全 文 ：6
文章编号 ：1000—8551(2004)01—006—05
核 农 学 报 2004，18(1)：6～10
Acta Agriculturae Nucleatae Sinica
外源 DNA导入小麦后雄性不育变异的初步研究
杨景成 于元杰 齐延芳
(1．北京自然博物馆，北京 100093；2．山东农业大学农学院，山东 泰安 271018
3．山东省农业科学 院原子能农业应用研究所 ，山东 济南 2501oo)
摘 要：利用浸泡法将外源~．DNA导入普通小麦品系814527，获得不育变异株，稳定为不育系，
简称 D型不育 系。该不育 系小花结构具有显著特点，多数小花子房数 目增加 ，花药数 目减少，
而且二者之和并非恒定为 4。多子房小花一般位于穗 的中部，而顶部和基部小花未发现 多子
房现象。多子房小花的主子房位于小花的中央，副子房着生于主子房的周围。子房的发育进
程不同步，主子房发育较早，体积较大；副子房发育较慢，而且未发育成熟即退化萎缩。花药多
呈短棒状、月牙状等畸形状态，且多数在早期即退化萎缩，无生活力花粉。杂交试验表明，该不
育 系为细胞质雄性不育系，不育度达 99％，受体品系 814527可作其保持 系。不育系与鲁 麦 l4
号的杂种一代在穗长、每穗小穗数和穗粒数等性状上存在一定程度的杂种优势 ，单株产量较鲁
麦 l4号增加 ll、6％。
关键词：小麦；外源 DNA导入；细胞质雄性不育；花结构异常
PRELIM INARY STUDIES oN MALE STERILE M UTANT AFTER EXoGENoUS DNA
INTR0DUCED INTo W HEAT
YANG Jing—cheng YU Yuan—jie QI Yan—fang
(1．Laboratory ofQuantitative Vegetation Ecolog~，Institute ofBotany，Chinese Academ)ofSciences，Beijing 100093；
2，Academ)ofAgronomy，Shandong Agricultural Universit)，Taian，Shandong 271018；
3-Institue ofAtomic Energy Application，Shandong Academ)ofA~ricultural Sciences、Jinon，Shandong 250100)
Abstract：A stable sterile line— D—type sterile line was obtained after exogenous~．DNA introduced into wheat line
8 14527．There were obvious characters in flower structure of the sterile line，The number of ovaries increased and
that of anthers declined，and the sum was not always equal to four．Polygynous flowers were located in the middle of
panicles，while there were no polygynous ones on the top and the base of panicles，The main ovary was in the center
of the flower，and the accessory ovaries surrounded the main ovary，The ovaries did not develop synchronously，
main ovary developed earlier and accessory ones slower，Th e volume of main ovary was bigger than the accessory
ones．Anthem of the sterile line with abnormal shapes were obsolescent at early stage，and had no living pollen．It
showed that the sterile line Was a cytoplasmic male sterile one， and the acceptor line 8 14527 could be its
