全 文 ：文章编号 :100028551 (2003) 032179205
杜鹃抗盐突变体的筛选
王长泉　宋　恒
(山东理工大学基建处 ,山东 淄博　255091)
摘 　要 :利用杜鹃的离体叶片诱导不定芽 ,发现 MS + BA210ppm + ZT011ppm 培养基不
定芽分化率最高。用γ射线作诱变剂 ,对离体叶片产生的不定芽进行了耐盐筛选 ,得
到了耐 015 %、017 %和 1 %NaCl 的变异株系 ,并对变异株系进行了初步鉴定。
关键词 :杜鹃 ;叶片 ;组织培养 ;γ射线 ;耐盐 ;筛选
收稿日期 :2002201221
作者简介 :王长泉 (1970～) ,男 ,山东省平原县人 ,硕士 ,从事植物育种研究工作。
我国有 3460 万 km2 盐碱地 ,改善盐碱地目前只有两种途径 :一是人工改良 ,此法昂贵 ;二
是抗盐育种。培育具有开发前景的盐生植物 ,是有效、经济且切实可行的措施[7 ] 。在细胞或组
织水平上进行抗盐突变体的筛选 ,变异频率高 ,培养条件容易控制且不受季节限制 ,是值得开
拓的新领域[3 ,4 ] 。
杜鹃花 ( Rhododendro)是著名的观赏花卉。我国是杜鹃的原产地 ,约有 561 余种 ,占全球总
数的 58 % ,是世界杜鹃花属的分布中心 ,但多数品种喜欢偏酸性土壤 ,在北方寒冷地带不能露
地越冬。培养耐寒、耐盐、芳香种类、蓝紫色系和黄色种类及花瓣多裂、大花型等种类的新种质
是育种学家追求的目标。但许多杜鹃的优良品种 (如重瓣程度高的品种) 结实率低甚至不结
实 ,给常规育种带来一定困难 ,而且由于嵌合体的干扰 ,变异体的筛选纯化工作非常繁重。组
织培养和辐射育种技术相结合可增大突变频率 ,扩大变异谱[6 ] ,为无性繁殖植物、尤其是观赏
植物的育种提供了新的重要途径 ,本研究利用60 Coγ射线做诱变剂对杜鹃中西鹃栽培品种王
冠 ( Rhododendro hybridum)试管苗进行耐盐筛选 ,获得了耐 015 %、017 %和 1 % NaCl 的突变系。
1 　材料和方法
111 　材料
供试材料为山东淄博大地园林股份有限公司新品种繁育中心组培室提供的杜鹃品种王冠
试管苗。
112 　方法
11211 　不定芽的诱导及植株的再生 　取杜鹃王冠试管苗的叶片 ,接种于 MS 附加不同浓度
BA、ZT的培养基上 ,每种培养基 10 瓶 ,每瓶接种 3 片叶。培养基蔗糖浓度为 30g·L - 1 ,琼脂为
615g·L - 1 ,培养光照强度为 800～1200Lx ,光照时间 10～12h·d - 1 ,室温 (20 ±2) ℃。将叶片分化
的不定芽转入附加不同浓度 IBA 的 MS 培养基上生根 ,培养条件同上。
971　核 农 学 报　2003 ,17 (3) :179～183Acta Agriculturae Nucleatae Sinica
11212 　杜鹃耐盐突变体的筛选 　将用γ射线处理过的杜鹃试管苗叶片接种于含不同浓度
NaCl 的 MS 培养基上 ,诱导不定芽的分化 ,连续选择 6 次 ,筛选耐盐突变体 ,培养基成份及培养
条件同上。
11213 　耐盐突变体的鉴定 　将耐盐突变体离体叶片转入不含 NaCl 的培养基上 ,培养 1 个月
后 ,再转入相应浓度 NaCl 的培养基上 ,观察其抗盐稳定性。取变异株的叶片 ,测定其可溶性
糖、游离氨基酸、脯氨酸及 K+ 和 Na + 含量。可溶性糖测定采用蒽酮比色法 ,游离氨基酸总量用
氰氨酸盐法 ,脯氨酸测定用水合茚三酮法 ,Na、K测定用火焰光度法。
2 　结果与分析
211 　不定芽的分化及植株再生
王冠叶片培养 15d 后切口处长出少量淡绿色愈伤组织 ,继续培养陆续有不定芽分化 ,由表
1 看出 ,BA 210mg·L - 1和 ZT 011mg·L - 1最适合于王冠再生不定芽 ,BA 和 ZT 的浓度升高或降
低 ,不定芽分化率都有不同程度的降低 ,方差分析表明 ,在选择范围内 ,不同浓度的 BA 和 ZT
对分化率的影响显著 ,以 BAΠZT在 10～20 左右最有利于不定芽的分化。
表 1 　BA和 ZT对不定芽诱导的影响
Table 1 　Effect of ZT and BA on adventitious bud
植物激素
phytohormon(mg·L - 1)
BA ZT
接种叶片数
No. of leaves
