全 文 ：文章编号 :100028551 (2004) 052353204
高羊茅 CBF 转录激活因子基因片段的克隆
吴关庭1 ,2 　胡张华2 　郎春秀2 　陈笑芸2 　陈锦清2 3 　夏英武1
(11 浙江大学原子核农业科学研究所 ,浙江 杭州　310029 ; 21 浙江省农业科学院病毒学与生物技术研究所 ,浙江 杭州　310021)
摘 　要 :根据拟南芥 CB F 基因序列的保守区设计 1 对特异引物 ,采用 PCR 方法从高羊茅基因组
中扩增出 1 个 DNA 片段并克隆到 pUCm2T载体中。经序列测定和分析 ,该片段长 608 bp ,与 3
个拟南芥 CB F 基因的核苷酸及其推导氨基酸序列分别具有 81～84 %和 75～79 %的同源性 ,而
且推导氨基酸序列中包含有同源性更高的 AP2 DNA 结合域以及 CBF 蛋白的两段特征序列
PKKΠRPAGRxKFxETRHP 和 DSAWR。这些结果表明 ,本研究克隆的片段为高羊茅 CB F 基因片
段。
关键词 :高羊茅 ;CBF 转录激活因子 ; CB F 基因 ;克隆
MOLECULAR CLONING OF A GENE FRAGMENT ENCODING CBF
TRANSCRIPTIONAL ACTIVATOR FROM TALL FESCUE
WU Guan2ting1 ,2 　HU Zhang2hua2 　LANG Chun2xiu2
CHEN Xiao2yun2 　CHEN Jin2qing2 　XIA Ying2wu1
(11 Institute of Nuclear2Agricultural Sciences , Zhejiang University , Hangzhou , Zhejiang , 　310029 ;
21 Institute of Virology and Biotechnology , Zhejiang Academy of Agricultural Sciences , Hangzhou , Zhejiang , 　310021)
Abstract :A DNA fragment was amplified from genome of tall fescue by polymerase chain reaction using a pair of
primers designed from the conserved sequences of three Arabidopsis CB F genes , and cloned into the vector pUCm2
T. Sequence measurement and analysis showed that the nucleotide and deduced amino acid sequences of the cloned
608 bp fragment were 81 %～84 % and 75 %～79 % identical to the three Arabidopsis CB F genes respectively.
Moreover , there were an AP2 DNA2binding domain of higher identity and two signature sequences of CBF proteins ,
PKKΠRPAGRxKFxETRHP and DSAWR , in the deduced amino acid sequence. These results indicated that a tall
fescue CB F gene fragment was obtained in this study.
Key words :tall fescue ( Festuca arundinacea Schreb. ) ; CBF transcriptional activator ; CBF gene ; cloning
收稿日期 :2003203214
作者简介 :吴关庭 (1963～) ,男 ,浙江萧山人 ,副研究员 ,在职博士生 ,现从事植物基因工程研究。3 通讯作者CB F 转录激活因子是近几年从拟南芥[1～4 ] 、油菜[5 ,6 ] 、水稻[7 ] 、大麦[8 ] 以及小麦、黑麦与番茄[6 ] 等多种植 (作)物中分离和鉴定出来的一类受低温诱导的反式作用因子。它们能与 CRTΠDRE DNA 调控元件特异结合 ,激活启动子中具有这一调控元件的冷诱导和脱水诱导基因的表达 ,从而引起植物体内的多种生理生化变化[2 ,6 ,9 ] 。转基因实验证明 , CB F 基因在拟南芥和油菜中超表达 ,转基因植株对低温、干旱和高盐胁迫的耐性显著增强[3 ,6 ,9～11 ] 。由于 CB F 基因超表达能同时诱导多个目标基因在非胁迫条件下表达 ,在提高植物耐逆性方面效果要比单一功能基因的转化好得多[10 ,11 ] ,所以这类转录激活因子的发现为基因工程综合改良大田作物和园艺植物的耐逆性提供了一种全新而有效的技术途径。高羊茅是世界温带地区的一种很重要的多年生冷季型草种[12 ,13 ] ,既可作为牧草种植 ,也可用作草坪
353　核 农 学 报　2004 ,18 (5) :353～356Acta Agriculturae Nucleatae Sinica
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草。虽然高羊茅本身具有较强的耐逆性 ,但在严寒的冬季和酷热的夏季 ,其地上部分也会停止生长 ,发