maintainer．Th e hybrid of the sterile line and Lumai 14 had some heterosis in traits such as panicle length，spikelet
numb er per panicle and grain numb er per panicle．and its yield per plant was 1 1．6％ higher than that of Lumai 14．
Key words：wheat(Triticum aestivum L．)；exogenous DNA introduction；cytoplasmic male sterility；structural
abnormity of flower
收稿 日期 ~2002．10．09
基金项目：山东省聊城市国家大型优质小麦基地项目及国家科技部和山东省科技厅“九五”重点项目资助(96．C01-OI一02—12)
作者简介：杨景成(1971～)，男，博士研究生，从事过小麦生物技术 、核技术诱变育种方面的工作。
*通讯作 者
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1期 外源 DNA导入小麦后雄性不育变异的初步研究
60年代开始的远缘杂交发现，尽管杂交后代的染色体数 目、形态与母体没有多少差异，但是在外观
性状上能找到远缘亲本的某些特征⋯。针对这一现象，周光宇提出了DNA片段杂交假说。认为从整体
上看，远缘亲本间的染色体结构是不能亲和的；但从进化的角度讲 ，部分基因间的结构有可能保持一定
的亲和性。当远缘花粉中的基因组进入母体(受体)后，未被分解的某些 DNA片段有可能被整合进受体
染色体，而在子代中表达典型的或更多的是非典型的遗传变异 ]。该假说为外源 DNA导入技术应用于
作物育种提供了理论基础。在此基础上设计了白花授粉后外源 DNA导入(又称花粉管通道技术) J。
随着研究的不断深入，该技术在方法、技术细则上不断丰富和完善，又提出了浸泡法(干胚和胚性愈伤组
织)、微量注射法、射击穿入法(基因枪法、电击法)等方法。培育出了一大批具有优良性状的作物新品种
(品系、种质)。同时，在外源 DNA导入可靠性和可行性验证方面也做了大量的研究 -7J。由于外源
DNA导入育种技术具有操作简便，缩短育种年限，变异范围广泛，变异频率高等优点，非常适合我国作
物育种的实际情况，所以被越来越多的育种工作者所认可和接受。
吴小月报道，外源 DNA导入水稻后出现了不育变异 。但迄今为止未见关于这方面详细研究的报
道。山东农业大学农学院将外源 ~,DNA导入普通小麦品系814527，获得一不育变异株，稳定成不育系，
简称 D型不育系。现将对该不育系的初步研究结果报道如下。
1 材料与方法
1．1 材料
普通小麦品系814527，由山东省泰安市农科所选育，具有大穗、成穗率较低等特点。D型不育系，由
山东农业大学农学院植物遗传工程实验室通过浸泡法将 ~,DNA导人品系814527获得的不育变异株稳定
而成。与品系814527相比，不育系在株型、苗期长相、抽穗期、叶色以及穗部性状上几乎没有差异。鲁
麦 l4号，由山东省烟台市农科所选育，具有成穗率高、抗病性强、产量高等特点，是9o年代山东省小麦
高肥水组区域试验对照品种。
1．2 方法
1．2．1 材料种植与杂交 上述材料于 1995年 l0月种植于山东农业大学教学农场 和校内网室。1996
年4月底至 5月初，不育系套袋自交，以不育系、受体品系814527和鲁麦 l4号为亲本分别进行正反交，
收获，考种。1996年 l0月种植 3个亲本及 F．，1997年重复上一年工作。1997年 l0月进行材料种植，
1998年 5月，调查 F 代育性分离情况。
1．2．2 解剖镜及扫描电镜观察 于开花前后分别取不育系及受体品系814527的小花，在 Olympus解剖
镜下观察其外部形态特征并照相。于开花前后分别取处相同发育时期的不育系及受体 814527的子房
和花药。2％戊二醛固定 4h，乙醇脱水，醋酸异戊酯置换两次，每次20r／in，CO 临界点干燥，EikolB．5型离
子溅射仪镀膜 2～3min。用JEM．1200EX透射电镜扫描观察，并照相。
2 结果与分析
2．1 不育系小花结构特点
对品系814527和不育系的子房和花药进行解剖镜和扫描电镜观察。品系814527的花药饱满，呈长
柱形，顶端略尖，开花前为绿色(图 1-1～4)。开花时花丝外挂，呈黄色，纵裂，散出有生活力的花粉。不
育系花药瘦小，不饱满，呈短棒状、月牙形等畸形状态，颜色淡黄或白色(图 1-1，2)。开花时花丝虽然略
