全 文 ：文章编号 :100028551 (2006) 052387205
耐辐射奇球菌 Deinococcus radiodurans 中非编码 RNA
陈仲中　王梁燕　林　军　田　兵　华跃进
(浙江大学原子核农业研究所Π农业部核农学重点开放实验室 ,浙江 杭州 ,310029)
摘 　要 :耐辐射奇球菌 ( Deinococcus Radiodurans) 对电离辐射、紫外线以及强氧化剂等方面具有惊人的抗
性。非编码 RNA (non2coding RNA , ncRNA) 在参与转录调控、RNA 的加工与修饰、mRNA 的转录、蛋白质
的运输与稳定性调节等方面具有非常明显的作用。本文通过概率上下文无关算法 (Stochastic Context
Free Grammar , SCFG) ,对耐辐射奇球菌 R1 菌株的基因间序列进行相似二级结构预测 ,结果发现 ,在耐辐
射奇球菌 R1 基因组的非编码区存在 28 个非编码 RNA 家族。其中 IRE家族成员最多 ,其次是 Histone3、
tRNA 和 SECIS 家族。所发现的 DicF 与 ctRNA-p GA1、tmRNA 等家族成员为细菌所特有。与其他生物比
较分析结果显示 ,可以用这些非编码 RNA 来研究耐辐射奇球菌的生物学功能 ,并为进一步研究其 DNA
损伤与修复分子机制提供依据。
关键词 :耐辐射奇球菌 ;非编码 RNA ;RNA ;二级结构
NON2CODING RNA IN Deinococcus radiodurans
CHEN Zhong2zhong 　WANGLiang2yan 　LIN Jun 　TIAN Bing 　HUA Yue2jin
( Institute of Nuclear2Agricultral Sciences , Zhejiang Universtity , Hangzhou , Zhejiang ,310029)
Abstract :Researches on DNA damage and repair pathways of Deinococcus radiodurans show its extreme resistance to ionizing
radiation , ultraviolet radiation and reactive oxygen species. Non2coding (ncRNA) RNAs are involved in a variety of processes
such as transcriptional regulations , RNA processing and modification , mRNA translation , protein transportation and stability.
The conserved secondary structures of intergenic regions of Deinococcus radiodurans R1 were predicted using Stochastic Context
Free Grammar (SCFG) scan strategy. Results showed that 28 ncRNA families were present in the non2coding regions of the
genome of Deinococcus radiodurans R11 Among these families , IRE is the largest family , followed by Histone3 , tRNA ,
SECIS. DicF , ctRNA—p GA1 and tmRNA are only discovered in bacteria. Results from the comparison with other organisms
showed that these ncRNA can be applied to the study of biological function of Deinococcus radiodurans and supply reference for
the further study of DNA damage and repair mechanisms of this bacterium.
Key words : Deinococcus radiodurans ; ncRNA ; RNA ; secondary structure
收稿日期 :2005210220
基金项目 :国家重点基础研究发展规划项目 (2004CB19604) ;国家自然科学基金重点资助项目 (30330020) ;国家杰出青年基金项目 (30425038)
作者简介 :陈仲中 (19812) ,男 ,浙江东阳人 ,硕士研究生 ,主要从事生物信息学与分子调控方面的研究 ,Email : zhongzhongchen @sohu. com。
