全 文 ：文章编号 :100028551 (2007) 032261203
中药中耐辐射微生物的分离及其耐辐射特性的研究
邹朝晖1 　邓钢桥2 　赵军旗1 　王　芊2 　李文革2 　彭　玲2 　罗志平2
(11 湖南农业大学 , 湖南 长沙　410128 ; 21 湖南省原子能农业应用研究所 ,湖南 长沙　410125)
摘 　要 :本文以中药辐照杀菌产业化应用过程中 ,采用规范的辐照工艺 ,但产品卫生质量仍不达标的中成
药金锁丸为样品 ,从其中分离出耐辐射的微生物 ,该微生物革兰氏染色为阳性 ,菌落为乳白色同心圆状 ,
显微镜观察菌体为杆状 ,测得在生理盐水和滤纸片中的 D10值分别为 6175 和 7118kGy。
关键词 :耐辐射微生物 ;分离 ;D10值
ANTI2RADIATION MICROBE SEPARATED FROM TRADITIONAL CHINESE MEDICINE
ZOU Zhao2hui1 　DENG Gang2qiao2 　ZHAO Jun2qi1 　WANG Qian2
Li Wen2ge2 　PENGLing2 　LUO Zhi2ping2
(11 Hunan Agricultural University , Changsha , Hunan 　410128 ;
21 Hunan Institute for Application of Atomic Energy in Agriculture , Changsha , Hunan 　410125)
Abstract :One batch of Jinsuo pills ,a kind of Chinese herbal medicine , treated by standardized irradiation process but failed to
meet the sanitation requirement . Radiation resistant microbe was separated from the pills sample and the Gram stain showed
positive , the colony of the microbe is milky white and concentric circle shape. It is observed as one of bacillus by microscope ,
its D10 values in physiological saline and filter paper are 6175 and 7118kGy , respectively.
Key words :radiation resistant microbe ; separation ; D10 value
收稿日期 :2006207228
基金项目 :湖南省农业科学院重点学科资助项目 (湘农科科 2005 - 8)
作者简介 :邹朝晖 (19762) ,男 ,湖南娄底人 ,硕士研究生 ,主要从事辐射生物学研究。
通讯作者 :邓钢桥 (19642) ,男 ,湖南安化人 ,副研究员 ,从事辐射加工方面的研究。Tel :073124690845 ; E2mail :gangqiao454 @1631com　　中药是我国传统医药学的宝贵财富 ,毒性低、副作用小 ,有独特疗效 ,在国内外受到广泛的关注和欢迎。据了解 ,国际中药贸易额已超过 400 亿美元 ,而且每年以 10 %的速度增长 ,但我国中药的出口仅占世界中药贸易额的 5 %[1 ] 。随着现代科学的发展 ,对中药的质量及卫生标准的要求不断提高 ,为了保证人们用药安全 ,围绕着对中药除菌、灭菌和防菌问题国内进行了大量研究。中药辐照杀菌技术由于可常温下进行、穿透能力强、无污染和残留、对中药有效成分影响小等而成为一种比较好的杀菌技术 ,目前已在国内广泛应用。但是在中药辐照杀菌产业化应用过程中 ,偶尔会遇到产品采用规范的辐照工艺剂量处理 ,但产品微生物含量不达标 ,影响了该技术的应用。初步分析可能是产 品中含有耐辐射微生物所致 , 而国内有关中药耐辐射微生物的报道很少。本研究从中药中分离出耐辐射的微生物并对其耐辐射特性的进行了研究。1 　材料与方法111 　材料中成药金锁丸 ,主要成分为沙苑子、实芡、莲子、莲须、龙骨、牡蛎等 ,由制药有限公司提供。该产品在批量辐照杀菌过程中 ,有一批表现异常 ,累计辐照剂量达9kGy 时其细菌总数仍下降不多。选未辐照的该产品作为试验材料。112 　方法
162　核 农 学 报　2007 ,21 (3) :261～263Journal of Nuclear Agricultural Sciences
11211 　分离培养 　称取经 5kGy 辐照处理的金锁丸
1g ,放入盛有 99ml 的并装有玻璃球的无菌水或无菌生
理盐水锥形瓶中振荡 10～20min ,制成样品稀释液 ,然
后按 10 倍稀释法进行稀释分离 ,37 ℃,平板培养 18～
24h ,挑取单个菌落转接斜面牛肉膏蛋白胨培养基培养
24h ,重复 3 次[2 ] 。
11212 　纯化培养及镜检 　将在牛肉膏蛋白胨培养基
斜面培养 24h 的菌转移至试管斜面 ,37 ℃培养 24h。然
后再转接试管斜面 ,37 ℃培养 10h。从试管中取样涂