分化叶片数
No. of regeneration leaves
分化百分数
percentage of regeneration
010 010 30 0 010
011 30 0 010
012 30 0 010
015 30 0 010
015 010 30 0 010
011 30 4 1313
012 30 14 4616
015 30 7 2313
110 010 30 0 010
011 30 18 6010
012 30 13 4313
015 30 10 3313
210 010 30 0 0
011 30 25 8313
012 30 10 3313
015 30 12 4010
410 010 30 0 010
011 30 3 1010
012 30 6 2010
015 30 5 1616
方差分析
variance analysis
33 33
　　注 :表中数据用双因素方差法分析 , 3 表示 5 %水平 ,即差异显著 ; 33 表示 1 %水平 ,即差异极显著。
Note :The data in table were analysized with double factor variance method , 3 indicates 5 % level ,differences are notable ; 33 indicates
1 % level ,differences are more notable.
081 核　农　学　报 17 卷
表 2 　不同浓度的 IBA对生根的影响
Table 2 　Effect of IBA concentration on root regeneration
IBA
(mg·L - 1)
芽苗基部的
愈伤组织
No. of callus
生根率
percentage of
rooting( %)
LSR0105
010 无　non 0 c
012 少量　few 88 a
014 少量　few 90 a
018 大量　many 60 b
　　　注 :表中数据用 Duncan 新复极差测验法 ,简称LSR ,0105 表示 5 %
水平 ,相同字母表示差异不显著 ,不同字母产表示差异显著。
Note :The data were tested with Duncan LSR ,the same letters indicate
differences are unnotable ,different lerrers mean differences are significant at
5 % level . The same as the following.
　　将叶片分化的不定芽移入生根培养
基中 ,半月后可见根的发生 ,随培养时间
的延长 ,不同培养基对生根的影响越来
越明显 , IBA 012～014mg·L - 1 之间不仅
生根率高 ,而且根大、茎基部愈伤组织较
少 ,茎叶生长正常 , IBA 浓度超过 016mg·
L - 1时茎基部愈伤组织较多 ,初发根畸
型 ,生长弯曲 ,说明过高浓度的 IBA 对根
系的分化及生长有不良作用。
212 　耐盐突变体的筛选
21211 　NaCl 对杜鹃叶片不定芽分化的
影响 　将叶片接种在 BA 210mg·L - 1 +
ZT 011mg·L - 1含不同浓度 NaCl 的 MS 培养基上 ,诱导不定芽分化。由表 3 看出 ,NaCl 明显抑制
叶片不定芽的分化 ,当 NaCl 浓度达到 013 %时显著影响不定芽分化 ,当 NaCl 达到 015 %时 ,极
显著地影响叶片不定芽分化 ,因此选 015 % NaCl 作为耐盐筛选的最低临界值 ,当 NaCl 浓度超
过 1 %时不定芽分化率极低 ,做为最高临界值。
表 3 　NaCl 浓度对叶片不定芽分化的影响
Table 3 　Effect of NaCl concentration on adventitious bud regeneration
NaCl 浓度
concentration
( %)
处理叶数
No. of treated leaves
分化叶数
No. of regeneration leaves
分化率
percentage of regeneration
( %)
LSR0105
CK 90 75 8313 a