华跃进为通讯作者 ,TelΠFax : 0571 86971703 ; Email : yjhua @zju. edu. cn　　细菌 Deinococcaceae 家族是目前为止发现的对电离辐射最具抗性的一类生物 [1～4 ] 。耐辐射奇球菌( Deinococcus radiodurans , DR ) 属于 Deinococcaceae 家族 ,是 Anderson 等[1 ] 1956 年从辐射灭菌的肉罐头中分 离出来的球菌。在指数生长期 , D . radiodurans 对电离辐射的抗性是大肠杆菌的 200 倍 ,对紫外线的抗性则是大肠杆菌的 20 倍[5 ] 。由于其对电离辐射、紫外线以及强氧化剂等方面所表现的惊人抗性而备受生物学
383　核 农 学 报　2006 ,20 (5) :383～387Journal of Nuclear Agricultural Sciences
家、环境学家的关注。1999 年 D . radiodurans R1 菌株
的全基因组测序[6 ] 完成后 ,为 D . radiodurans 耐辐射
机理的研究提供了方便。先前主要集中于通过点突变
技术、二维凝胶电泳结合质谱技术以及基因芯片技术
来研究 D . radiodurans 的基因功能[7～11 ] ,但是并没有
对非编码区全基因组 RNA(ncRNA) 进行系统的生物信
息学研究。ncRNA 在真核生物、细菌、古细菌等许多生
物的转录调控以及染色体的复制、RNA 加工与修饰、
蛋白质的降解与运输以及稳定性调节等方面扮演着非
常重要的角色。D . radiodurans R1 基因组中存在相当
多的非编码蛋白质基因区 ,为 ncRNA 以及其余小分子
RNA 基因的存在提供了客观基础。
ncRNA 在不同的物种之间存在相当高的序列同源
性以及二级结构保守性。Omer 等在古细菌 Sulfolobus
acidocaldarius 中克隆了 18 个类似 snoRNA (核仁小分子
RNA)的小分子 RNA ,并通过以这 18 个小分子为模式
所建立的概率模型在 7 个古细菌类群的基因组中进行
搜索 ,找到超过 200 多个 sRNA[12 ] 。Regalia 等根据 SRP
RNA (信号识别颗粒 RNA) 的二级结构模型 , 在
Lactococcus lactis 和 Staphylococcus 中预测到了 SRP
RNA[13 ] 。Washietl 等依据 RNA 的二级结构元件来筛选
非编码 RNA[14 ] 。本文正是基于非编码 RNA 家族之间
的保守二级结构元件 ,通过计算机搜索方法 ,首次在全
基因组范围内在 D . radiodurans R1 的非编码序列中寻
找与其他生物属于同一家族的 ncRNA 的成员 ,并对细
菌中特有的及与复制相关的 ncRNA 进行了分析 ,以期
为 D . radiodurans R1 中 ncRNA 及 D . radiodurans 的
DNA 损伤与修复分子机制的研究提供依据。
1 　材料和方法
111 　数据库来源
D . radiodurans R1 基因组数据库从 TIGR 网站
(http :ΠΠwww. tigr. org) 下载 ,编写的 Perl 程序提取基因
组数据库中的基因间序列并构建基因间序列数据库。
RNA家族数据库 Rfam 可从网站 ( http :ΠΠwww. sanger.
ac. ukΠSoftwareΠRfamΠ和 http :ΠΠrfam. wustl . eduΠ)下载。
112 　方法
11211 　D . radiodurans R1 中候选 ncRNA 的获得
　SCFG搜索的依据是来自 Rfam[ http :ΠΠwww. sanger. ac.
ukΠSoftwareΠRfamΠindex. shtml ]中 RNA 家族的特征文件 ,
使用 infernal20155 [ http :ΠΠwww. genetics. wustl . eduΠeddyΠ
infernalΠ]的功能模块 ,对基因间序列数据库进行预测 ,
用相应的程序和索引文件提取与相应 RNA 家族二级
结构相似的基因间序列作为 D . radiodurans R1 中该
RNA 家族的候选 ncRNA。
11212 　D . radiodurans R1 中序列联配和二级结构分
析　使用 ClustalX (1183) [15 ]对 D . radiodurans R1 中非
编码区 RNA 家族的核苷酸序列与其他生物相应的
RNA 家族成员序列进行多序列联配 ,使用 BioEdit[16 ] 对
联配结果和格式进行编辑 ,观察 RNA 家族序列的保守
性。RNA 的二级结构采用 Mfold[17 ]软件预测。
2 　结果与分析
211 　D . radiodurans R1 中 ncRNA 家族成员及其分布
在 D . radiodurans R1 的非编码区总共找到 28 个
RNA 家族 ,869 个候选 ncRNA ,其中 1 号染色体中最
多 ,有 716 个候选 ,其次是 2 号染色体 ,小质粒中则最
少 ,只预测到 25 个 (表 1) 。这与该菌染色体以及质粒
的大小相一致。在这些 RNA 家族中 , tmRNA、DicF、
ctRNA-p GA1、RNaseP- bact-a、RFN、S- box 主要存在于细