片、染色、光学下显微镜观察菌体形态 ,革兰氏着色情
况。电镜样品采用液态牛肉膏蛋白胨培养基振荡培
养 , 37 ℃,培养 24h 获得菌悬液 ,将菌悬液滴加到盖玻
片上 ,自然干燥 ,3 %戊二醛磷酸缓冲液 (pH712 左右)
中 ,4 ℃冰箱中固定 2h ,然后用磷酸缓冲液冲洗 3 次 ,
每次间隔 10min , 1 %饿酸固定 1h ,再用磷酸缓冲液清
洗 3 次 ,每次 10min ,30 %、50 %、70 %、90 %和 100 %的
乙醇分别依次脱水 ,每次 10min ,叔丁醇中浸泡 2h 以
上 ,放到冷冻干燥仪中干燥置换水分 ,喷度金到样品表
面在扫描电镜 (JSM6360LV)下观察。
11213 　耐辐射菌的筛选 　将分离得到的微生物 ,用剂
量 8kGy 60 Coγ射线进行照射 ,观察菌体的抗辐射能
力 ,初步确定耐辐射的菌种[3 ] 。为全面了解该菌在不
同培养环境中的形态 ,采用牛肉膏蛋白胨的固体、半固
体、液体振荡三种不同方法培养 ,观察菌落形态和细胞
形态[2 ] 。
11214 　耐辐射特性的研究 　将耐辐射菌在牛肉膏蛋
白胨培养基培养 48h 后 ,用生理盐水和滤纸片 (在等面
积的圆形无菌滤纸片上加入等体积等浓度的菌液 ,低
温无菌干燥)作为介质 ,测定其 D10值[4 ] 。
2 　结果与分析
211 　耐辐射微生物的分离及形态特征
21111 　耐辐射菌的筛选 　经 5kGy 辐照后的金锁丸还
存在许多微生物。在显微镜下进行镜检 ,观察到其形
态多样 ,有球形和杆形等 ,初步分离出 6 类 (表 1) 。
表 1 　金锁丸辐照预处理后样品中分离出的微生物
Table 1 　Microbes separated samples after pre2tested from radiation
菌株
bacteria
形状
shape
直径大小
diameter (mm)
颜色
color
数量
number
透明度
transparency
边缘状况
margin
m - 1 圆形 circular 3～5 乳白色
milky white
少
few
不透明
untransparency
光滑
smooth
m - 2
假根状
false root
大
large
白色
white
多
many
透明
transparency
不规则
irregular
m - 3
同心圆状
concentric circles
2～5 乳白色
milky white
多
many
不透明
untransparency
光滑
smooth
m - 4
边缘锯齿状
sawtooth margin
大
large
白色
white
多
many
不透明
untransparency
光滑
smooth
m - 5 边缘波状
waves margin
大
large
白色
white
少
few
透明
transparency
不规则
irregular
m - 6
圆形
circular
3～6 黄色
yellow
少
few
不透明
untransparency
规则
regular
　　分离出的 6 类微生物纯化后 ,再对其进行 8kGy 的
辐照。辐照后残存菌的检测结果见表 2。由表 2 的数
据可知只有 m23 经 8kGy 辐照后还能检测到有 610 ×
105 的菌 ,可确定 m23 为耐辐射的微生物。
表 2 　8kGy 辐照筛选耐辐照菌
Table 2 　The survival of 6 kinds of selected barteria after 8kGy irradiation
项目 item m - 1 m - 2 m - 3 m - 4 m - 5 m - 6
菌的初始浓度 initial load of bacteria (CFUΠml) 112 ×106 110 ×106 812 ×106 213 ×106 310 ×106 115 ×106
残留菌数 survival bacteria (CFUΠml) < 30 < 30 610 ×105 < 30 < 30 < 30
21112 　耐辐射菌的菌体形态特征
用肉眼观察 ,耐辐射菌在牛肉膏蛋白胨固体培养
基表面生长良好 ,菌落成规则乳白色的同心圆状 ,平皿
内不产生色素沉淀。用倾注法培养时 ,在皿底也有少
量菌落 ,而形态较少 ,菌落为透明状 ,培养基中间没有
产生菌体 ,可能在倾倒培养基时皿底留有少量空气 ,初
步认定它为好氧菌。液体振荡培养液混浊 ,显微观察
细胞体积大于固体和半固体培养基中的细菌。在电子
262 核　农　学　报 21 卷
显微镜下进行镜检 ,观察到细胞形态为杆状 (图 121) ,
有些成对或以短链排列 ,有芽孢 (图 122) ,但从镜片上
看到培养 2～3d 的菌体比培养 1d 的要长而大 ,这可能
与培养时间有关。革兰氏染色为阳性。
经上述比较可初步判断 ,分离出的耐辐射菌属于
芽孢杆菌属 ,属于何种菌株 ,还需进一步的鉴定。
212 　耐辐射微生物的 D10值
纯化后的耐辐射微生物 ,在生理盐水和滤纸两种
不同的介质中辐照杀菌结果见表 3。
图 1 　电子显微镜下观察到的耐辐射菌形态
Fig. 1 　morphous of anti2radiation microbe
