全 文 ：文章编号 :100028551 (2008) 012065205
HPTLC 法测定芹菜提取物中芹菜素的含量
王克勤1 ,2 　陈静萍2 　罗军武1 　刘仲华1 　陈　亮1
(11 湖南农业大学天然产物研究中心 , 湖南 长沙　410128 ; 21 湖南省原子能农业应用研究所 ,湖南 长沙　410125)
摘 　要 :本研究建立了测定芹菜素的高效薄层色谱 (HPTLC)法。采用 CAMAG全自动薄层色谱仪 ,高效硅
胶 G60 薄层板 ,展开剂为氯仿2甲醇2水 (18∶213∶0135) ,测定波长为 345nm ,测定了芹菜提取物中芹菜素
含量 ,在 01116～01696μgΠml 范围内呈良好的线性关系 ( R2 > 0199) 。该方法简单、快速 ,分离度好 ,灵敏
度高 ,适用于芹菜提取物中芹菜素的测定。
关键词 :高效薄层色谱 (HPTLC) ;芹菜素 ;芹菜提取物 ;展开溶剂
DETERMINATION OF APIGNIN CONTENT FROM CELERY EXTRACTION BY HPTLC
WANG Ke2qin1 ,2 　CHEN Jing2ping2 　LUO Jun2wu1 　LIU Zhong2hua1 　CHEN Liang1
(1. Research Center of Natural Products , Hunan Agriculture University , Changsha , Hunan 　410128 ;
2. Hunan Institute of Atomic Energy Application in Agriculture , Changsha , Hunan 　410125)
Abstract :The method to measure apignin content of celery extract was established by HPTLC. The automatism thin layer
chromatogram instrument (CAMAG) with high2performance silica gel ( G60) thin layer board was used. The outspread solvent
(chloroform∶methanol∶water , 18∶213∶0135) ,measure wavelength was 345nm. The apignin content with in 01116～01696ugΠ
ml was the line relation ( R2 > 0199) . The advantages of this method are briefness , speediness , well separation , and high
sensitive degree.
Key words :high2performance thin layer chromatography(HPTLC) ; apignin ; celery extracts ; developing solvent
收稿日期 :2007203231 　接受日期 :2007209207
基金项目 :湖南省财政省长基金 (项目编号 :60171)
作者简介 :王克勤 (19642)男 ,湖南沅江人 ,研究员 ,博士研究生 ,从事核农学以及农产品贮藏与加工研究。E2mail :wkq6412 @1631com
通讯作者 :罗军武 (19572)男 ,湖南邵阳人 ,教授 ,博士生导师 ,主要从事园艺栽培育种。E2mail : luojunwu11 @sohu. com
刘仲华 (19652)男 ,湖南衡阳人 ,教授 ,博士生导师 ,主要从事茶学和天然产物研究。E2mail : larkin2liu @1631com　　芹菜 ( Apium graveolens L. ) 是一、二年生的伞形科芹菜属的草本植物 ,始于药用 ,具有降血压、健胃、利尿、润肺等功效 ,后来把它用作辛香蔬菜。芹菜中的黄酮类化合物 ———芹菜素 (苷)具有预防肿瘤发生的生物活性而备受关注。其提取大都使用乙醇和乙酸乙酯作为溶剂。高金燕等[1 ] 、毕丽君等[2 ] 采用乙醇溶剂法分别从西芹茎叶、水芹菜中提取黄酮化合物 ;张桂等[3 ] 利用该方法对芹菜的根、茎、叶 3 部分进行了研究 ,结果表明 ,芹菜茎叶中都含有较高的黄酮化合物。徐静等[4 ]曾采用高效液相色谱测定了芹菜中主要的 3 种黄酮成分 ,韩小丽等[5 ] 、赵大成等[6 ] 采用薄层扫描法测定花生茎中白黎芦醇、蚂蚁药材及其风湿克酒中亮氨酸的含量 ,何新益等[7 ] 采用高效薄层色谱法定量测量 苦瓜中胡萝卜甾苷。但采用高效薄层色谱法测量芹菜素含量未见报道。长期以来 ,传统的 TLC 法曾被认为只是一种定性和半定量的方法而未受到应有的重视 ,随着现代薄层色谱技术的发展和 TLC 法自动化程度的提高 ,薄层色谱定性的可靠性和定量分析的精密度与准确度大大提高。HPTLC法开始逐渐应用于天然产物的定量分析。本试验尝试在定性试验的基础上建立一种相对简单、经济的芹菜中芹菜素的 HPTLC 定量测量方法 ,并与高效液相色谱 ( HPLC) 方法进行对比 ,以达到快速、准确地测定芹菜提取物中芹菜素的含量。