菌中 ,5S- rRNA、tRNA、Intron-gpII、THI则在古细菌、细菌
与真核生物中。同时 ,还发现主要存在真核生物中的
如 Hammerhead-3、Hammerhead-1、SECIS、Histone3、IRE等
RNA 家族也于 D . radiodurans R1 中存在。这 28 个
RNA 家族在数量上差异很大 ,而 IRE 和 Histone3 占了
所有候选 ncRNA 的 7012 % ,其中 IRE 占了 5319 %。
IRE(铁反应元件)是一个具有发夹结构的保守 RNA 元
件 ,能够有效地识别并结合 IRP (铁调控蛋白) , IRE 与
铁代谢、氧化性损伤和衰老等过程都有密切的关系。
212 　细菌中特有的 RNA 家族
在 D . radiodurans R1 的非编码区发现有 DicF、
ctRNA 以及 tmRNA 3 类 RNA 家族 ,先前的研究表明这
3 类 RNA 家族主要存在于细菌之中[18 ] 。DicF 属于与
RNA分子伴侣 Hfq 相结合的一类 RNA 成员 [19 ] ,由
Escherichia coli dicB 编码 ,是第二个细胞分裂抑制因
子[20 ] ,能够阻止缢痕的形成以及复制的染色体进入子
类核[21 ] 。DicF RNA 会干扰 FtsZ mRNA 的转录 ,能阻止
核糖体结合到 FtsZ mRNA 上[22 ] 。DNA 损伤通常作为
许多原噬菌体的诱导信号 ,同时它也诱导了 FtsZ 活性
的抑制因子 SulA[23 ] 。这表明在 DNA 损伤后可能存在
一些阻止细胞分裂的现象存在。在 D . radiodurans R1
的非编码区找到 3 个具有相同拷贝的候选 DicF ,分别
位于基因 DR0254 与 DR0255、DR2251 与 DR2252、
DR2578 与 DR2580 之间 , 这里分别命名 DicFDR1、
DicFDR2、DicFDR3。对 已 知 其 他 细 菌 中 DicF
RNA与 D . radiodurans R1中DicFRNA一致的二级结构
483 核　农　学　报 20 卷
表 1 　D . radiodurans R1 中 ncRNA家族成员
Table 1 　Distribution of noncoding RNA families
in D . radiodurans R1
RNA 家族
RNA family
DR 菌中与 RNA 家族具有相似二级
结构的候选 RNA 数量分布
Distribution on number basis of RNA
secondary structures in D. radiodurans
similar to RNA families
1 号染色体
Chromo2
some Ⅰ
2 号染色体
Chromo2
some Ⅱ
大质粒
megaplasmid
小质粒
small plasmid
5S—rRNA 3
tRNA 47 1
Hammerhead —3 4 2
Hammerhead —1 37 6 2 3
RNaseP —bact —a 2
U5 7 1 2
tmRNA 2
Intron —gpII 7 1 2
SECIS 41 4 2 3
Histone3 110 13 15 4
IRE 386 48 21 13
DicF 3
Entero —OriR 1
RFN 1
THI 1
U7 4 1
HDV —ribozyme 1
snoPyro —CD 8 1 1
snoZ159 1
S—box 1
s2m 31 2
SRP —bact 3
SSU —rRNA —5 5
REN2SRE 4 5
sno —14q —Ⅰ—Ⅱ 1
ctRNA —p GA1 1
HepC—CRE 2
Antizyme —FSE 2
总和 total 716 85 43 25
表明它们都形成了两个茎环结构 ,且具有较高的序列
同源性 (图 1) 。环形质粒的复制包含许多可以保持低
拷贝的机制。CtRNA (反向转录 RNA) 是一类长 50～
250nt ,半衰期短 ,组成性合成的小 RNA ,可与质粒 PG1
等的 rep 基因先导序列互补 ,在转录后水平负调控复
制起始 rep 基因的表达 ,从而维持环形质粒低拷贝
数[24 ] 。在 D . radiodurans R1 的非编码区只找到 1 个
候选 ctRNA ,位于基因 DR2164 与 DR2165 之间 ,尽管
该候选 ncRNA 与其他细菌的 ctRNA 在序列上并没有
很高的同源性 ,但仍然表现出了比较相似的 RNA 二级
结构 (图 2) 。
在 D . radiodurans R1 的非蛋白编码区发现两个
tmRNA ,分别位于基因 DR0497 与 DR0498、DR0568 与
DR0569 之间。tmRNA 是具有 tRNA 和 mRNA 双重功
能的一类小分子 RNA。它主要在反式翻译模式过程
中发挥重要作用。当一个正常的翻译过程将要结束
时 ,可能由于该 mRNA 缺少正常的终止密码子或其他
方面的原因 ,核糖体仍滞留在 mRNA 上 ,这时 tmRNA
能结合到该核糖体上 ,在不完整的新生多肽链上连接
一段能被某些特异性蛋白水解酶降解的标记肽 ,并使
核糖体的两个亚基分离从而进入新一轮翻译过程[25 ] 。
