全 文 ：© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
　文章编号 :100028551 (2002) 0520301204
核多角体病毒侵染棉铃虫中肠细胞
过程的电镜观察
张严峻1 　徐华君2 　谭　军3 　林玉清3
(11 浙江省疾病预防控制中心 ,浙江 杭州　310009 ;2. 杭州民生生物科技有限公司 ,浙江 杭州　310020 ;
3. 浙江大学生命科学学院 ,浙江 杭州　310029)
摘 　要 :本文应用电子显微镜技术观察了核多角体病毒入侵棉铃虫中肠细胞及其增殖
和释放。经口接种后 30min ,有许多病毒粒子进入中肠后部柱状细胞的微绒毛间隙
处 ,且以其粒子的一端与微绒毛接触并吸附在微绒毛表面上。接种后 1h ,病毒粒子
的囊膜与微绒毛的质膜以顶端对顶端、顶端对侧面发生融合 ,仅以核衣壳侵入细胞
内 ,然后又继续移至微绒毛底部 ,从而进入中肠细胞内。此外 ,还发现有的病毒粒子
直接与柱状细胞的质膜融合 ,侵入中肠细胞。
关键词 :核多角体病毒 ;棉铃虫 ;侵入 ;中肠细胞
收稿日期 :2000204217
基金项目 :国家自然科学基金 (39400005)资助
作者简介 :张严峻 (1968～) ,男 ,硕士 ,助理研究员 ,主要研究方向为病毒学
核多角体病毒是以鳞翅目昆虫为主要宿主的病毒。有关病毒粒子侵入昆虫中肠细胞的过
程的研究报道较少 , Kawanishi 等[1 ] 报道了夜娥 ( Rachiplusia ou) 核多角体病毒感染粉纹夜蛾
( Trichoplusia ni)幼虫时 ,病毒粒子与微绒毛以侧面对侧面相互融合 ,然后侵入中肠柱状细胞。
Tanada 及 Granados[2 ,3 ]报道了病毒粒子的囊膜与微绒毛进行融合 ,病毒侵入细胞的研究。但侵
入图象均不清晰。为了揭示核多角体病毒的入侵途径 ,我们用棉铃虫核多角体病毒做了进一
步的研究。
1 　材料与方法
111 　昆虫与病毒
棉铃虫 ( Helicoverpa armigera) 5 龄幼虫 ,挑选生长整齐的幼虫用于试验。
112 　多角体及其病毒粒子的纯化
棉铃虫核多角体病毒由中科院病毒所提供。组织捣碎机捣碎感染棉铃虫核多角体病毒致
死的幼虫 ,4 层纱布过滤 ,滤液 3500rΠmin ,4 ℃离心 30min ,收集白色沉淀 ,加入蒸馏水制成悬液 ,
3500rΠmin ,4 ℃离心 20min ,如此重复数次 ,提纯多角体病毒。在提纯的多角体悬液 (1 ×108 PIBΠ
ml)里加入等体积的 0105molΠL Na2 CO3 和 010125molΠL NaCl 混合液 ,30 ℃水浴 15min ,使多角体
103　核 农 学 报　2002 ,16 (5) :301～304Acta Agriculturae Nucleatae Sinica
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完全溶解。
溶解液 3500rΠmin ,4 ℃离心 20min ,取上清液于 12000rΠmin、4 ℃离心 20min ,取沉淀 ,用少量
011molΠL pH712 磷酸缓冲液悬浮 ,制成纯化的病毒粒子。
113 　核多角体病毒入侵及其感染途径的电镜观察
用圆头注射器将约 5 ×107 个多角体量的纯化核多角体病毒粒子经口注入低温处理和非
低温处理过的 5 龄幼虫中肠内。病毒接种后 15、30min 及 1、2、3、6h 取出中肠组织 ,按常规方法
固定 ,脱水 ,渗透 ,包埋 ,制作成超薄切片 ,经醋酸铀和柠檬酸铅染色后置于日立 H27000HA 透
射电子显微镜下观察摄像。
2 　结 　果
棉铃虫幼虫接种核多角体病毒后 ,病毒粒子的入侵速度和数量因幼虫是否经过低温处理
而有明显差异。按种病毒 30min 后 ,在中肠腔内及中肠柱状细胞的微绒毛间隙处 ,可以观察到
许多囊膜结构完整的病毒粒子 (图版 Ⅰ21) 。在经低温处理的幼虫的中肠微绒毛间隙处的病毒
粒子数量明显多于未经低温处理的幼虫。进入微绒毛间隙后 ,病毒粒子开始与微绒毛接触 ,并
且多数是以其顶端吸附在微绒毛顶端或侧面 (图版 Ⅰ22) 。附着现象在低温处理虫处容易观察
到 ,而未经低温处理的幼虫处就很难找到附着于微绒毛表面的病毒粒子。接种 1h 后 ,吸附在
微绒毛顶端及侧面的病毒粒子开始与微绒毛的质膜发生明显的融合 (图版 Ⅰ23 ,4 ,5) 。同样 ,
接种 1h 后 ,在未经低温处理的切片中就没有观察到膜融合现象。病毒粒子的囊膜与微绒毛的
质膜融合有以下方式 :囊膜的顶端与质膜的顶端相融合 (图版 Ⅰ23 ,4) 、顶端对侧面相融合 (图
版 Ⅰ25) 、侧面对侧面相融合 (图版 Ⅰ26) 。经膜融合后 ,病毒粒子的囊膜脱去 ,其核衣壳进入微
绒毛内 (图版 Ⅰ27) 。接种后 2h ,核衣壳移至微绒毛的底部 (图版 Ⅰ28) ,接着进入中肠柱状细胞
的细胞质内 (图版 Ⅰ29) 。除经微绒毛进入细胞内外 ,还观察到有的病毒粒子直接与中肠柱状
细胞的质膜发生融合 (图版 Ⅰ210) 。
3 　讨 　论
正常情况下 ,幼虫会把摄入中肠的大部分病毒粒子排泄出去 ,加上消化液中含有使病毒粒
子失活乃至溶解的蛋白质[4～6 ] ,能进入微绒毛间隙处的病毒粒子很少 ,因此吸附及侵入现象就
很难观察到。本研究除了用高浓度的纯化病毒粒子取代以往的多角体接种外 ,还根据低温处
理使中肠细胞的核多角体病毒感受性增强的报道[7 ] ,在接种前 ,以 5 ℃对幼虫进行了 24h 的低
温处理。结果表明 ,经低温处理的幼虫样品中 ,不仅中肠腔内病毒粒子比非处理虫多 ,而且中
肠柱状细胞的微绒毛间隙处的病毒粒子数目也比非处理虫的多。在接种一定的时间内 ,低温
处理幼虫中可观察到病毒入侵细胞的各种膜融合现象和核衣壳在细胞质内移动的现象 ,但非
处理虫中不能观察到。表明低温处理增强了中肠细胞对核多角体病毒的感受性。
