全 文 ：文章编号 :100028551 (2005) 022099204
用 RAPD 分析辣椒细胞质雄性不育基因
王得元1 　王　鸣2 　郑学勤3
(11 广东省农业科学院蔬菜研究所Π广东省果蔬新技术研究重点实验室 ,广东 广州　510640 ;
21 西北农林科技大学园艺学院 ,陕西 杨凌　712100 ;31 热带作物生物技术国家重点实验室 ,海南 海口　571101)
摘 　要 :根据近等基因系分析原理 ,以辣椒细胞质雄性不育系 932A 及其保持系 932B 为材料 ,对
辣椒细胞质雄性不育基因及其保持基因开展了 RAPD 标记研究 ,结果表明 :OPK217550 、OPK2
171500标记可能与细胞质雄性不育基因相连锁 ,OPH2112000标记可能与保持系中的保持基因相连
锁。对侯选标记 OPK217550进行了克隆和部分序列分析 ,为利用混合群体分离法 (BSA) 对分离
群体中的不同单株进行 SCAR 分析的标记验证工作奠定了基础。
关键词 :辣椒 ;细胞质雄性不育基因 ;保持基因 ;侯选 RAPD 标记
RAPD ANALYSIS ASSOCIATED WITH CYTOPLASM MALE STERILITY
IN HOT PEPPER( Capsicum annuum L. )
WANG De2yuan1 　WANG Ming2 　ZHENG Xue2qin3
(11Vegetable Institute , Guangdong Academy of Agricultural Sciences , Guangdong Key Biotech Lab for Fruits and
Vegetables , Guangzhou , Guangdong , 510640 ;
21 College of Horticulture , Northwest Agri2forest Sci2Tech University , Yangling , Shaanxi ,712100 ;
31National Key Biotechnology Laboratory for Tropical Crops , Haikou , Hainan ,571000)
Abstract :According to the isogenic line analysis theory , RAPD analysis was undertaken in the cytoplasm male
sterile (CMS) line 932A and its maintainer line 932B in hot pepper ( Capsicum annuum L. ) . The results showed
that the candidate marker OPK217550 and OPK2171500 were possibly correlated with the CMS gene in the line 932A ,
and the candidate marker OPH2112000 was possibly associated with the maintainer gene in the line 932B. The marker
OPH217550 was cloned and partially sequenced , which provided a basis of further marker verification by SCAR
marker and bulked segregation analysis.
Key words : Capsicum annuum L ; cytoplasm male sterile gene ; maintainer gene ; candidate RAPD markers
收稿日期 :2004204216
基金项目 :广东省重点科技攻关项目 (A20202、2002A2070201) ;广东省自然科学基金 (000162) ;广州市重点科技攻关项目 (2002Z22
E0192) ;广东省农业科学院院长基金项目 (04 - 基金 - 03B)
作者简介 :王得元 (1968 - ) ,男 ,河南孟州人 ,博士 ,副研究员 ,主要从事蔬菜育种与生物技术研究。电话 :020 38469605 ; Email : wdy168
@tom. com
杂种优势利用是目前辣椒育种的重要方法之一。选育、利用细胞质雄性不育系可解决杂交制种的
人工去雄不彻底的问题 ,确保种子纯度 ,并可使制种成本降低 ,利于优良品种的推广利用 ,因而细胞质雄
性不育系在辣椒杂种优势利用方面具有极其重要的意义。目前 ,国内外已选育出一些稳定的辣椒细胞
质雄性不育系[1 ] ,并成功地应用于新品种的选育。
找到并分离出细胞质雄性不育基因是目前科学家们正在探索的课题。与细胞质雄性不育基因连锁
的 DNA 标记为细胞质雄性不育基因的定位与克隆提供了极其有用的工具。辣椒细胞质雄性不育系与
99　核 农 学 报　2005 ,19 (2) :99～102Acta Agriculturae Nucleatae Sinica
保持系为近等基因系。本研究根据近等基因系分析[2 ]原理 ,应用 RAPD 技术[3 ] ,鉴定了与辣椒细胞质雄
性不育基因相连锁的 RAPD 标记以及与保持系中保持基因相连锁的 RAPD 标记 ,并对与辣椒细胞质雄
性不育基因相连锁的 RAPD 标记进行了克隆与序列分析。
1 　材料与方法
111 　材料
辣椒细胞质雄性不育系 932A 及其保持系 932B 由西北农林科技大学园艺学院王鸣教授提供。
112 　方法