Keiler 等人认为在 Caulobacter crescentus 的 DNA 复制时
期可能需要一条依赖 tmRNA 的信号通道[26 ] 。tmRNA
与基因的表达调控及细胞周期的调控等生命过程密切
相关。在 Caulobacter crescentus 的 G(1) 晚期 ,tmRNA 丰
度上升 ,在 G(1) 到 S 的过渡期 ,tmRNA 的丰度达到最
大值 ,在 S 早期下降 ,tmRNA 的细胞周期调控通过暂时
性转录调控和调节性 RNA 降解相结合来完成[27 ] 。
另外 ,在 D . radiodurans R1 中也发现了 RNaseP—
bact —a、RFN、S—box RNA 家族。RNaseP—bact —a RNA 能
够识别底物并具有剪切活性 ,可以在体外对前体 tRNA
进行正确的加工。RFN RNA 通常位于编码黄素单核
苷酸合成和转运蛋白的 mRNA 的 5’非转录区。RFN
RNA 作为一种代谢依赖型核开关的受体 ,该核开关在
Bacillus subtilis 中可能通过引起 ribDEAHT 操纵子的转
录提前终止和通过消除 ypaA mRNA 的核糖体结合位
点来控制基因表达[28 ] 。S—box RNA 位于革兰氏阳性
菌中与编码蛋氨酸或半胱氨酸合成蛋白相关基因的上
游 ,通常参与转录终止水平控制。Epshtein 等阐述了一
种利用 S2腺苷甲硫氨酸作为一种影响因子的反馈调
控机制 ,认为 S2腺苷甲硫氨酸直接特异性的结合于新
生 S—box RNA ,从而引起内在终止子的形成以及转录
的提前完成[29 ] 。
3 　讨论
ncRNA 在多个物种中被广泛发现 ,它们不编码蛋
白质 ,在进化上高度保守 ,直接在古菌、细菌、真核生物
等许多生物体的 RNA 水平上发挥着调控作用 ,如在染
色体的结构、基因的表达与关闭、蛋白质的运输及稳定
性调节、细胞周期及个体发育等过程中均具有重要的
作用。DicF、ctRNA 以 及 tmRNA 等 家 族 在 D .
radiodurans R1 中与 DNA 复制或修复具有直接或间接
的联系 , 对它们的深入研究可能有助于阐明 D .
radiodurans 的耐辐射机制。同时在 D . radioduransR1
中也发现许多 ncRNA 可能涉及 DNA 的修复机制。
583　5 期 耐辐射奇球菌 Deinococcus radiodurans 中非编码 RNA
　　　　
图 1 　D. radiodurans R1 中候选 DicF RNA 与大肠杆菌 ( E. coli) 、肠道沙门菌 ( S . enterica) 、
福氏志贺氏菌 ( S . flexneri)的多序列联配及一致保守二级结构分析
Fig. 1 　Alignment and the secondary structure consensus of DicF RNA in
D . radiodurans R1 , E. coli , S . enterica and S . f lexneri
括号内为相应细菌的 GenBank 号及所在位置 ; < > 表示简单的茎环结构 ;
表示可接受的残基 ; —表示发夹环残基 ;凸环和内环残基用 - 表示。
The GenBank numbers and locations of the RNA are described in parentheses. SS—cons indicates the secondary structure consensus. Base pairs in
simple stem loops are annotated with < > characters ; unstructured single stranded residues completely outside the structure are annotated by
colons ; hairpin loop residues are indicated by underscores ; bulge and interior loop residues are indicated by dashes
图 2 　D. radiodurans R1 中候选 ctRNA 与其他细菌中 ctRNA 的二级结构比较 (括号内为相应细菌的 GenBank 号及所在位置)
Fig. 2 　The secondary structure of ctRNA in D . radiodurans R1 , Corynebacteria diphtheriae
and Corynebacterium jeikeium (The GenBank numbers and locations of the RNA are described in parentheses)
683 核　农　学　报 20 卷
其中 Entero —OriR、HDV—ribozyme、HepC—CRE 为一类与
复制相关的 RNA ; RFN 和 THI 则是一类核开关 RNA ,
它们能够调节细胞的存活 ,间接感知细胞代谢水平 ,影
响基因的表达。IRE 和 Histone3 大量存在于 D .
