁移率重现性的影响 　经
方差分析表明 DNA、Mg2 + 、Taq 酶、dNTPs 和引物的浓
度都能够显著影响迁移率的重现性。从表 4 可以看
出 ,在不同 DNA 浓度下 ,其迁移率的重现率都有显著
性差异 ,其中 110mgΠL 的 DNA 浓度下重现率最高 ,
215mgΠL 下的重现率也较高 ,在 210mgΠL 时的重现率最
低 ;不同 Mg2 + 浓度下迁移率相互间都存在显著性差
异 ,其中 210mmolΠL 时重现率最高 , 依次是 115 和
310mmolΠL ,而 215mmolΠL 时最低 ;Taq 酶用量下迁移率是
015U重现率最高 ,显著高于其他水平下迁移率的重现
率 ,而 0175 和 1125U 时没有显著差异 ; 在 0105 和
0110mmolΠL 的 dNTPs 浓度下 ,迁移率的重现率显著高于
其他两个浓度 ;而不同浓度的引物间都存在显著差异 ,
并且当引物的浓度达到 0135μmolΠL 时重现率最高。
431 核　农　学　报 21 卷
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表 4 　PCR 反应体系各组分浓度下的迁移率重新平均值
Table 4 　Rf reappearance rate at different concentrations of
ingredient of PCR system
PCR 反应体系各组分及浓度
constituents of PCR system
and concentration
迁移率重现平均值
average value Rf
reappearance rate ( %)
DNA 浓度
DNA concentration
(mgΠL)
Mg2 + 浓度
Mg2 + concentration
(mmolΠL)
Taq 酶用量
quantity of Taq
polymerase (U)
dNTPs 浓度
dNTPs concentration
(mmolΠL)
引物浓度
primer concentration
(μmolΠL) 110 4216a115 3316c210 815d215 3717b115 3817b210 5819a215 815d310 1613c0150 4613a0175 2211c1100 3218b1125 2112c0105 4410a0110 4410a0115 710c0120 2714b0120 2617c0125 1511d0130 3115b
0135 4910a
注 : 不同字母间表示 0105 水平差异显著
Note : The different letters indicate significance at 0105 level
21313 　最佳体系的选择和验证 　应用上述最佳反应
体系 ,用引物 S241 对 20 种根瘤菌菌株 DNA 进行了
RAPD 扩增 ,结果如图 3 ,每份 DNA 样品均能扩增出丰
富、清晰可辨的 DNA 片段 ,说明该反应体系稳定。适
用于根瘤菌进行 RAPD 扩增反应。
图 3 　用最佳反应体系扩增 20 个根瘤菌菌株的结果
Fig. 3 　The amplification result of 20 strains
with the best reaction system
1～20 泳道依次为 :Lanes of 1～20 are in proper order :B15 , CH ,
USDA1002 , HB , XJ , FY, HF ,USDA6 + ,WH ,QD ,05289 ,HA ,GC ,CQ ,
S ,xinjiangensisCCBAU10 ,S. meliloti102F28 ,CZ ,05272 ,UBAU105 ,SZ
3 　讨论与结论
311 　RAPD 扩增引物筛选
RAPD 分析具有简便、灵敏度高、不需要 DNA 的序
列材料等优点 ,但不同的材料适合的引物不一样 ,因此
在 RAPD 多态性分析前需要筛选引物 ,本研究筛选出
了 16 条在 20 个根瘤菌菌株上均能扩增出清晰条带的
引物 ,为以后的试验打下了坚实的基础。
312 　正交设计用于 RAPD 反应体系的效率
本研究采用了 L16 (45 ) 来研究 PCR 扩增的反应结
果 ,得到了一个最佳反应体系 ,其 DNA 模板的浓度是
215mgΠL ,Mg2 + 浓度是 2100mmolΠL , Taq 酶在 20μl 的体
系中是 1100U ,dNTPs 浓度是 0105mmolΠL ,引物浓度是
0135μmolΠL。本研究对各影响 RAPD 反应重现性的因
素进行了量化分析 ,在剔除其它因素的影响时的最佳
浓度 ,结果表明模板 DNA、Taq 酶的浓度和最佳反应体
系的浓度并不一致 ,其它 3 个因素和最佳体系是一致
的 ,这说明反应体系中模板 DNA 和 Taq 酶的用量受其
它因素影响较大 ,反应体系中各浓度受到其它因素的
制约。已有的研究表明 Mg2 + 浓度能够影响 Taq 的活
性 ,并且 dNTPs 可以与 Mg2 + 结合而影响反应体系中
Mg2 + 的浓度[4 ,9 ] 。本研究采用的正交表没有对各因素
的交互作用进行研究 ,因此得出的结果具有一定的局
限性。这一局限性可通过增加试验因素 ,增加试验处
理来解决。
根瘤菌的 RAPD 已有部分报道 ,并将应用于实际
科研和生产之中 ,本研究筛选出的体系已经被利用研
究了安徽部分花生根瘤菌种质资源的遗传多样性 ,并
获得了较好的实验结果。
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