全 文 ：　文章编号 :100028551 (2001) 0220115206
用3 H2TdR 研究混合重金属对
鲫鱼 DNA 合成的影响
周新文　孙锦荷
(浙江大学核农所　浙江 杭州　310029)
摘 　要 :应用3 H2胸腺嘧啶核苷 (3 H2TdR)示踪法研究混合重金属对鲫鱼 ( Carassius aura2
tus)遗传毒性的影响。结果表明 ,最佳取样时间为注射3 H2TdR 后 6h。鱼体各组织对
混合重金属的毒性反应呈现双向效应 ,即低浓度时 ,表现出损伤、修复作用 ;高浓度
时 ,DNA 合成受到抑制。鱼卵、鱼鳃对重金属最敏感 ,损伤浓度为 010773mgΠL ;而大
脑对混合重金属耐受性最强。DNA 损伤修复作用和 DNA 合成作用都存在剂量效应 ,
随着暴露时间的延长 ,毒性作用增大。鱼体各组织对重金属的毒性反应可由 DNA 损
伤修复变成合成抑制。经过 72h 暴露后 ,3 H2TdR 在肝脏、鱼鳃、鱼卵中掺入量约低于
对照的 50 %。
关键词 :3 H2TdR ;混合重金属 ;鲫鱼 ;DNA
收稿日期 :2000207207
作者简介 :周新文 (1969～) ,男 ,湖北人 ,浙江大学 1998 级生物物理专业博士生 ,主要从事环境毒理学研究
随着工农业的发展 ,大量的金属污染物通过多种途径释放进入水体 ,导致了水体污染。大
量的研究表明 ,浓度严重超标的一些重金属离子对水生生物有毒性作用[1 ] 。但已往的研究主
要集中在急性毒性浓度或单一金属的毒性评价上 ,而水体污染的实际情况则是亚急性剂量的
混合重金属污染。此外 ,在毒性评价标准上 ,主要是分析其生理、生化、血液、神经、免疫指标 ,
如某些酶活性、血细胞参数、免疫球蛋白水平的变化等。已有研究表明重金属对哺乳类动物具
有遗传毒性[2 ,3 ,4 ] ,而混合重金属对水生生物遗传毒性作用不甚明了。本研究主要针对目前低
剂量混合污染 ,选择水体常见的污染离子 Cu、Zn、Pb、Cd ,评价不同暴露时间、不同暴露浓度下
的混合重金属对鲫鱼 DNA 合成的影响。
1 　材料与方法
111 　试剂
CuCl2 、ZnSO4 、CdCl2 、PbNO3 均为分析纯试剂 ,3 H2胸腺嘧啶核苷 (3 H2TdR) 由中国科学院上
海原子核所提供 ,放射性浓度为 317 ×107BqΠml ,放射化学纯度 > 95 %。根据 1998～1999 年浙
江省环保局对京杭运河重金属污染水平的调查结果 ,按照 Cu、Zn、Pb、Cd 120∶20∶6∶1 的比例配
制成 1116mgΠml 重金属混合溶液。
112 　供试鱼及处理方法
鲫鱼 ( Carassius auratus)由近江水产公司购得 ,体重 25～30g ,在暴气的自来水中驯养 1 周
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后 ,供试验用。
11211 　最佳取样时间试验 　每缸 (60L) 放养 4 条鱼 ,不用任何重金属处理。每条鱼腹腔注射
1111 ×105Bq 的3 H2TdR 后 ,分别于 3、6、9、12、24h 取样 ,测定鱼血清以及掺入鱼体组织细胞 DNA
中的放射性 ,以确定最大掺入时间。
11212 　不同暴露浓度试验 　鲫鱼暴露于 5 种浓度 ( 010773 mgΠL、01116mgΠL、01193mgΠL、
01387mgΠL、01773mgΠL、1116mgΠL)的重金属混合物中 ,于 24h 后注射 1111 ×105Bq 的3 H2TdR ,于
最大掺入时间取样 ,观察不同重金属暴露浓度对鲫鱼 DNA 合成的影响。
11213 　不同暴露时间试验 　在 010116mgΠL 浓度下 ,分别在 24、36、48、60、72h 注射 1111 ×105Bq
的3 H2TdR ,于最大掺入时间取样 ,观察不同暴露时间对鲫鱼 DNA 合成的影响。
113 　样品制备及分析
从鱼尾部静脉取血样 ,于 2000rpm 离心取血清 50μl。在冰块上解剖鱼 ,分别取大脑、心脏、
肾脏、鱼鳃、肝脏、脾脏、鱼卵组织 ,用冰生理盐水洗涤干净 ,滤纸吸水后 ,称取各组织 100mg ,用
冰生理盐水制成 10 %匀浆 ,转移至 10ml 离心管中 ,并用冰生理盐水 1ml 洗涤 3 次 ,合并滤液 ,
加入 10 %三氯乙酸 5ml ,经 3000rΠmin 离心 15min ,弃上清液 ,沉淀物用 1∶1 乙醚乙醇洗涤 3 次 ,