radiodurans R1 中 , IRE可与铁调控蛋白 ( IRP) 结合 ,当
铁离子缺乏时 , IRE 与 IRP 结合 , 使核糖体的翻译进
程受阻 , 抑制 mRNA 的翻译 ; 而当铁离子浓度较高
时 , IRP 就释放 IRE , 促进翻译。最新研究表明 ,
Histone 可能会协助断裂的 DNA 双链进行修复[30 ] ,这
也表明 Histone3 RNA 可能在 DNA 损伤修复过程当中
起作用。关于 D . radiodurans 在 DNA 损伤修复方面的
研究 ,先前主要集中于对其蛋白编码区的研究。为了
更好地研究其分子机理 ,有必要把对 ncRNA 的研究和
对蛋白质的研究结合起来。尽管这些 ncRNA 的作用
仍然有待证实 ,但是 D . radiodurans R1 中大量 ncRNA
的发现无疑为研究该菌耐辐射机理的研究提供了一个
很好的思路。对 D . radiodurans R1 ncRNA 的研究必将
增进我们对该菌抗辐射分子机理的研究。
参考文献 :
[ 1 ] 　Anderson A W , Nordan H C , Cain R F , et al . Studies on a
radioresistant Micrococcus I. Isolation , morphology , cultural ,
characteristics , and resistance to gamma radiation. Food Technol , 1956 ,
10 :575～578
[ 2 ] 　Battista J R , Earl A M , Park M J . Why is Deinococcus radiodurans so
resistant to ionizing radiation ? Trends Microbiol , 1999 , 7 :362～365
[ 3 ] 　Minton K W. DNA repair in the extremely radioresistant bacterium
Deinococcus radiodurans . Mol Microbiol , 1994 , 13 :9～15
[ 4 ] 　Minton K W. Repair of ionizing2radiation damage in the radiation
resistant bacterium Deinococcus radiodurans . Mutant Res , 1996 , 363 :1
～7
[ 5 ] 　Battista J R. Against all odds : the survival strategies of Deinococcus
radiodurans . Annu Rev Microbiol , 1997 , 51 : 203～224
[ 6 ] 　White O , Eisen J A , Heidelberg J F , et al . Genome sequence of the
radioresistant bacterium Deinococcus radiodurans R11 Science , 1999 ,
286 :1571～1577
[ 7 ] 　Hua Y, Narumi I , Gao G, Tian B , et al . PprI , a general switch
responsible for extreme radioresistance of Deinococcus radiodurans .