有伸长，但雄蕊不外挂，不开裂，无活力花粉散出。花药在发育早期即退化萎缩。
与品系 814527相比，不育系小花结构有一显著特点。品系814527的小花由 1枚子房和 3枚花药构
成(图 1 3，4)。而不育系小花中子房和花药数目发生变化，多数小花子房数目增加，花药数 目减少。每
朵小花有 1～4枚子房、0～3枚花药，且子房和花药数目之和并非恒定为4。子房的发育进程并不一致，
位于中央的主子房发育较早，体积较大；副子房着生于主子房的周围，发育进程较慢，体积小(图 1—5～8，
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8 核 农 学 报 l8卷
图 1 D型不育 系及其保持 系花器官构造
Fig．1 Flower structure of D type sterile line and its maintainer line
1．花药和子房：a：品系 814527的花药和子房．b，e，d，e，f：D型不育系的花药和子房．b：3枚花药和 1枚子房；c：4枚花药无子房；d：1枚
花药 3子房；e。f：2枚花药 1枚子房；2．花药：a。b：品系814527的花药；e，d：D型不育系月牙形和短棒状的畸形花药；3—10．花药和子
房的解剖镜照片；3，4：品系814527；5—10：D型不育系；5：2枚花药3枚子房；6：1枚花药 3枚子房；7，9：4枚子房无花药；8：2枚花药2
枚子房；10：2枚花药 1枚子房；11。12：D型不育系子房扫描电镜照片
1．Anther and ovary：a：an ther an d ovary of line 814527；b，e。d，e。f：an ther and ovary of D type sterile line；b：3 an thers an d 1 ovary：e：4 an thers an d
no ovary；d：1 an山er and 3 OVaries；e，f：2 an山ers and 1 ovary；2．Anther：a，b：an山ers of line 814527；e．d：abnormal anthers of the D type sterile
line；3— 10．dissector photographs an d scan ning electrie·mieroscope photographs of an ther an d ovary；3。4：photographs of line 814527；5 — 10：
photographs of D type sterile line；5：2 anthers and 3 ovaries；6：1 anther and 3 ovaries；7，9：4 ovaries and no anther；10：2 anthers and 1 ovary；11，
12：scanning electrie·mieroscope photographs of ovaries of D type sterile line
11，12)。多子房小花和正常小花在穗部的着生位置有一定规律，多子房小花位于穗中部，正常小花位于
穗顶和基部。还发现部分花药顶端乃至整体覆盖有簇毛状物质，类似雌蕊的柱头(图 1-6，8，10)。
2．2 不育系育性特点
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1期 外源 DNA导人小麦后雄性不育变异的初步研究 9
由表 1看出，以不育系为母本，品系814527和鲁麦 l4号为父本杂交，当代结实率分别为74．3l％和
82．65％；相应的反交组合结实率均为 0。这说明不育系为细胞质雄性不育系。以不育系为母本与品系
814527杂交，F．结实率为0．98％，与不育系套袋自交结实率相近，受体品系 814527可以作为该不育系的
保持系。不育系作母本，与鲁麦 l4号杂交，F 和 F2的结实率分别为94．02％和95．06％，鲁麦 l4号可以
作为该不育系的恢复系。
表 I 不同组合各世代结实率情况
Table l Fertility of cross combinations in different generations
2．3 不育系与鲁麦 14号杂种 1代的杂优分析
对品系814527、不育系、鲁麦 l4号及其与不育系杂种 F．的株高及穗部性状进行比较(表 2)。在株
高、穗长和每穗小穗数3个性状上，F。表现出较强的杂种优势，中亲优势分别为4％、16％、和 11％。与
鲁麦 l4号相比，F 穗长和穗粒数分别提高 30％和29．7％，单株穗数降低 l2．5％，千粒重变化不大。F．