56　核 农 学 报　2008 ,22 (1) :65～69Journal of Nuclear Agricultural Sciences
1 　材料与方法
111 　材料
干芹菜叶经 70 %乙醇回流提取 2h ,滤液经减压浓
缩后真空干燥 ,得芹菜提取物。本研究所用提取物由
湖南农业大学教育部茶学重点实验室提供。
试剂 :乙醚、氯仿、甲醇、盐酸、无水乙醇均为分析
纯 ;乙腈 (色谱纯) ;芹菜素标准品 (芹菜素含量 98 % ,
陕西慧科) 。
仪器 : 瑞土 CAMAG 薄层层析仪 ( SCANNER3 ) ;
CAMAG Linomat5 点样器 ( CAMAG) ;薄层色谱摄像仪
(REPROSTAR II) ; G60 高效硅胶板 (青岛海洋化工厂) ;
高效液相色谱仪 (日本 Shimadzu 公司 ,色谱仪包括
SPD210AP 紫外检测器、LC210ATVP 泵、Class2VP 色谱工
作站) ;电子天平 (瑞士 AG135) 。
112 　方法
11211 　芹菜素标准溶液和供试溶液的制备 　芹菜素
标样溶液 :精确称取芹菜素标准样品 1616mg ,用无水
乙醇溶解于容量瓶中 ,定容 100ml ,摇匀后备用。
芹菜提取物供试溶液 :称取 0150g 芹菜提取物粉
末 ,加入 20 %盐酸溶液 ,于 90 ℃水浴水解 1h 后 ,用乙
醚反复萃取 ,回收乙醚并浓缩干燥 ,用无水乙醇溶解 ,
即为 1 号样品液 ; 精确称取 0150g 芹菜提取物粉末 ,按
1 号样品液酸水解方法处理后 ,用无水乙醇溶解浓缩
干燥物于容量瓶中 ,并定容到 100ml ,即为 2 号样品液。
11212 　展开剂选择 　根据J . Touchstone [8 ]的观点 ,两种
溶质不能被一定强度的展开剂分开时 ,可被强度相当
的不同组成的展开剂分开。利用这一理论 ,根据芹菜
素的极性 ,选择不同极性的展开剂 ,并调整其组成比来
对样品进行展开 ,从而确定最佳的展开剂及配比。
11213 　光谱扫描 　对展开后芹菜素标准样品的斑点
和芹菜提取物样品相对应处的斑点在 200～700nm 范
围内进行光谱扫描。
11214 　液相色谱分析和紫外光谱鉴别 　色谱条件 :色
谱柱 ODS C18 (150mm ×416mm ,5μm) ;流动相为乙腈2水
(35∶65) ;流速 110mlΠmin ;柱温 35 ℃;检测器 PDA ,检测
波长 270nm。分别吸取 10μl 芹菜素标准样品和 1 号样
品进行检测 ,观察 2 个样品的色谱峰 ,并进行光谱扫描。
11215 　薄层色谱扫描条件 　薄层板为 G60 硅胶板
(10cm ×10cm) ;展开剂为氯仿2甲醇2水 (18∶213∶0135) ;
检测波长 345nm。扫描条件 : 光源为氘灯和钨灯 ,扫
描用计算机软件 CAMAGwinCATS4104 ,单波长反射法
吸收扫描 ,扫描速度 5mmΠs ,狭缝 5100mm ×0130mm ,扫
描时间 3min。
2 　结果与分析
211 　展开剂的选择
薄层色谱分离条件的选择是由被分物质的性质、
吸附剂的活性以及展开剂的极性 3 个因素决定的。因
被分离的物质是确定的 ,因此 ,选择与吸附剂相匹配的
展开剂 ,对分离结果起决定性的作用。根据被展开物
质和展开溶剂的极性大小 ,经过反复调整 ,确定溶剂比
例。从表 1 可以看出 ,第 1 组氯仿为非极性溶剂不能
展开 ,第 2 组甲醇为极性溶剂 ,其比移值 Rf 为 1 ,说明
展开剂极性太强 , Rf 偏大。氯仿、甲醇、水配比的 4 组
和 7 组溶剂展开出现拖尾现象 ,其比移值 Rf 偏大或偏
小。理想的 Rf 应在 012～018 之间 ,且斑点集中 ,彼此
分离开。能较好的将芹菜提取物中各组分分开的溶
剂 ,以 8 组最佳 ,芹菜素的比移值 Rf 为 0165 ,比较适于
进行定量分析。故最终确定以氯仿∶甲醇∶水以 18∶
213∶0135 的配比为展开剂进行展开 ,其薄层展开效果
如图 1。
表 1 　不同展开溶剂比例的 Rf 值
Table 1 　Rf values of developing at different ratio solvents (developers)
组数
group No.