11211 　辣椒总 DNA 提取
种子经常规消毒后播种。研究取幼苗的幼嫩真叶 ,总 DNA 的提取采用作者改进了的 N22SDS 提取
方法[4 ]进行。
11212 　RAPD 分析
RAPD 反应在 PE DNA Thermal Cycler 480 上 ,按作者建立的辣椒 RAPD 体系[5 ]进行 ,扩增反应的总体
积为 25μl ,其中包括 10 mmolΠL Tris2HCl (pH 813) ,50 mmolΠL KCl ,115 mmolΠL MgCl2 ,01001 %明胶 ,4 种脱
氧核苷酸各为 012 mmolΠL ,012μmolΠL 的随机引物 (10 个碱基 ,Operon Technologies 公司) ,20 ng 基因组总
DNA ,115 U Taq DNA 聚合酶 (华美生物工程公司产品) 。反应程序为 :94 ℃预变性 1 min ,加入 Taq DNA 聚
合酶 ;进行 45 个反应循环 ,每个循环条件为 94 ℃变性 1 min ,36 ℃复性 1 min ,72 ℃延伸 2 min ;最后一个循
环延伸时间增加 10 min。取 8μl 扩增产物用于 114 % 琼脂糖凝胶电泳分析 ,观察、摄像。研究中所用的
部分引物序列为 :OPK217 :5′CCCAGCTGTG3′;OPH211 :5′CTTCCGCAGT3′。
图 1 　辣椒细胞质雄性不育基因的 RAPD 分析
Fig. 1 　RAPD analysis of CMS gene
in CMS line 932A
M1 :λDNAΠHind Ⅲ标记 ;M2 :p GEM 标记 ;1、2 分别为 CMS
DNA、保持系 DNA 采用引物 OPK217 的扩增结果。箭头
所指为侯选标记。
M1 :λDNAΠHind Ⅲmarker ; M2 : p GEM marker ; Lane 1 , 2 :
RAPD amplification of DNA from CMS line and maintainer line
using primer OPK217 , respectively. The arrow indicates the
candidate marker.
11213 　扩增产物的克隆与DNA 序列测定
采用低熔点琼脂糖法回收 RAPD 扩增产物中的特异片段。回收产物在 Mg2 + 和 dNTPs 存在下 ,经 T4
DNA 聚合酶在 37 ℃处理 30 min ,68 ℃灭活 10 min 后 ,与用 EcoR V 切开的 pBluescript ⅡSK( + ) 质粒连
接 ,转化 E. coli DH5α菌 ,用 X2gal 和 IPTG筛选重组子 ,并进行酶切鉴定。
序列测定在热带作物生物技术国家重点实验室的 ABI PRISM 370 DNA 测序仪上进行。参照碱裂解
法大量制备重组质粒 DNA ,利用聚乙二醇纯化 ,采用双
脱氧终止法进行测序。
2 　结果与分析
211 　辣椒细胞质雄性不育基因及其保持基因的 RAPD
分析
以作者所建立的适于辣椒 RAPD 分析的体系为基
础 ,采用 34 个随机引物对辣椒细胞质雄性不育基因以
及保持系中的保持基因开展了 RAPD 标记研究。结果
表明 ,应用引物 OPK217 开展的 RAPD 扩增中 ,发现不育
系比保持系多了两个条带 ,大小分别约为 1500 bp、550
bp (图 1) ,揭示出这两个 DNA 扩增谱带可能与不育系中
的细胞质雄性不育基因有关 ;利用引物 OPH211 进行的
多次 RAPD 扩增中 ,均发现保持系比不育系多了一条
DNA 谱带 (图 2) ,其大小约为 2000 bp ,这反映出这条扩
增产物可能与保持系中的保持基因有关。在此将这三
个侯选标记分别命名为 OPK2171500 、OPK217550 、OPH2
112000 。
001 核　农　学　报 19 卷
212 　OPK217550标记的克隆
从低熔点琼脂糖凝胶中回收的 RAPD 特异扩增产物在 Mg2 + 和 dNTPs 存在下 ,经 T4 DNA 聚合酶作
用后 ,与用 EcoR V 切开的 pBluescript ⅡSK( + )质粒连接 ,转化 E. coli DH5α菌 ,在含 X2gal 和 IPTG的选
择性培养基上获得了一些白色菌落。挑取白色菌落 ,提取质粒 DNA ,进行酶切鉴定。Xho Ⅰ和 Xba Ⅰ的
酶切产物的电泳分析中含有 550 bp 的外源片段 ,将其命名为 pMS1、pMS2、pMS6 ;有一个质粒含有 1500 bp
的外源片段 ,将其命名为 pMB。
213 　OPK217550标记的序列分析
图 2 　辣椒保持系中保持基因的 RAPD 分析
Fig. 2 　RAPD analysis of maintainer
gene in maintainer line 932B
引物 :OPH211。1、2 分别为 CMS DNA 初次和 1 周后的扩增结果 ;
3、4 分别为保持系 DNA 初次和 1 周后的扩增结果。箭头所指为
侯选标记。
Primer : OPH211 ; Lane 1、2 : RAPD amplification , of DNA from CMS
line at the first time and one week later , respectively ; Lane 3、4 : RAPD
amplification , of DNA from maintainer line at the first time and one
week later ,respectively. The arrow indicates the candidate marker.