然后加入 0120ml 62 %高氯酸、012ml 双氧水 ,在水浴中消化 2h ,冷却后用 015M 的 NaOH 调节
pH 至中性。吸取 012ml 样品 ,加到含有 10ml 闪烁液的测量瓶中 ,放置 24h 后 ,用 WALLAC21400
液体闪烁计数仪作均相测量。结果以 100mg 鲜重组织中的 dpm 数表示。
2 　结果与讨论
211 　鲫鱼血清放射性随注射时间的变化
图 1 　血清中的放射性动态变化
Fig. 1 　The dynamics of radioactivity
in the serum
结果如图 1 所示。3 H2TdR 经腹腔吸收
进入血液 ,鱼血清中的放射性在 6h 达到高
峰 ,随后下降。进入血液的一部分3 H2TdR
随血液循环输送到各脏器组织 ,参与组织
细胞 DNA 的合成 ;另一部分3 H2TdR 经代谢
排除体外。因此 ,当血液中的放射性达到
高峰时 ,组织中的3 H2TdR 也同样达到最大
值 ,可根据血清中放射性活度来确定注射
3 H2TdR 后取样的最佳时间。本试验的最佳
取样时间为注射后 6h。
212 　3 H2TdR掺入组织细胞 DNA中随时间
的变化
结果见图 2。在 6h 后 ,鱼卵、脾脏、肝脏组织细胞 DNA 中的放射性已达到或接近最大值 ,
在 6～24h 之间 ,这些组织细胞 DNA 中的掺入的3 H2TdR 量变化不大。而鱼鳃组织细胞 DNA 中
的放射性达到最大值需要 9h ,大脑和肾脏需要 12h ,心脏则要 24h。可这些组织细胞中 DNA 在
最大时间的放射性活度与 6h 的放射性活度相比差异并不大 ,说明在注射3 H2TdR 6h 后取样是
合适的。
从掺入 DNA 的3 H2TdR 量来看 ,鱼卵掺入最多 ,其次为肾脏、脾脏、鱼鳃、肝脏、心脏 ,大脑
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图 2 　3 H2TdR 在组织细胞 DNA 中掺入量随时间的变化
Fig. 2 　The incorporation amount of 3 H2TdR in the Carassius auratus
tissue cellular DNA at different time
掺入的3 H2TdR 最少。这很可能与这些组织细胞分化相对较快有关。此外 ,在评价化合物的遗
传毒性时 ,常用的哺乳动物细胞有大鼠原代肝细胞、Hela 细胞、人羊膜 FL 细胞、人成纤维细胞
及人外周血淋巴细胞等。这些试验都是通过离体细胞培养来进行的 ,而整体动物 DNA 合成试
验则考虑了生物机体代谢调节作用 ,更接近实际情况。此外 ,还可比较组织器官对毒物的敏感
差异 ,从而可更加明确毒物的靶标器官。
213 　混合重金属暴露浓度对鲫鱼组织 DNA合成的影响
表 1 　重金属暴露浓度对鲫鱼( Carassius auratus)组织细胞 DNA掺入放射性的影响
Table 1 　The effect of multiple2metal’s exposure concentration on the incorporation of
radioactivity in the Carassius auratus tissue cellular DNA (dpmΠmg tissue)
组织 tissue
(100mg)
浓度 concentration (mgΠL)
0100 010773 01116 01193 01387 01773 1116
肝脏 liver 68015 75415 87019 68514 61118 58217 54914
大脑 brian 13514 14912 17310 25911 33212 38814 13410
心脏 heart 41213 43517 45819 49611 42218 36214 31116
肾脏 kidney 51311 61717 86112 93615 74117 46413 40517
鱼鳃 gill 61211 96611 81119 74616 63413 59019 52616
脾脏 spleen 58313 75216 87311 105215 78014 52319 42811
鱼卵 ovum 137714 111416 98011 91616 88718 83013 84514
　　注 :数据为 4 次测定平均值
　　Note :The data are the everage of 4 times determination.