与受体 814527相比，穗长、每穗小穗数增加 5．5％、2．9％，单株穗数提高较大(39％)，千粒重略有降低。
从单株产量看，鲁麦 l4号与不育系杂种 l代比鲁麦 l4号和品系814527分别提高 11．6％和 l7．8％。产
量是各个性状的综合反映，从总体上看，该不育系在杂种优势利用上可能有一定的利用价值。
表2 品系814527、不育系、鲁麦 l4号及其与不育系的杂种 F1株高及产量性状比较
Table 2 The comparison of plant height and traits related to yield of line 8 14527，sterile line，
Lumai 14 and its FI hybrid with the sterile line
注：以鲁麦 14号单株产量为基准。Note：Using the#ant yield of Lumai 14 as standard
3 讨论
3．1 不育系小花结构异常及其可能原因
与受体品系 814527相比，不育系小花结构发生显著变化，穗中部小花子房数 目增加，花药数目减
少，同时具有细胞质雄性不育特点。这一变化在个体水平上证明了外源 DNA导人可以引起性状变异。
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10 Acta Agriculturae Nucleatae Sinica
2003，18(1)：6 10
我们已经对 D型不育系花粉母细胞减数分裂过程中染色体行为进行了细胞形态学观察 ，对花药及花
粉发育进行了超微结构观察 ¨，还做了叶绿体 DNA以及核 DNA和叶绿体 DNA的分子杂交⋯ ，从染色
体和分子水平上证明了外源 DNA导入引起性状变异的可靠性。同时，对外源 DNA导入的机制进行了
初步探讨。D型不育系小花结构变化可能是由于外源 DNA导入受体后，一部分外源 DNA片段整和插入
到变异后代的DNA序列中，改变了原有的基因表达和调控，打破了细胞核和细胞质两个遗传系统的固
有平衡，引起生理生化代谢发生紊乱，导致组织分化上出现这种子房数目增加而花药数目减少的现象。
这种生理生化代谢紊乱很可能是有时间性的，在组织分化初期，出现代谢紊乱或紊乱程度强；而在分化
后期，这种代谢紊乱消失或者程度减弱，从而使发育较晚的穗顶部和基础小花的子房和花药分化趋于正
常。花药上类似于柱头的簇毛状物质的产生可能也是由生理生化代谢紊乱造成的。
小麦多雌蕊现象已有报道 ，一般认为是雄蕊心皮化形成雌蕊，结果造成雌蕊数 目增加 ，雄蕊数 目减
少，且往往延迟开花，并出现一定程度的不育 ’” 。在雌蕊和雄蕊数目变化上，D型不育系与多雌蕊小
麦相同，但在胚胎发育及雄蕊育性方面存在很大不同。3粒小麦胚和胚乳发育基本上与其他春小麦相
同，只是每朵小花具有 3个可育的雌蕊。D型不育系只有主雌蕊发育正常，而其他副雌蕊则退化萎缩，
且雄蕊全部不育。人工授粉后的结实率调查结果表明，多子房情况下未发现多粒现象。这可能是由于
主子房发育较早 ，副子房在发育进程上落后于主子房，在主子房完成受精时副子房还未发育成熟，不能
进行正常的受精造成的。在 D型不育系胚及胚乳的发育方面还需要做进一步的研究，以解释副子房不
能进行正常受精的确切原因。
3．2 D型不育系在小麦杂种优势利用中的价值问题
小麦细胞质雄性不育系最初是通过回交置换的方法将普通小麦的细胞核换到近缘种属的细胞质中
获得的。据报道，通过小麦和近缘种属杂交和置换回交得到的各种类型的小麦细胞质不育系至少在 70
种以上。但这些不育系大多数具有不良细胞质效应或其他缺点，限制了它的应用，难以在杂种小麦上直
接利用 。通过外源DNA导入方法获得不育系不必经过核质代换，没有不良细胞质效应。试验证明，
D型不育系与受体品系814527相比，仅表现育性上的差异，而其他农艺性状几乎没有改变。所以，通过
这一方法获得的不育系可能具有更大的利用价值，可以直接应用于杂种小麦。
试验结果表明，D型不育系与鲁麦 14号的杂种 F。代在穗长、每穗小穗数和穗粒数等性状上具有一
定程度的杂种优势，单株产量比鲁麦 14号高 11．6％。但是这一方面工作还远远不够，为了证明 D型不
育系在小麦杂种优势上的应用价值，必须选配大量的杂交组合，以期获得杂优更强的恢复系。
致谢 ：在解剖镜和扫描 电镜观察过程中 ．得到山东农 业大学高荣歧教授和郭延奎老师的悉心指导 ．在此表示衷心感谢 。
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