展开剂
developer
比例
proportion ratio
比移值 Rf
Rf value
1 氯仿 (V) chloroform(V) 20 0 0 0
2 甲醇 (V) carbinol (V) 0 20 0 1
3 氯仿 (V)Π甲醇 (V)Π水 (V) chloroform(V)Πcarbinol (V)Πwater (V) 20 20 015 1
4 氯仿 (V)Π甲醇 (V)Π水 (V) chloroform(V)Πcarbinol (V)Πwater (V) 20 5 014 019
5 氯仿 (V)Π甲醇 (V)Π水 (V) chloroform(V)Πcarbinol (V)Πwater (V) 20 5 013 0182
6 氯仿 (V)Π甲醇 (V)Π水 (V) chloroform(V)Πcarbinol (V)Πwater (V) 20 4 0135 018
7 氯仿 (V)Π甲醇 (V)Π水 (V) chloroform(V)Πcarbinol (V)Πwater (V) 20 2 016
8 氯仿 (V)Π甲醇 (V)Π水 (V) chloroform(V)Πcarbinol (V)Πwater (V) 18 213 0135 0165
66 核　农　学　报 22 卷
图 1 　芹菜提取物与芹菜素标准品的薄层色谱图
Fig. 1 　Thin layer chromatogram of standard apignin
and Celery extraction sample
1 :芹菜素标样 2 :芹菜提取物样
1 :apignin standard 2 :celery extractions
212 　HPTLC方法的建立
21211 　芹菜素标准样品薄层标准曲线的绘制 　按薄
层色谱法试验 ,分别取芹菜素标准溶液 2、3、4、5、6μl
和芹菜提取物 1 号样品溶液 4μl ,分别点于同一高效硅
胶 G60 薄层板上。图 2 为芹菜素薄层色谱图 ,表 2 为
所测得各斑点峰面积积分值。以斑点面积积分值为纵
坐标 ,芹菜素标准品含量为横坐标作图 3。用最小二
乘法作线性回归 ,得芹菜素含量与峰面积的标准曲线
回归方程 : y = 15138 x + 759418 , R2 = 01993 ,线性范
围 :01332～01996μgΠ斑点。
图 2 　芹菜素标准品 (左 125)和芹菜提取物的薄层色谱图
Fig. 2 　Thin layer chromatogram of apignin standard
sample (left 125) and celery extract
125 号为芹菜素标准品 (点样量分别为 2、3、4、5、6μl) ,
6 号为芹菜提取物 1 号样品 (点样量为 4μl)
No. 125 indicate apignin standard sample
(sample quantity : 2、3、4、5、6μl)
No. 6 indicate celery extraction sample No. 1
(sample quantity : 4μl )
表 2 　芹菜素标准品含量与斑点峰面积积分值线性关系
Table 2 　Linearity relation of apignin standard sample
content with integral value of apex area of spot
芹菜素含量 (μgΠ斑点)
content of apignin
(μgΠspot) 01332 01489 01664 01830 01996
峰面积 (AU)
peak area (AU) 1222813 1567318 1768412 2003018 2261411
图 3 　芹菜素标准样品的薄层标准曲线
Fig. 3 　Lamina standard curve of
apignin standard sample
213 　HPTLC方法验证
21311 　扫描波长的确定 　如图 1 所示 ,芹菜提取物与
芹菜素标准样品薄层展开后 ,可以明显看出有相同的
条带 ,而在其他地方没有很明显的条带 ,且有相同的比
移值 Rf 为 0165 ,可以证明为同一类物质。通过对薄
层 2 个斑点进行 200～700nm 光谱扫描 (图 4) ,发现两
条带的光谱极为相似 ,分别在 270nm 和 345nm 处有吸
收峰 ,因此 ,可以证明芹菜提取物中主要成分是芹菜
素。从图 4 可以看出 345nm 处的峰形较 270nm 处更为
规则 ,故选择 345nm 作为芹菜提取物的薄层色谱检测
波长。
图 4 　芹菜素标准品和芹菜提取物样品的光谱扫描图
Fig. 4 　Ultra2violet absorption curve
