全 文 ：文章编号 :100028551(2003) 042313206
同位素示踪技术与转基因植物
生态风险性评价研究
叶庆富
(浙江大学农业与生物技术学院核农所 ,浙江 杭州　310029)
摘　要 :综述了外源基因及其表达产物在农业生态环境中的行为与归宿以及 T2DNA 在
土壤中的持留及其向土壤细菌水平转移的可能性等方面的国内外研究进展 ,探讨了同
位素示踪技术应用于转基因表达产物的环境行为与归趋、转基因植物中 T2DNA 向土壤
细菌水平转移的可能性、转基因植物根系分泌物的组成和根际土壤养分循环规律以及
转基因植物对有毒重金属和农药等典型污染物超积累的可能性等研究的优势所在。
关键词 :转基因植物 ;生态风险性 ;同位素示踪技术
收稿日期 :2002210231
基金项目 :国家自然科学基金资助(20177021 和 30070156)
作者简介 :叶庆富(1963～) ,男 ,博士 ,副研究员 ,从事核农学、生物物理学、环境科学和分子生态学方面的研究。
转基因植物 ( GM植物)的研究在世界范围内已取得令人瞩目的进展 ,已培育成功一大批抗
虫、抗病、耐除草剂和高产优质的农作物新品种。我国在转基因植物的研究方面也取得了重大进
展 ,先后将抗虫和抗病等基因导入棉花和水稻等作物[1 ] 。据不完全统计 ,我国已培养了 141 种
GM植物 ,其中 65 种已获准进行环境释放[1 ] 。作者所在单位也于 1998 年成功地将 Bt ( Bacillus
thuringensis)基因 ( cry1Ab)导入秀水 11 等 7 个水稻品种中 ,育成了目前世界上世代最高 (现已达
TR12 )且高抗 8 种鳞翅目害虫的转Bt 基因水稻———克螟稻[2 ] 。
截止到 2001 年 ,全球有 10 多个国家种植了转基因作物 ,种植面积达 5260 万 km2 ,其中美国
3570 万 km2 ,中国 150 万 km2 。中国的年增长率最高 ,Bt 棉花的种植面积 2000 年仅为 50 万 km2 ,
2001 年达到 150 万 km2 ,增加了 3 倍[3 ] 。全球范围内的主要 GM 作物为大豆 ,2001 年达 3330 万
km2 ,其次为玉米 ,达 980 万 km2 ,转基因棉花为 680 万 km2 。从 1996 至 2001 的 6 年间 ,抗除草剂连
续占主导特性地位 ,抗虫性居其次[3 ] 。
转基因作物的应用引起了农业生产方式的巨大变革和经济效益的大幅度提高 ,并为人类解
决人口膨胀、环境恶化、资源匮乏和效益衰减等问题提供了一条新的思路和途径。与此同时 ,随
着转基因产品的不断上市 ,其可能造成的负面影响已引起关注 ,尤其是斑蝶事件的发生 ,引发了
世界性的转基因“生物安全”论战[4212] 。
转基因植物的大规模生产对农业生态系统可能造成的负面影响是多方面的 ,主要包括 : (1)
危害农作物的遗传多样性 ,使品种单一化 ,加速了作物基因资源的流失 ; (2)使外源基因向野生或
半野生植物转移的可能性加大 ,有可能创造出超级杂草 ; (3)转基因的水平重组有可能形成新的
313　核 农 学 报　2003 ,17(4) :313～318Acta Agriculturae Nucleatae Sinica
有毒细菌 ; (4)目标生物体对抗虫作物的Bt 杀虫晶体蛋白产生抗性 ; (5)转基因及其表达产物在环
境中的残留以及可能造成地球化学过程和土壤养分循环的改变等等[4222] 。因此 ,在转基因作物进
入商品化生产前 ,对其进行生态风险性评价是极其必要的。我国已将转基因作物食品安全监控
及对农业生态系统的影响研究作为农业优先发展领域和重点研究方向列入到“十五”重点基础研
究发展规划中。因此 ,如何将同位素示踪技术更好地应用到“转基因植物生态风险性评价研究”
中去 ,是值得探讨的。
1 　同位素示踪技术在“转基因植物的表达产物的环境行为与归趋研究”中的应用
　　目前在转Bt 基因植物中大多采用组成型启动子 ,使得这种表达产物在植株体内能持续产
生。Bt 作物的根系也能分泌 Cry1Ab 杀虫蛋白 ,如 Saxena 等[13 ,14] 研究表明 ,Bt 玉米的根系可以分
泌 Cry1Ab 蛋白 ,这证实了外源基因的表达产物可通过根系分泌物造成空间上的转移。我们的研