under electronic microscope
1 :营养体 ;2 :芽孢 　1 :vegetative cell ; 2 :spore
表 3 　耐辐射菌γ射线辐照后的存活菌数
Table 3 　The number of survivor of radiation resistant bacteria afterγ2rays irradiation
培养介质 culture medium
吸收剂量 absorbed dose (kGy)
0 1189 3179 5168 7158 9147 11136 13126
生理盐水 saline (CFUΠml) 2 ×107 111 ×107 418 ×106 215 ×106 115 ×106 715 ×105 412 ×105 211 ×105
滤纸 filter paper (CFUΠg) 113 ×107 711 ×106 317 ×106 210 ×106 110 ×106 613 ×105 315 ×105 118 ×105
　　从表 3 可以看出 ,耐辐照微生物的存活菌数与辐
照剂量存在函数关系 ,经推导符合如下直线回归方程 :
y (生理盐水 ) = - 011482 x + 712848和 y (滤纸) = - 011392 x
+ 711021。通过回归方程可以推导出 D10 值 ( - b 的倒
数) 。耐辐射菌在生理盐水与滤纸片中的 D10值分别为
6175、7118kGy ,在生理盐水中的 D10值比在滤纸片上的
低。
3 　讨论
耐辐射球菌 ( Deinococcus radiodurans) 是目前研究
较多的 ,它是一种革兰氏阳性微球菌 ,属于奇球菌
( Deinococcus)属 ,直径在 115～315um 之间 ,非孢子菌 ,
能产生色素。氧气是耐辐射球菌生长所必需 ,乏氧条
件下耐辐射球菌几乎不能生长。单克隆的菌苔呈凸
状 ,表面光滑 ,它对电离辐射、紫外线、过氧化氢等一些
DNA 损伤剂都具有极强抗性 ,研究表明 ,这种独特抗
性归因于其具有高效的而准确的 DNA 修复系统[6 ,7 ] 。
本研究经从中药中分离纯化得到的耐辐照微生
物 ,形状为杆状 ,有芽孢 , 革兰氏染色为阳性 ,好氧 ,不
能产生色素 ,菌落形态为同心圆状 ,乳白色 , 初步推测
为芽孢杆菌属 ,与已报道的耐辐射球菌有明显的区别 ,
还有待进一步鉴定为何种菌体。
从中药中分离纯化出的耐辐照微生物 ,测得γ射
线杀灭的 D10值在生理盐水中为 6175kGy ,在滤纸上为
7118kGy。在已报道的常见微生物中属于耐辐射的。
作为一次性医疗卫生用品辐照杀菌的指示菌短小芽孢
杆菌 E601 ,辐照杀菌的 D10值在 1160～2153kGy[8 ] ,以及
耐辐射极强的微球菌它的 D10值约为 8 kGy ,而本研究
分离出的耐辐射菌 ,它的 D10 约为 7 kGy ,其耐辐射机
理 ,有待进一步探讨。
耐辐射菌是世界上极受重视的具有开发利用前景
的微生物资源 ,现今发现的耐辐射菌主要是耐辐射异
常球菌属的菌株 ,美国能源部已着手研究耐辐射菌用
于核废料治理和污染物处理[9 ] 。从该中成药中分离出
的该微生物是否能有其它新的用途 ,还有待于进一步
研究。
参考文献 :
[1 ] 　李　刚. 中药出口现状分析. 中药经济与信息 , 2004 ,33 :18～20
[2 ] 　钱存柔 ,黄仪秀. 微生物学试验教程. 北京 : 北京大学出版社 ,
1999 : 85～92
[3 ] 　陆兆新 , 邹晓葵 , 武久正照 ,等. 输液器污染微生物辐射抗性频率
发布的研究. 核农学报 , 2000 ,14 (3) :157～162
[4 ] 　马广存 ,戚成云 ,魏启建 ,等. 确定辐照灭菌 D10值的三种方法. 核
农学通报 ,1992 ,13 (5) :216～218
[5 ] 　周瑞英. 医疗用品电离辐射灭菌研究进展. 消毒与灭菌 ,1989 ,6 :
166
[6 ] 　孙翠凤 ,刘芬菊 ,汪 　涛. 耐辐射球菌 Deinococcus radiodurans 辐射
抗性的研究进展. 辐射研究与辐射工艺学报 ,00218 20 (3) 161～165
[7 ] 　陈仲中 ,王梁燕 ,等. 耐辐射奇球菌 Deinococcus radiodurans 中非编
码 RNA. 核农学报 ,2006 ,20 (6) :383～387
[8 ] 　耿养生 ,袁洽勤 ,南培安. 短小芽孢杆菌辐射力影响因素的研究.
预防医学文献信息 ,200216 (1) :20～50
[9 ] 　lange C C ,Wackett L P. Minton kwi , et al . Engineering a. recombinant
Deinococcus radiodurans for organo pollutant degradation in radioactive
mixed waste environments. Nature Biotechnology , 1998 ,16 :929～937
362Journal of Nuclear Agricultural Sciences
2007 ,21 (3) :261～263