of extraction and apigenin
21312 　芹菜提取物与芹菜素标样的液相色谱和紫外
光谱比较 　取芹菜素标准溶液和芹菜提取物样品溶液
进行反相高效液相色谱分析 ,图 5、图 6 是芹菜素标准
品和芹菜提取物的 HPLC 色谱图 ,图 7、图 8 是芹菜标
准品与芹菜提取物的紫外光谱图。从图中可以看出 ,
76　1 期 HPTLC法测定芹菜提取物中芹菜素的含量
芹菜提取物和芹菜素标准品的液相色谱图中芹菜素有
相同的保留时间 912min ,相对应的色谱峰的光谱图基
本一致 ,即与芹菜素标准品的色谱峰相对应 ,试验结果
进一步验证芹菜提取物的主要成分为芹菜素。
图 5 　芹菜素标准品的 HPLC色谱图
Fig. 5 　HPLC chromatogram of apignin standard sample
图 6 　芹菜提取物样品的 HPLC色谱图
Fig. 6 　HPLC chromatogram of celery extract
图 7 　芹菜素标准品样品光谱图
Fig. 7 　Spectrogram of apignin standard sample
图 8 　芹菜提取物的紫外光谱图
Fig. 8 　Spectrogram of UV chromatogram
from celery extract
21313 　薄层色谱三维扫描专属性试验 　从图 2 的薄
层图可以看出 ,芹菜素斑点的比移值 Rf 基本一致 ,斑
点痕迹随点样量的增加而增加 ,芹菜提取物样品主要
组分能较好地分开。通过对薄层色谱的三维扫描图 9
可以直观地看出 ,芹菜素标准品 (125) 和芹菜提取物样
品 (6)薄层色谱峰的峰形均匀 ,并随着点样量的增加 ,
峰高增加。图谱显示芹菜提取物各组分能够较好地分
离。
图 9 　芹菜素标准品 (125)和芹菜
提取物样品 (6)薄层色谱的三维扫描图
Fig. 9 　Three2dimension2scan thin layer chromatogram
for apignin standard sample (left 125)
and Celery extraction sample
21314 　稳定性试验 　用 CAMAG点样器 Linomat 5 吸
取 5μl 1 号样品液 , 点样展开后按设定的时间 0、10、
20、30min 4 次扫描样品斑点 ,不同时间扫描斑点测得
的峰面积变化情况如表 3 所示 ,结果表明 HPTLC 检测
方法在 30min 内稳定性良好。相对标准偏差 RSD( n =
4)为 0125 %。
表 3 　稳定性试验结果
Table 3 　Result of stability test
时间
time (min) 0 10 20 30
RSD( %)
( n = 4)
斑点峰面积
spot peak area (Au) 2133617 2120916 2129113 2126511 0125
21315 　精密度试验 　分别精确吸取 5μl 芹菜素标准
品溶液 ,点样展开后测得各斑点的峰面积如表 4 所示 ,
结果表明 HPTLC 方法精密度良好。其相对标准偏差
RSD( n = 5)为 1133 %。
表 4 　精密程度试验结果
Table 4 　Result of precision test
样品号
sample number
1 2 3 4 5 RSD %( n = 5)
斑点峰面积
spot peak area (Au) 1927311 1958812 1971214 2000114 1968611 1133 %
21316 　回收率试验 　采用加样回收试验 ,取 1 号样品
86 核　农　学　报 22 卷
液 ,分成 2 份 ,往其中 1 份中加入一定量标准品溶液 ,
分别吸取 2 份样品点样 ,展开后通过薄层扫描方法分
别测定芹菜素含量。结果如表 5 所示 ,样品平均回收
率为 97182 % ,RSD 为 2128 %。
表 5 　回收率试验结果
Table 5 　Test result of callback rate
样品编号
sample number
样品芹菜素含量
content
of apignin (mg)
加入芹菜素量
added quantity
of apignin (mg)
测得芹菜素量
measured quantity
of apignin (mg)
回收率
recovery rate
( %)
平均回收率
average recovery
rate ( %)
RSD( %)
( n = 3)
1 011933 010443 012355 95126
2 011933 010443 012371 98187 97182 2128