　　表 1 结果表明 ,不同组织在试验浓度范围内对重金属的反应存在差异性 ,在肝脏、心脏、肾
脏、脾脏、鱼鳃产生了双向效应 ,即在低浓度下掺入的3 H2TdR 高于对照 ,在高浓度下掺入的3 H2
TdR 明显低于对照。表明在低浓度下这些组织的 DNA 受到了损伤 ,在修复过程中将标记的
3 H2TdR 掺入到 DNA 链中 ;在高浓度下 ,由于细胞内诸如 ATP 等酶的活性受到抑制 ,细胞功能
受到严重的破坏 ,使得 DNA 合成受到影响。在试验浓度范围内 ,3 H2TdR 在鱼脑 DNA 中的掺入
量随混合重金属浓度的增加而增加 ,直到最大浓度时 ,掺入量才接近对照 ,主要表现出修复作
711　2 期 用3 H2TdR 研究混合重金属对鲫鱼 DNA 合成的影响
用。鱼卵中的3 H2TdR 随重金属浓度的增加掺入量减少 ,表现明显的合成抑制作用。研究发现
损伤修复作用与合成抑制作用都存在剂量效应 (图 3) 。
图 3 　组织细胞 DNA 修复与合成抑制的剂量效应
Fig. 3 　The dose response of the tissue celluar
DNA repair and DNA synthesis inhibitation
张治平等[3 ] 利用整体动物研究亚砷酸
钠对小鼠组织 DNA 合成的影响 ,发现三价
砷对小鼠 DNA 的合成具有抑制作用 ,原因
为亚砷酸钠中的三价砷是一种巯基作用
物 ,它能抑制多种组织中大量巯基依赖酶
系 ,导致细胞代谢及 ATP 等能量代谢受到
抑制 ,由此影响 DNA 合成。同时 ,三价砷能
与 DNA 聚合酶的巯基结合也影响 DNA 的
合成与修复。张波等[4 ] 在研究氯化汞、氯
化镍、亚砷酸钠对人血淋巴细胞转化及
DNA 合成的影响时 ,同样发现这些金属离
子对人血淋巴细胞的 DNA 合成具有双向效
应 ,即在低浓度下有促进细胞转化及 DNA
合成的作用 ,而在高浓度下则表现出抑制
作用。
铜、锌是生物必须元素 ,是生物体内许多酶的辅酶。然而 ,一旦超过体内必须浓度 ,则会对
细胞产生毒性作用 ,可抑制胞酶的活性 ,同时可产生大量活性氧、超氧阴离子自由基 (O-2 ·或
O -2 ) 、氢过氧自由基 (HO -2 ·) 、过氧化氢 (H2O2 ) 、羟基自由基 (OH·) 以及单线态氧 (O2·) ,引发细
胞膜的脂质过氧化作用 ,使得细胞膜的完整性受到破坏 ,细胞的结构和功能受到影响[5 ,6 ] 。镉、
铅为非生物必须元素 ,在低浓度时 ,同样能产生各种自由基。这些自由基能攻击生物大分子 ,
引起 DNA 损伤 ;高浓度时能影响核酸内切酶、聚合酶的活性 ,干扰复制的精确性 ,以至引发
DNA 突变。
表 2 　不同组织对重金属的敏感性比较( 24h暴露)
Table 2 　The sensitivity comparison among tissues to multiple2metals (24h exposure)
组织
tissue
最大损伤浓度
maximum repair
concentration (mgΠL) 最大修复率maximum repairrate ( %) 最小抑制浓度minimum inhibitionconcentration (mgΠL) 最大抑制率maximum inhibitionrate ( %)
肝脏 liver 01116 2810 > 01387 1912
大脑 brian 01773 18618 > 1116 110
心脏 heart 01193 2013 > 01773 2414
肾脏 kidney 01193 8215 > 01773 2019
鱼鳃 gill 010773 5718 > 01773 1319