Biophys Res Commun , 2003 , (306) :354～360
[ 8 ] 　Chunchao Zhang , Jianfeng Wei , Zhiguo Zheng , et al . Proteomic analysis
of Deinococcus radiodurans recovering fromγ2radiation , Proteomics ,
2005 ,5 : 138～143
[ 9 ] 　Liu Y. et al . Transcriptome dynamics of Deinococcus radiodurans
recovering from ionizing radiation. Proc Natl Acad Sci , 2003 ,100 : 4191
～4196
[10 ] 　郑智国 ,张春潮 ,华跃进. 耐辐射球菌 pprI 突变株的蛋白质组学
分析. 浙江大学学报·农业与生命科学版 , 2005 ,31 (1) . 27～31
[11 ] 　华跃进 ,高冠军. 耐辐射奇球菌 DNA 损伤与修复相关基因的比较
基因组研究. 微生物学报 , 2003 , 43 (1) :120～126
[12 ] 　Omer A D , Lowe T M , Russell A G, et al . Homologs of small nucleolar
RNAs in Archaea. Science , 2000 , 288 : 517～522
[13 ] 　Regalia M , Rosenblad M A , Samuelsson T. Prediction of signal
recognition particle RNA genes . Nucleic Acids Research , 2002 , 30 :
3368～3377
[14 ] 　Washietl S , Hofacker I L , Stadler P F. Fast and reliable prediction of
noncoding RNAs. Proc Natl Acad Sci USA , 2005 , 102 :2454～2459
[15 ] 　Thompson J D , Gibson T J , Plewniak F , et al . The CLUSTAL —X
windows interface : flexible strategies for multiple sequence alignment
aided by quality analysis tools. Nucleic Acids Research , 1997 , 24 :
4876～4882
[16 ] 　Hall T A. BioEdit : a user2friendly biological sequence alignment editor
and analysis program for Windows 95Π98ΠNT. Nucleic Acids Symposium
Series , 1999 , 41 :95～98
[17 ] 　Zuker M. Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization
prediction. Nucleic Acids Research , 2003 , 31 : 3406～3415
[18 ] 　Grif —ths2Jones , S. et al . Rfam : annotating non2coding RNAs in
complete genomes. Nucleic Acids Research , 2005 , 33 :121～124
[19 ] 　Gottesman S. The small RNA regulators of Escherichia coli : roles and
mechanisms. Annu Rev Microbiol , 2004 , 58 :303～328
[20 ] 　Bouch′e F , Bouch′e J P. Genetic evidence that DicF , a second division
inhibitor encoded by the Escherichia coli dicB operon , is probably RNA.
Mol Microbiol , 1989 , 3 :991～94
[21 ] 　Tetart F , Albigot R , Conter A , et al . Involvement of FtsZ in coupling of
nucleoid separation with septation. Mol Microbiol , 1992 , 6 :621～6271
[22 ] 　Tetart F , Bouche JP. Regulation of the expression of the cell2cycle gene
ftsZ by DicF antisense RNA. Division does not require a fixed number of
FtsZ molecules. Mol Microbiol , 1992 , 6 :615～6201
[23 ] 　Walker GC. The SOS response of Escherichia coli . In Escherichia coli
and Salmonella typhimurium : Cellular and Molecular Biology , ed. FC
Neidhardt , JL Ingraham , KB Low , B Magasanik , M Schaechter , HE
Umbarger , 1346～13571 Washington , DC: Am Soc Microbiol , 19871
[24 ] 　Venkova2Canova T , Patek M , Nesvera J . Control of rep gene expression
in plasmid p GA1 from Corynebacterium glutamicum . J Bacteriol , 2003 ,
185 :2402～2409
[25 ] 　Moore S D , McGinness K E , Sauer RT. A glimpse into tmRNA2mediated
ribosome rescue. Science , 2003 , 300 : 72～73
[26 ] 　Keiler K C , Shapiro L. tmRNA Is Required for Correct Timing of DNA
Replication in Caulobacter crescentus. J Bacteriol , 2003 , 185 : 573～
580
[27 ] 　Keiler K C , Shapiro L. tmRNA in Caulobacter crescentus Is Cell Cycle
Regulated by Temporally Controlled Transcription and RNA Degradation.
J Bacteriol , 2003 , 185 : 1825～1830
[28 ] 　Winkler W C , Cohen2Chalamish S , Breaker R R. An mRNA structure
that controls gene expression by binding FMN. Proc Natl Acad Sci USA ,
2002 , 99 :15908～15913
[29 ] 　Epshtein V , Mironov A S , Nudler E. The riboswitch2mediated control of
sulfur metabolism in bacteria. Proc Natl Acad Sci , USA , 2003 , 100 :
5052～5056
[30 ] 　Kusch T , Florens L , MacDonald W H , et al . Acetylation by Tip60 is
required for selective histone variant exchange at DNA lesions. Science ,
2004 , 306 : 2084～2087
783Journal of Nuclear Agricultural Sciences
2006 ,20 (5) :383～387