图 3 　含 OPK217550标记的重组子用 Xho Ⅰ
和 Xba Ⅰ的酶切分析
Fig. 3 　Enzyme2digestion analysis of the plasmids
containing OPK217550
M: p GEM 标记 ; 1、2、3、4、5、6 : 重组质粒 pMS1、pMS2、pMS6、质粒
pBS、质粒 pBS 、重组质粒 pMB
用 Xho Ⅰ和 Xba Ⅰ的酶切结果.
M: p GEM marker ; Lane 1、2、3、4、5、6 : the recombinant plasmid
pMS1 , pMS2 and pMS6 , the plasmid pBS , the plasmid pBS , the
recombinant plasmid pMB digested with Xho Ⅰ and Xba Ⅰ,
respectively.
OPK217550标记的部分序列分析 (图 4) 说明 ,它含有 ATG起始密码子 ,5′端有一个保守的 TATAAT
Pribnow 框 ,有一个较为保守的 TTGAAT或 TTGAAA 序列 (Sextama 框) 。OPK217550标记的部分序列如下 :
3 　讨论
根据近等基因系分析方法 ,本研究获得了与辣椒细胞质雄性不育基因相连锁的侯选 RAPD 标记以
及与保持系中保持基因相连锁的侯选 RAPD 标记。从辣椒细胞质雄性不育基因相连锁的侯选 RAPD 标
记 OPK217550的部分序列分析中 ,发现 OPK217550似具有原核生物的启动子结构特点。
(下转第 87 页)
101Acta Agriculturae Nucleatae Sinica
2005 ,19 (2) :99～101
3 　新品系德豆 99 - 16 综合评价
种植试验表明德豆 99 - 16 具有如下特征 :适宜的生长期、优质、抗病性好 ;株型好 ,上部叶小 ,减轻
遮阴 ,整株光合作用强 ,有 2～4 个收敛分枝、有限结荚习性、上部豆荚较多 ;株高 95～105cm、秆硬、节间
短、无空节 ;干物质含量高 ,收获指数超过 515 ; 节间豆荚多、籽粒大 ,百粒重达 2118g ; 抗病虫性强 ,高抗
大豆孢囊线虫 2 号生理小种。
参考文献 :
[ 1 ] 　张秀田 ,张坤普 ,王玉明 ,等 1 激光 810 大豆高产稳产性分析 1 激光生物学报 ,2001 ,10 (1) :64～65
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[ 3 ] 　郑延海 ,闫世纯 ,贾爱君 1 盆栽大豆孢囊线虫 2 号生理小种的鉴定及抗性资源的再评价 1 作物品种资源 ,1999 (2) :34
[ 4 ] 　郑延海 ,崔光泉 ,杨秀凤 ,等 1 高产、孢囊线虫大豆新品种 (系)筛选及其适宜密度研究 1 杂粮作物 ,2003 ,23 (3) :169～170
[ 5 ] 　徐冉 ,郝欣先 ,蒋惠兰 ,等 1 抗孢囊线虫大豆新品种 - 齐茶豆 2 号 1 山东农业科学 ,2002 (4) :48
[ 6 ] 　金剑 ,刘晓冰 ,王光华 ,等 1 美国大豆品种改良过程中生理特性变化的研究进展 1 大豆科学 ,2003 ,22 (2) :137～141
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[ 8 ] 　Tan An2jiang , Xu Hou2rong , Chen Zhen2gu. Research on the mutagenic effects of the He2Ne laser radiation on silkworm (Bombyx mori) 1 激光生
物学报 , 1998 , 7 (3) : 168～170
[ 9 ] 　阎庆尚 ,王连 ,等 1RAPD 标记识别与大豆杂键球蛋白 4 号小种抗性关系的初步研究 1 大豆科学 ,1996. 15 (2) : 126～129
(上接第 101 页)
目前 ,我们正将侯选标记 OPK217550转化为 SCAR (sequence characterized amplified region) 标记 ,以不育
系与其恢复系杂交所获得的 F2 分离群体为材料 ,根据 F2 单株的育性分群 ,利用混合群体分离法 (Bulked
segregation analysis ,BSA)对 F2 分离群体中不同单株进行 SCAR 或 RAPD 分析 ,以验证本研究所获得的与
辣椒细胞质雄性不育基因可能相连锁的侯选标记 OPK217550和 OPK2171500 。
参考文献 :
[1 ] 　王恒明 , 王得元 , 李颖 , 等. 辣椒核质互作雄性不育三系杂种优势利用研究进展. 广东农业科学 , 2003 , (5) : 16～18
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78Acta Agriculturae Nucleatae Sinica
2005 ,19 (2) :85～87