脾脏 spleen 01193 8014 > 01773 2616
鱼卵 ovum 010773 0100 > 010773 3816
比较不同组织的最大损伤浓度可得出不同组织细胞对重金属的敏感性 (表 2) 。鱼卵、鱼
鳃组织对重金属最为敏感 ,损伤浓度为 010773mgΠL。其次是肝脏、肾脏、脾脏、心脏组织 ,最不
敏感的组织是大脑 ,最大损伤浓度为 01773mgΠL。鱼鳃相对比较敏感 ,在 010773mgΠL 时表现出
损伤修复作用 ,其原因可归为鱼鳃直接暴露于重金属溶液中 ,会很快积累较高浓度的重金属 ,
首先会产生毒性反应。大量的研究结果表明重金属主要通过鳃的呼吸作用进入鱼体内。在鳃
811 核　农　学　报 15 卷
中重金属可抑制鱼鳃 ATP 酶的活性 ,鱼鳃 ATP 酶的活性变化常可作为重金属污染的指示酶。
鳃各种酶活性的进一步降低导致了对鱼鳃 DNA 合成的抑制。大脑在相对较高的浓度
(01773mgΠL)时仍表现出了较强的修复能力 ,修复率达到 18616 %。原因可能存在血脑屏障。
随着暴露浓度的增加 ,组织细胞对重金属的毒性反应可由损伤修复作用变成合成抑制 ,从表 2
最低抑制浓度可看出 ,鱼卵、肝脏细胞中的 DNA 最先受到抑制 ,鱼卵的最低抑制浓度为
010773mgΠL ,肝脏为 01387mgΠL。从最大抑制率来看 ,鱼卵、脾脏、心脏细胞的 DNA 合成抑制最
为严重 ,抑制率分别为 3816 %、2616 %和 2414 %。这些组织可能就是混合重金属毒性作用的靶
组织。
214 　混合重金属暴露时间对鲫鱼组织 DNA合成的影响
暴露时间的试验结果表明 (表 3) ,在该浓度下暴露 24h ,除鱼卵外 ,混合重金属对鱼的其它
组织细胞中 DNA 的毒性作用均表现出损伤修复的作用。然而 ,随暴露时间的增加 ,除脑组织
以外 ,其它组织的放射性活度随暴露时间延长而降低 ,说明鱼体组织细胞可在较低的重金属浓
度下通过积累作用达到与高浓度相同的毒性作用。已有许多报道表明重金属进入鱼体与外界
环境浓度及暴露时间长短有关 ,周围环境中的重金属浓度越高 ,单位时间内进鱼体中的重金属
量就越多 ,暴露时间越长 ,鱼体内重金属积累量就越大[7 ,8 ] 。
表 3 　不同重金属暴露时间下掺入鲫鱼组织 DNA的放射性活度
Table 3 　The effect of multiple2metal’s exposure time on the incorporation of
radioactivity in the Carassius auratus tissue cellular DNA (dpmΠmg tissue)
组织 tissue
(100mg)
时间 time (h)
0 24 36 48 60 72
肝脏 liver 68015 77716 63319 40418 35613 27118
大脑 brian 13514 14613 13511 12212 14516 14814
心脏 heart 41213 43914 32714 35119 33910 31117
肾脏 kidney 51311 80415 84312 60313 57912 36913
鱼鳃 gill 61211 76518 58419 53918 44518 30613
脾脏 spleen 58313 87311 95718 107213 80815 34910
鱼卵 ovum 137714 118011 84810 73312 68411 65110
　　注 :数据为 4 次测定平均值
　　Note :The data are everage of 4 times determination.