3 011933 010443 012373 99132
214 　芹菜提取物中芹菜素含量的测定
精确吸取 2 号样品液 4μl 点于同一薄板 ,重复 3
次 ,样号为 1、2、3。通过对薄层斑点的扫描 ,得到各斑
点的峰面积 ,将峰面积代入标准曲线方程 ,计算斑点芹
菜素含量 ;同时按 HPLC 法测定 2 号样品液芹菜素含
量 ,样号为 4、5、6。测定结果如表 6 所示 ,采用 HPTLC
法测得 2 号样品液中芹菜素含量为 41867 % ,其 RSD( n
= 3)为 0121 % ,HPLC法测 2 号样品液中芹菜素含量为
41855 % ,RSD( n = 3)为 0104 % 。两种方法测定结果相
近 ,能达到预期值。
表 6 　芹菜提取物样品芹菜素含量测定结果
Table 6 　Measurement results of apignin content
from celery extraction sample
方法
method
样号
sample
number
峰面积
peak
area (Au)
样品芹菜素
含量
content of apignin
in sample ( %)
平均含量
average
content
( %)
RSD( %)
( n = 3)
1 2233313 41868
HPTLC 2 2235612 41876 41867 0121
3 2229712 41856
4 78828312 41853
HPLC 5 78893219 41857 41855 0104 %
6 78844516 41854
3 　讨论
目前天然产物中有效成分的检测多依赖高效液相
色谱 (HPLC) ,薄层色谱 ( TLC) 多用于定性分析。随着
薄层扫描法的应用 ,高效薄层色谱 ( HPTLC) 开始逐渐
应用于天然产物的定量分析。HPTLC 板比传统的 TLC
板具有更高的分离效果和更少的上样量 ,HPTLC 法采
用点样器点样 ,避免了手动上样对薄层板的损伤 ,极大
地提高了上样容量和分离效能 ,获得了理想的检测结
果。该方法的采用灵活而宽范围的展开剂配制是另外
一个优势 ,在一定程度上弥补了薄层分离的效能不足。
其检测是通过显色后采用扫描的方式 ,以提高检测灵
敏度或专属性。本试验比较两种方法测定芹菜提取物
芹菜素含量的结果 ,HPLC法 RSD 为 0104 % ,HPTLC 法
RSD 为 0121 %。HPLC 虽较为精确 ,但 HPTLC 法检测
时间要快得多 , 且两种方法均能获得满意效果。
HPTLC 法进行定量 ,方法简便、迅速 ,精密度高。但对
于组分比较复杂的样品定量测量 ,斑点之间易产生干
扰 ,造成测量误差的增加。另外 HPTLC 法还具有多通
道测定的特点 ,对于多个未知样品的分离测定更方便、
快捷和直观 ,并可以在线监测任何组分的 UV、可见光
或荧光光谱。HPTLC的正相系统也是对 HPLC 反相色
谱系统很好的补充。其他组分在 HPTLC 中的定位和
定性将在日后的工作中进一步研究。
本研究在芹菜素定性检验的基础上 ,建立了一种
相对简单经济的芹菜中芹菜素的 HPTLC 定量分析方
法 ,并对该方法进行了方法学上的评价 ,已具有较高的
精密度和准确性 ,在进一步优化色谱条件和改善组分
分离的前提下 ,HPTLC方法完全可以成为一种较快、较
准确测定芹菜提取物中芹菜素的含量方法。
参考文献 :
[ 1 ] 　高金燕 ,曾小花 ,等. 从芹菜中提取黄酮类物质的初步研究. 中国
食品添加剂 2004 ,3 :19～21
[ 2 ] 　毕丽君 ,李　慧 ,等. 水芹中黄酮类化合物最佳提取工艺的研究.
食品科学 ,1999 ,12 :35～37
[ 3 ] 　张　桂 ,畅天狮 ,等. 芹菜中提取黄酮类物质的研究. 食品科学 ,
2002 ,21 (8) :121～125
[ 4 ] 　徐　静 ,郭长江 ,韦京豫. 蔬菜中类黄酮物质的高效液相色谱测
定法. 营养学报 ,2005 ,27 (4) :276～279
[ 5 ] 　韩小丽 ,邵　鹏 ,等. 薄层荧光扫描法测定花生茎中白黎芦醇的
含量. 天然产物研究与开发 ,2006 ,18 :628～630
[ 6 ] 　赵大成 ,秦雪梅 ,等. 薄层扫描法测定蚂蚁药材及其风湿克酒中
亮氨酸的含量. 中国药房 ,2004 ,15 (2) :111～112
[ 7 ] 　何新益 ,刘仲华 ,等. 苦瓜中胡萝卜甾苷的高效薄层色谱分析方
法研究. 食品与机械 ,2006 ,22 (2) :92～94
[ 8 ] 　霍燕兰. 药物分析技术. 北京 :化学工业出版社 ,2005 ,08
96Journal of Nuclear Agricultural Sciences
2008 ,22 (1) :65～69