低温处理为什么会提高中肠细胞的核多角体病毒感受性呢 ? 核多角体病毒入侵昆虫中肠
上皮细胞必须先克服两道主要障碍 :一是消化液 ,一是围食膜。消化液中含有使病毒粒子失活
的物质 ,如赤色荧光蛋白质。当该物质含量高时 ,能使一部分病毒粒子溶解[4～6 ] 。低温处理可
能降低了消化液的灭活作用 ,使赤角荧光蛋白等能灭活病毒粒子的因子的分泌量减少或活性
203 核　农　学　报 16 卷
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　图版Ⅰ　核多角体病毒侵入棉铃虫中肠上皮细胞
Plate Ⅰ　The infection process of nuclear polyhedrosis virus in the
midgut epithelial cells of Helicoverpa armigera
1 　接种后 30min ,有囊膜的病毒粒子进入微绒毛间 ( ×
120000)
1. The virions with nenvelope in the space among the microvilli at 30
minutes postinoculation ( ×120000)
2 　接种后 30min ,病毒粒子吸附于微绒毛表面 ( ×120000)
2. The virions attaching to the surface of microvilli at 30 minutes
postinoculation ( ×120000)
3、4 　接种后 1h ,病毒粒子的囊膜与微绒毛的质膜以顶端对
顶端相互融合 ( ×200000 ×120000)
3 ,4 The tops of viral evelope fusing the tops of microvilli membrane
at 1hour postinoculation ( ×200000 ×120000)
5 　接种后 1h ,病毒粒子的囊膜与微绒毛的质膜以顶端对侧
面相互融合 ( ×200000)
5. The tops of viral envelope fusing the sides of microvilli membrane
at 1hour postinoculation ( ×200000)
6 　接种后 1h ,病毒粒子的囊膜与微绒毛的质膜以侧面对侧
面相互融合 ( ×200000)
6. The sides of viral envelope fusing the sides of microvilli mem2
brane at 1hour postinoculation ( ×200000)
7 　接种后 1h ,核衣壳进入微绒毛内 ( ×40000 ×40000)
7. The nucleocapsids entering into microvilli at 1 hour postinocula2
tion ( ×20000 ×20000)
8 　接种后 2h ,核衣壳移到微绒毛底部 ( ×160000)
8. The nucleocapsids move to the bases of mcirovilli at 2 hour posti2
noculation ( ×160000)
9 　接种后 3h ,核衣壳进入柱状细胞 ( ×60000)
9. The nucleocapsids entering into the columnar cell at 3hour postin2
oculation ( ×60000)
10 　接种后 1h ,病毒粒子直接与柱状细胞的质膜融合 ( ×
160000)
10. The envelopes of virus and the cytoplasm membrane of columnar
cell fusing at 1 hour postinoculation ( ×160000)
降低 ,从而使更多的病毒粒子有可能接触中肠上皮细胞。病毒粒子还须穿过围食膜 ,否则会被
排泄出体外。正常围食膜表面结构致密无孔 ,核多角体病毒不能自由通过围食膜。虽然核多
角体病毒能改变围食膜结构而使自己容易穿过围食膜。如核多角体含有使围食膜的一种糖蛋
白 (gp68)消失的因子[8 ] ,gp68 是围食膜的重要组成成分。家蚕核多角体内存在碱性蛋白酶 ,这
些酶能促使病毒穿过围食膜[9 ] 。但是在正常情况下 ,病毒感染率很低。而低温处理使围食膜
出现直径达 150nm 的孔洞[10 ] 。而核多角体病毒粒子大小为 50～70nm ×250～400nm ,能轻易通
过这些小孔进入中肠细胞。因此 ,低温处理使中肠细胞对病毒感受性提高的主要原因是消化
液的改变和围食膜受到破坏。
303　5 期 核多角体病毒侵染棉铃虫中肠细胞过程的电镜观察
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参考文献 :
[ 1 ] 　Kawanishi C Y,Summers M D ,Stoltz D B ,Arnott H J . Entry of an insect virus in vivo by fusion of viral envelope and microvillus
membrane.J Invert Pathol . 1972 ,20 :104～108
[ 2 ] 　Tanada Y,Hess R T ,Omi E M. Invasion of a nuclear polyhedrosis virus in midgut of the armyworm , Pseudaletia unipuncta ,and the
enhancement of a synergistic enzyme.J . Invert Pathol . ,1975 ,26 :99～104