究也表明 ,转 Cry1Ab 基因克螟稻的根系亦能分泌 Cry1Ab 蛋白。Palm等[15]将转Bt 棉花叶枝埋入
5 种不同微生态系统土壤中 ,发现 140d 后在 3 种土壤中仍能检测到 Bt 毒蛋白 (可提态) ,其含量
分别为起始浓度的 3 %～35 %。由于水稻的秸杆以及生长发育阶段的残枝败叶等通常还田 ,因
此 ,Bt 水稻中的 Cry1Ab 蛋白可以经秸杆还田和根系分泌等途径释放到农业生态系统。若 Cry1Ab
蛋白在环境中形成积累 ,则可能导致 2 个方面的问题[13] :一是对非靶标生物构成危害 ;二是导致
靶标害虫对杀虫蛋白选择压的增加 ,进而产生具抗性的害虫。Stotzky 等[13 ,14 ,16222] 发现 ,根系分泌
物饲喂欧洲玉米螟幼虫 ,5d 后幼虫死亡率达 95 %以上 ,而对照组无一死亡。他们还研究了由 Bt
玉米根系分泌的毒蛋白在土壤中的行为 ,结果表明 Cry1Ab 蛋白能快速和紧密地与粘土矿物和腐
殖酸等土壤基质结合 ,并且保留杀虫活性 ,其在土壤中的持留期可长达 234d。研究结果还表明 ,
与粘土矿物和腐殖酸等土壤基质形成结合的 Cry1Ab 蛋白 ,较之游离态更难被生物降解 ,因而更
具生态风险性。本课题组也发现 ,从Bt 水稻植株中纯化得到的 Cry1Ab 蛋白 ,加入土壤 1h 后 ,用
目前国外常用的提取方法[19] ,其提取效率仅为加入量的 10 % ,随后采用本课题组新近发现的提
取方法 ,其提取效率虽达到 65 % ,但仍有加入量的 35 %不能被提取 ,这表明 Cry1Ab 蛋白能与土壤
基质快速形成结合态残留。值得注意的是 ,Stotzky 等有关结合蛋白残留量的测定均采用生物喂
虫试验法[16 ,17] ,因此不能准确测定 Cry1Ab 蛋白的实际结合量。此外 ,国内外目前对外源基因表
达产物即蛋白质的检测一般按常规方法 (如 ELISA 等)进行 ,这些方法只能检测游离态的目标蛋
白质。一旦这些目标蛋白质与土壤或非靶标动物中的某些成分结合 ,就很难用上述方法进行检
测与跟踪研究。因此 ,研究转基因表达产物等生物大分子在土壤中的行为和归趋 ,需要在研究方
法上有所突破。示踪动力学在农药等农用化学物质 (小分子)的环境行为与归趋研究中已取得了
丰硕的成果 ,尤其在农药结合残留研究中具有独特的技术优势[23] 。通过对表达产物分子进行同
位素 (125 I、32 P、33 P 和14 C等)标记 ,可以清楚地阐明其在土壤中的环境行为与归趋、结合残留形成机
制和特性等问题。有理由认为 ,同位素示踪技术在转基因植物的表达产物的环境行为与归趋研
究中是一种不可缺少的研究方法。
2 　同位素技术在转基因植物 T2DNA 向土壤细菌水平转移可能性研究中的应用
　　在植物遗传转化操作过程中 ,常采用标记基因 (包括选择标记基因及报告基因)筛选和鉴定
转化的细胞、组织和再生植株。选择标记基因包括抗生素抗性基因及除草剂抗性基因等 ,其中用
得最多的是抗生素抗性标记基因。报告基因包括β2葡萄糖醛酸苷酶 ( gus) 、荧光素酶 ( luc) 、氯霉
413 核　农　学　报 17 卷
素乙酰转移酶 ( cat)以及绿色荧光蛋白 ( gfp)基因等。抗生素抗性标记基因 ,如编码潮霉素磷酸转
移酶基因 ( hpt) 、新霉素磷酸转移酶基因 ( nptⅡ)和庆大霉素抗性基因 ( aacC1)等。有关转基因植物
中标记基因的安全性评价已引起广泛关注[4 ] 。标记基因一方面可能会水平转移到土壤细菌中产
生具有抗生素抗性的超级细菌[24230] ;另一方面 ,这些 T2DNA (Transferred DNA)可能被土壤基质吸
附 ,在一定程度上延缓了核酸酶对其的降解 ,从而使 T2DNA 仍具有一定的转化能力[26] 。Smalla
等[29]和 Paget 等[25 ,26]利用 PCR 技术分析了转基因甜菜和烟草等外源 DNA 在土壤中的残留情况 ,
结果发现 T2DNA 可在土壤中持续存在。另外 ,抗抗生素和抗除草剂基因表达产物也可通过转基
因植物的残枝落叶转移到其他土壤微生物中从而导致外源基因的逃逸。Hoffmann 等[30] 发现 ,转