　　进入鱼体内的重金属由于重金属本身的相互作用及代谢作用在不同组织器官中积累、分
布产生差异 ,其差异引发组织或器官间毒性作用的不同。比如 ,铜与锌能够诱导肝脏细胞产生
金属硫蛋白 ,该蛋白能与重金属发生络合作用 ,使其固定在肝组织或被代谢 ,从而降低了金属
离子的毒性。而不同重金属离子与硫蛋白的结合能力不同 ,使得结合能力弱的离子游离出来 ,
这种游离出来的离子对细胞才具有真正毒性作用。经过 72h 暴露后 ,肝脏、鱼鳃、鱼卵的 DNA
合成约低于对照 50 % ,表明这些组织细胞中的 DNA 合成受到很大影响。此外 ,大脑在该浓度
下并不随暴露时间的延长而出现掺入量增大或减少的现象 ,说明混合重金属对大脑的损伤存
在剂量阈值 ,当浓度超过该阈值时 ,大脑才会受到一定程度的损伤。
3 　结 论
311 　通过分析鱼血清放射性及掺入组织 DNA 中3 H2TdR 的放射性 ,发现鱼血清中的3 H2TdR 在
6h 后达最大值 ,鱼体组织细胞 DNA 中掺入量也已达或接近最大值 ,因此 ,取样的最佳时间为
911　2 期 用3 H2TdR 研究混合重金属对鲫鱼 DNA 合成的影响
6h。
312 　在试验浓度范围内 ,鱼体各组织对混合重金属的毒性反应呈双向效应 ,即低浓度时 ,3 H2
TdR 掺入量增大 ,表现出损伤、修复作用 ;高浓度时 ,3 H2TdR 的掺入量显著低于对照 ,组织细胞
DNA 的合成受到抑制作用。鱼卵、鱼鳃对重金属的敏感性最高 (010773mgΠL) ,在该浓度下鱼的
孵化被破坏。对重金属耐性最强的组织为大脑。无论是损伤、修复作用还是合成抑制作用都
存在剂量效应。
313 　暴露时间的结果表明 ,随着在重金属中暴露时间的延长 ,掺入组织细胞 DNA 中的放射性
降低 ,鱼体各组织细胞 DNA 对重金属的毒性反应可由损伤、修复变为合成抑制。抑制的程度
与重金属积累的部位有关。肝脏、鱼卵、鳃中的 DNA 合成均低于对照的 50 %。
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195
STUDY ON THE EFFECTS OF MULTIPLE2METALS ON Carassius auratus
DNA SYNTHESIS BY USING 3 H2TdR
ZHOU Xin2wen 　SUN Jin2he
( Institute of Nuclear Agricultural Sciences , Zhejiang University , Hangzhou 　Zhejiang prov , 310029)
ABSTRACT :The multiple2metals genetoxicity on Carassius auratus was studied by using 3 H2TdR
tracer method. The results demonstrated that the best sampling time was 6h after injection. The
exposure concentration experiment showed that the multiple2metal’s toxicity to Carassius auratus
was biphasic , and it would damage the DNA strange at low concentration and inhibit DNA at high
concentration . It also showed that the ovum and the gill are more sensitive to multiple2metals than
other tissues , and damage concentration to them was 010773mgΠL. Among the tissues tested the
brain endured the highest concentration of multiple2metals. There existed dose effect for both
DNA repair and synthesis inhibition. The toxicity of multiple2metal on Carassius auratus in2
creased with exposure time. The response of Carassius auratus to multiple2metal toxicity changed
from DNA repair to DNA synthesis inhibition ,the amount of 3 H2TdR incorporated into DNA were
50 %lower than the control in the liver , gill and ovum with 72h exposure.
Key words :3 H2TdR ; multiple2metals ; Carassius auratus ;DNA
021 Acta Agriculturae Nucleatae Sinica
2001 ,15 (2) :115～120