[ 3 ] 　Granados R R. Early events in the infection of Heliothis zea midgut cells by a baculovirus Virol . 1978 ,90 :170～174.
[ 4 ] 　Hayashiya K,Nishida J ,Matsubara F. Inactivation of muclear polyhedrosis virus in the digestive juice of silkworm larva , Bombyx mor.
Japan J . Entomol Zool . 1968 ,12 :189～193
[ 5 ] 　Funakoshi M ,Aizawa K. Viral inhibitory factor produced in the hemolymph of the silkworm , Bombyx Mori ,infect with a nuclear poly2
hedrosis virus.J Invert Pathol . 1989 ,54 :151～155
[ 6 ] 　Uchida Y,Kawamoto T ,Himeno M ,Hayashia K. A virus2inactiviating protein isolated from the digestive juice of the silkworm , Bombyx
mori . J Invertebr Pathol . 1984 ,43 :182～189
[ 7 ] 　吕鸿声. 昆虫病毒与昆虫病毒病. 北京 :科学出版社 ,1985
[ 8 ] 　Granados R R ,Lawler KA. In vivo pathway of Autographa Californical baculovirus invasion and infection. Virol . 1981 ,108 :297～308
[ 9 ] 　Derksen A C G,Granados R R. Alteration of a lepidopteran pritrophic membrane by baculoviruses and enhancement of viral infectivi2
ty. 1988 ,167 :242～250
[10 ] 　Summers M D ,Smith G E. Trichoplusia ni granulosis virus granulin :a phenol soluble phosphorylated protein. J Virol . 1975 ,16 :1108
～1116
THE INFECTIOUS ROUTE OF NUCLEAR POLYHEDROSIS VIRUS IN THE
MIDGUT EPITHELIAL CELLS OF Helicoverpa armigera
ZHANG Yan2jun1 　XU Hua2jun2 　TAN Jun3 　LIN Yu2qing3
(11 Zhejiang Center for Disease Control and Prevention , Hangzhou , Zhejiang prov. 　310009 ;
2. Minsheng Biotechnology Company , Hangzhou , Zhejiang prov . 　310020 ;
3. College of life Science , Zhejiang University , Hangzhou , Zhejiang prov . 　310029)
ABSTRACT :The process for nuclear polyhedrosis virus entering into the midgut epithelial cells of
Helicoverpa armigera and infectious route were studied by electron microscopy. Many intact envel2
oped virions were observed in the space among the microvilli of the posterior midgut columnar
cells at 30 minutes postinoculation. Subsequently these virions at tip positivon contacted and at2
tached to the surface of the microvilli. At 1 hour postinoculation the viral envelopes and the mi2
crovillus membranes were apparently fused ,and only the nonenveloped nucleocapsids entered the
mcrovilli. These nucleocapsids continued to move to the bases of the microvilli ,and entry into the
columnar cell cytoplasm finally. A fusion of the viral envelope and cytoplasma membrane of midg2
ut columnar cell were also observed.
Key words :nuclear polyhedrosis virus; Helicoverpa armigera ; infection ; midgut epithelial cells
403 Acta Agriculturae Nucleatae Sinica
2002 ,16 (5) :301～304