黄甚至枯死。因此 ,提高高羊茅的耐逆性 ,延长其绿期 ,对发展畜牧业和草坪业具有十分重要的意义。
作者试图利用基因工程技术将 CB F 基因导入高羊茅来实现这一目的 ,本文报道高羊茅 CB F 转录激活
因子基因片段的克隆与测序结果。
1 　材料和方法
111 　材料
以高羊茅品种小野马 (Mini Mustang)的幼叶为提取基因组DNA 的材料。根据在 GenBank 中登记的 3
个拟南芥 CB F 基因 (登记号ATU77378、AF074601 和AF074602)序列的保守区设计 1 对长度均为 21 bp 的
特异引物 ,并委托上海生物工程公司合成 ,上游引物为 :5’2TTCTGAAATGTTTGGCTCCGA23’,下游引物为 :
5’2 AAGGAGATGGTGACGTGTCGC 23’。10 ×PCR 缓冲液、MgCl2 、dNTP、Taq 酶等试剂均购自上海生物工
程公司 ,用于纯化 PCR 产物的 Golden Beads DNA 胶回收试剂盒由上海博彩生物科技有限公司生产。
112 　方法
基因组 DNA 提取参照卢扬江和郑康乐[14 ] 的方法。PCR 扩增在 PE 9600 型 PCR 仪上进行。采用
50μl 反应体系 ,其组成为 :10 ×PCR 缓冲液 (不含 Mg2 + ) 5μl ,MgCl2 (25mmolΠL) 4μl ,dNTP 混合物 (10mmolΠ
L) 4μl ,上、下游引物 (均为 20μmolΠL)各 215μl ,高羊茅基因组 DNA (20ngΠμl) 215μl , Taq 酶 (5 个活性单位Π
μl) 015μl ,ddH2O 29μl。扩增参数为 :94 ℃预变性 5min 后 ,按 94 ℃变性 30 s ,56 ℃退火 30s ,72 ℃延伸 30 s
共进行 30 轮循环 ,最后 72 ℃延伸 8min。
电泳分离 PCR 产物中的目的条带 ,并用 Golden Beads DNA 胶回收试剂盒纯化。取适量纯化的 PCR
产物与 pUCm2T载体在 T42DNA 连接酶催化下 16 ℃连接过夜。连接产物转化大肠杆菌 TG1 菌株感受态
细胞 ,通过蓝白斑筛选、PCR 扩增以及质粒长度和酶切鉴定获得重组质粒[15 ] 。
委托上海博彩生物科技有限公司采用 ABI 377 全自动 DNA 序列分析仪测序。用所得序列在
GenBank 中进行 BLAST检索 ,并与拟南芥等植物的 CB F 基因进行核苷酸和推导氨基酸序列的同源性比
较分析。
2 　结果与分析
211 　PCR产物的扩增和克隆
以高羊茅基因组 DNA 为模板 ,用所设计的 1 对引物进行 PCR 反应 ,得到一条与预计长度相当的约
600 bp 的条带。将经回收、纯化后的 PCR 产物与 pUCm2T载体连接 ,连接产物转化大肠杆菌 TG1 菌株感
受态细胞后 ,在含氨苄青霉素、X2gal 及 IPTG的LB 平板上涂布获得白色菌落 ,挑取这些菌落培养和提取
质粒。以质粒 DNA 为模板 ,用上述相同的上、下游引物进行 PCR 反应 ,结果扩增出了长度约为 600 bp
的 DNA 片段 ,而未经重组的对照 pUCm2T 未能扩增出该长度的片段 ,说明 PCR 产物已克隆到了载体
pUCm2T中。
利用 pUCm2T载体上位于插入位点两端的 Pst I 和 Bgl Ⅱ酶切位点 ,经双酶切从重组质粒中释放出
了长度与 PCR 产物相当的 DNA 片段 (图 1) ,进一步证明 PCR 产物已完整地克隆到 pUCm2T中。
212 　基因序列与同源性分析
序列测定表明 ,克隆片段长 608bp ,碱基序列如下 :
1 TTCTGAAATG TTTGGCTCCG AGAACGAGTC TCCTGCATTA AGCGGGGAGT ATTGTCCGAC
61 GCTGGCCGCG AGCTGTCCGA AGAAACCTGC GGGTCGGAAG AAGTTTCGGG AGACGCGTCA
121 CCCAATTTAC AGAGGAGTTC GTCAGAGACA CTCAGGTAAG TGGGTGTGCG AGGTGAGAGA
181 GCCAAACAAG AAATCCAGGA TTTGGCTCGG TACTTTCCTA ACCGCCGAGA TCGCAGCTCG
241 TGCTCACGAC GTCGCCGCCG TAGCCCTCCG TGGCAAATCC GCCTGCCTCA ATTTCGCCGA
301 CTCGGCTTGG CGGCTCCGTA TCCCGGAGAC AACATGCCCC AAGGATATCC AGAAGGCGGC
361 TGCTGAAGCC GCGGTGGCTT TTCAGGCTGA GATAAATGAT ACGACGACGG ATCATGGCCT
453 核　农　学　报 18 卷
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421 GGACATGGAG GAGACGATCG TGGAGGCTAT TTTCACGGAG GAAAACAACG ATGTGTCTTA
481 TATGGACGAG GAGTCCATGT TAGAGATGCC GGCCTTGTTG GCTAGTATGG CGGAAGGAAT
541 GCTTTTGCCG CCGCCGTCCG TACATTTCGG ACATAACTAT GACTTTGAAG GAGATGGTGA
　601 CGTGTCGC(划线部分为引物序列)