011 90 66 7313 a
013 90 42 4616 b
015 90 15 1616 c
110 90 3 313 d
21212 　γ射线处理对叶片不定芽分化的影响 　将用不同剂量γ射线辐射处理后的杜鹃叶片
接种到 BA 210mg·L - 1 + ZT 011mg·L - 1的培养基以诱导不定芽分化 ,结果如表 4。γ射线对叶片
不定芽的分化有明显影响 ,且随剂量增大 ,不定芽分化率逐渐降低 ,方差分析表明 ,10Gy 以上
显著影响叶片不定芽的分化 ,15Gy 以上处理的叶片开始生长正常 ,但随培养时间延长大部分
叶片逐渐坏死 ,因此选 10Gy 为适宜剂量。
表 4 　不同剂量γ射线处理对叶片不定芽分化的影响
Table 4 　Effect ofγ2rays on adventitious bud regeneration
γ射线剂量
γdose ( Gy)
处理叶片数
No. of treated leaves
分化叶片数
No. of regeneration leaves
分化率
percentage of regeneration
( %)
LSR0105
CK 90 75 8313 a
5 90 71 7813 a
10 90 49 5414 b
15 90 31 3414 c
20 90 13 1414 d
181　3 期 杜鹃抗盐突变体的筛选
21213 　耐盐突变体的筛选 　取经 10Gy 射线处理后的杜鹃试管苗的叶片移入 BA 210mg·L - 1 +
ZT 011mg·L - 1 + 015 % NaCl 的培养基上作第 1 轮选择 ,在第 1 轮选择末 ,选取生长良好的不定
芽叶片转移到同样 NaCl 浓度的培养基上 ,进行第 2 轮选择 ,依次进行到第 6 轮选择末 ,选取生
长良好的不定芽叶片转移到不含 NaCl 培养基上 ,清除可能对选择剂“上瘾”的非抗性细胞。1
个月后选取不定芽叶片转入含 015 % NaCl 或不含 NaCl 的 BA 210mg·L - 1 + ZT 011mg·L - 1的培
养基上诱导不定芽的分化 ,再生植株称耐 015 % NaCl 的变异体。
表 5 　不同 NaCl 浓度筛选对叶片不定芽变异率的影响
Table 5 　Effect of NaCl on variant frequency
NaCl 浓度
NaCl concentration ( %)
接种叶片数
No. of leaves
变异叶片数
variant leaves
变异率
percentage of
variant ( %)
015 CK 900 21 2133
　　10Gyγ射线处理 900 31 3144
017 CK 900 10 1111
　　10Gyγ射线处理 900 24 2166
110 CK 900 4 0144
　　10Gyγ射线处理 900 20 2122从 015 % NaCl 选择第 3 轮开始 ,挑选生长良好的不定芽叶片 ,转入 017 %、1 % NaCl 的培养基上作为第 1 轮选择 ,至第 6 轮止 ,选取生长良好的不定芽叶片 ,按上述 015 %NaCl 选择处理方法移入不含 NaCl的培养基上诱导不定芽分化 ,再生植株分别称耐 017 %和 1 % NaCl 的变异体。将未经γ射线处理的杜鹃
叶片 按 上 述 程 序 筛 选 得 到 耐
015 %、017 %、1 % NaCl 变异体做对照。如表 5 示 ,γ射线诱变明显提高了变异率 ,如耐 110 %变
异率 CK为 0144 % ,γ射线处理为 2122 % ,是 CK的近 5 倍。
3 　耐盐变异系的鉴定
将 CK和耐 015 %、017 %和 1 % NaCl 的变异株离体叶片转移到不含 NaCl 培养基上 ,培养 1
个月后再移入含有相应含量NaCl 的培养基 ,各变异体保持其不定芽的耐盐稳定性 ,而 CK移入
015 % NaCl 培养基 10d 后便慢慢死亡。取耐不同浓度 NaCl 的不定芽叶片继代繁殖诱导不定
芽 ,经耐盐鉴定仍保持其亲本的耐盐性。
由于耐 017 %和 1 % NaCl 的变异株数极少 ,尚未进行快繁试验 ,故取 CK植株和耐 015 %
NaCl 植株进行生理指标测定 ,测定植株体内可溶性有机物及 K+ 、Na + 含量。由表 6 看出 ,变异