　　在 GenBank 中检索 ,结果正如预期的那样 ,该序列与从拟南芥和其它作物中克隆的 CB F 同源基因
具有较高的核苷酸序列同源性 ,其中与 3 个拟南芥 CB F 基因的同源性为 81 %～84 %(表 1) ,说明本实验
克隆到了高羊茅 CB F 基因片段。
高羊茅 CB F 基因片段不含内含子 ,可翻译成如下 202 个氨基酸 :
1 SEMFGSENES PALSGEYCPT LAASC P·K·K·P·A· G·R·K K·F·R E·T·R·H· P·IYRGVRQRH
51 SGKWVCEVRE PNKKSRIWLG TFLTAEIAAR AHDVAAVALR GKSACLNFA D·
101 S·A·W·R·LRIPET TCPKDIQKAA AEAAVAFQAE INDTTTDHGL DMEETIVEAI
151 FTEENNDVSY MDEESMLEMP ALLASMAEGM LLPPPSVHFG HNYDFEGDGD
201 VS(带点部分是特征序列 PKKΠRPAGRxKFxETRHP 和 DSAWR ;划线部分为 AP2 DNA 结合域)
　　经比较分析 ,氨基酸序列与 3 个拟南芥 CBF 转录激活因子具有 75 %～79 %的同源性 ,其中所含 AP2
DNA 结合域的同源性更高 ,达到 88 %(表 1) 。值得强调指出的是 ,作为 CB F 蛋白特征序列的两段短多
肽序列 PKKΠRPAGRxKFxETRHP 和 DSAWR 在高羊茅 CB F 基因片段的推导氨基酸序列中同样存在。
表 1 　高羊茅 CB F 基因片段与 3 个拟南芥 CB F 基因的核苷酸及推导氨基酸序列同源性比较
Table 1 　Comparison of identity of nucleotide and deduced amino acid sequences between tall fescue
CB F gene fragment and three Arabidopsis thaliana CB F genes
基因
gene
GenBank 登记号
GenBank accession number
核苷酸序列同源性
identity of nucleotide sequence ( %)
推导氨基酸序列同源性
identity of deduced amino acid
sequence ( %)
AP2 DNA 结合域同源性
identity of AP2 DNA2binding
domain ( %)
CB F1 ATU77378 84 79 88
CB F2 AF074601 81 75 88
CB F3 AF074602 81 75 88
图 1 　PCR 扩增片段重组入 pUCm2T
Fig. 1 　Cloning of PCR amplified
fragment into pUCm2t
1. Lambda DNAΠEcoR Ⅰ+ Hind Ⅲmarker 　2. PCR
产物　3. pUCm2T质粒 　4. 重组质粒 　5. 重组质
粒 Pst Ⅰ和 Bgl Ⅱ双酶切产物
1. Lambda DNAΠEcoR Ⅰ+ Hind Ⅲmarker 　2. PCR
product 　3. pUCm2T 　4. Recombinant plasmid 　5.
Recombinant plasmid digested with Pst Ⅰand Bgl Ⅱ
3 　讨 　论
CB F 转录激活因子的一级结构中含有 AP2 DNA 结合域、推
断的碱性核定位信号区和潜在的酸性转录激活域 [1 ,3 ,4 ] ,AP2
DNA 结合域在不同植物中非常保守[16 ] 。此外 ,拟南芥、油菜、小
麦、黑麦和番茄的 CB F 蛋白都含有两段称为特征序列的短多肽
序列 ,即 PKKΠRPAGRxKFxETRHP 和 DSAWR ,前者直接位于 AP2
DNA 结合域的上游 ,后者就在 AP2 DNA 结合域的下游[6 ] 。本研
究根据 3 个拟南芥 CB F 基因序列的保守区设计 1 对特异引物 ,
从高羊茅基因组中扩增出 1 个片段。测序和检索结果表明 ,该
片段的核苷酸及其推导氨基酸序列与 3 个拟南芥 CB F 基因具
有很高的同源性 ,而且 ,推导氨基酸序列中包含有同源性高于整
个片段的AP2 DNA 结合域以及位于该结合域两端的两段特征序
列。根据这些结果 ,作者认为 ,本实验克隆到的片段确实是高羊
茅 CB F 基因片段。
CB F 基因属于耐逆相关基因 ,但其作用并不是表达后直接
产生 ,而是通过激活启动子中含有 CRTΠDRE DNA 调控元件的冷
诱导和脱水诱导基因的表达引起的[17 ,18 ] 。因此 ,植物中的 CB F
553　5 期 高羊茅 CBF 转录激活因子基因片段的克隆
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耐逆机制包含两个基本组成元件 ,一是 CB F 基因 ,二是目标基因。本研究结果的意义首先在于证明了
高羊茅中存在有 CB F 基因 ,因而推测也存在有 CB F 耐逆机制 ,这为利用 CB F 基因进行高羊茅耐逆性
的基因工程改良提供了依据和前提条件。其次 ,高羊茅 CB F 基因片段的获得为该基因全长序列的克隆
奠定了基础。目前 ,作者正在构建高羊茅基因组文库 ,准备用文库筛选的方法进行全长基因的克隆工
作。
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