株系比对照可溶性糖降低 ,游离氨基酸、脯氨酸含量比对照高 , K+ 和 Na + 浓度明显升高。在盐
分协迫条件下 ,变异体为了维持生长代谢过程 ,既要建造驱体 ,又要合成渗透调节物质 ,积累矿
质离子。耐盐植物可溶性糖含量低 ,很可能由于其呼吸消耗增大所致 ,游离氨基酸含量增加 ,
是由于 NaCl 对蛋白质合成起到抑制作用 ,游离氨基酸相对积累。高浓度 K+ 、Na + 离子含量有
利于变异体维持自身水分平衡。
表 6 　变异株和对照株叶内可溶性物质比较
Table 6 　Soluble matter in variants and CK leaves
材料
materials
糖
sugar
(mgΠg) 游离氨基酸free amino acid(mgΠg) 脯氨酸proline(mgΠg) K+(mgΠg) Na +(mgΠg)
CK 88193 525166 238315 33125 01708
变异株
variants
75123 744183 935218 59 41125
281 核　农　学　报 17 卷
4 　结论与讨论
不同激素配比实验表明 ,BA 210mg·L - 1 + ZT 011mg·L - 1是杜鹃不定芽分化的最佳培养基 ,
分化率达到 8313 %。MS + IBA 014ppm 是最佳生根培养基 ;不定芽的分化受γ射线和 NaCl 的
抑制 ,γ射线辐射最佳剂量为 10Gy ,015 % NaCl 极显著抑制不定芽分化 ,可做为耐盐筛选的临
界值 ;耐盐突变体移入不含 NaCl 培养基上 1 个月分化不定芽后 ,再分别移入含 NaCl 培养基
上 ,抗性表现稳定。变异株系比对照可溶性糖含量降低 ,游离氨基酸、脯氨酸含量比对照高 ,
K+ 和 Na + 浓度明显升高。
植物的耐盐性机理是十分复杂的 ,有的植物泌盐 ,有的植物拒盐 ,有的植物稀盐 ,有的兼而
有之。耐盐性受个体发育时期、环境的影响[5 ,8 ] 。抗盐品种的选育如果能建立在植物抗盐生理
指标的基础上 ,那么筛选效率无疑要提高许多倍。尽管耐盐性的遗传机理尚未搞清 ,但耐盐性
是受遗传控制的毫无疑议。关于遗传性状和生理指标的关系还待深入研究。随着现代生物技
术的发展及 RLFP、RAPD 等技术在育种方面的应用 ,人们将会从分子水平对抗盐变异体进行早
期鉴定。
若不定芽恰起源于变异的单细胞将会获得同质的变植株[6 ] ,避免或限制不稳定的嵌合体
的存在。杜鹃叶片产生的不定芽是否起源于单细胞 ,还有待进一步研究 ,但无疑选取杜鹃叶片
做为组织培养材料选育耐盐突变体会提高变异频率并简化筛选程序。
参考文献 :
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SELECTION OF SALT2TOLERANCE VARIANTS FROM RHODODENDRO
WANG Chang2quan 　SONG Heng
( Department of Basical Construction , Shangdong Technology University , Zibo , Shandong prov. 　255091)
Abstract :Adventitious buds from the leaves of rhododendro were induced. MS + BA210mg·L - 1 +
ZT011mg·L - 1 was found as the best medium for adventitious bud regeneration andγ2rays were
used as mutagens to select salt2tolerance variants from adventitious buds. The variants tolerated to
015 %,017 %, 1 % NaCl were established , and preliminary identif ication was conducted on the
variants.
Key words :rhododendro ; in vitro ;γ2rays ; selection ; salt2tolerance
381Acta Agriculturae Nucleatae Sinica
2003 ,17 (3) :179～183