基因油菜和甜豌豆中的 nptⅡ可通过转基因植株的残枝落叶转移到一种能与植物共生的黑曲霉微
生物中。
对标记基因进行32 P、33 P 和14 C标记 ,可以方便地研究其在土壤中的行为、归趋及向土壤细菌
水平转移的可能性。
3 　同位素技术在转基因植物根系分泌物组成和根际土壤养分循环研究中的应用
　　转基因植物与环境相互作用的途径较多 ,其中 ,通过根系分泌物向根际微生态环境释放特定
物质是主要途径之一。由于转基因植物中外源基因的导入破坏了受体基因的活性 ,影响了受体
植物的一系列代谢过程 ,除引起相关表型发生变化外[31] ,还可能导致根系分泌物化学组成发生变
化。根系分泌物是植物根系在生命活动中向外界环境分泌的各种有机化合物的总称。按分子量
的大小可分为低分子量和高分子量分泌物 ,前者主要是有机酸、糖、酚及各种氨基酸。国内外有
关根系分泌物中低分子化合物组成的鉴定已有许多报道 ,如 Tagagi 等[32] 发现水稻的根系分泌物
主要成分为酒石酸等 ,Cieslinski 报道[33] 小麦的根系分泌物主要成分为草酸、乙酸、丙酸等 ,Tyler
等[34]发现玉米的根系分泌物主要成分为草酸、富马酸、苹果酸等。高分子量根系分泌物主要包括
粘胶和外酶 ,其中粘胶有多糖和多糖醛酸。由于根系分泌物中高分子量的组分极为复杂 ,对其分
离、纯化和结构鉴定具有较大的复杂性。
根系分泌物对根际微生态的影响主要体现在以下几方面 : (1)影响土壤生物学性质。影响根
际微生物的种类、种属、品种以及它们的生理生化特性[36] ;影响土壤酶的数量和种类[36] ;影响土
壤矿物的生物转化[37 ,38] 。(2)影响土壤的理化性质。根系分泌物对土壤微团聚体的稳定性及团
聚体大小分布等物理性质有显著影响[39] ;根系分泌物中的甲酸、乙酸和草酸对根系土壤具有酸化
作用[40] ;根系分泌物能影响矿物颗粒的吸附性能[41] 。(3) 影响土壤养分释放及有效性。如
Subbarao 等[42]发现根系分泌物在帮助植物吸收利用难溶性磷方面起主要作用 ;Takagi [43]发现水稻
等禾本科植物的根液可溶解螯合 Fe ,且缺铁时这种溶解螯合能力更强。总之 ,不同根系分泌物是
构成植物不同根际微生态特征的最根本原因。因此 ,开展转基因植物风险性评价研究时 ,有必要
对其根系分泌物化学组成进行研究。这对明确和协调转基因植物与环境之间的关系具重要的理
论和实际意义。
对转基因植物及其亲本进行全生育期14 CO2 光合标记 ,经 C18等固相萃取法富集低分子分泌
物并结合国内外其它方法进行样品预处理 ,用 UV2放射性联机 HPLC 初步确定主要成分 ,再通过
LC2MS和 GC2MS等法进一步分析。依据 UV2放射性 HPLC、LC2MS 和 GC2MS 谱图 ,找出主要差异
峰 ,重点分析差异峰 ,进而阐明转基因植物与亲本在根系主要分泌物化学组分上的异同性。同位
素示踪技术与现代仪器分析技术相结合 ,有助于简化根系分泌物化学组分的结构鉴定。此外 ,利
513　4 期 同位素示踪技术与转基因植物生态风险性评价研究
用15N、13 C、14 C和32 P 标记以及示踪动力学可以揭示转基因植物根际土壤有效养分的循环规律。
4 　同位素示踪技术在转基因植物对重金属和农药等典型污染物超积累的可能性研
究中的应用
　　转基因食品安全性的评价包括主要营养成分比较、毒理试验、过敏性分析和标记基因的安全
性等几个方面 ,对后三者的评价目前报道较多[44246] 。转基因食品是否存在营养结构与化学成分
的变化已成为其食品安全性评价的热点[47 ,48] 。英国皇家学会报告称 ,转基因技术可能导致不可
预测的食物营养结构改变 ,从而给人类健康带来危害[49] 。目前普遍公认的营养成分的比较研究
是依据国际经合组织的“实质等同性”原则[45]进行的 ,即利用各种现代仪器分析技术比较转基因
食品和常规食品在主成分等方面的异同性。Shirai 等[50] 和美国孟山都公司[51] 对抗草甘膦转基因
大豆的研究结果表明 ,转基因大豆与常规大豆之间在主要营养成分上不存在明显差异。然而 ,现
有的转基因食品安全性研究只侧重于分析转基因食品的常规营养指标和目的基因的表达产物 ,
而对转基因食品中是否存在未知的有害或有益物质 (外源基因导入会引发植物代谢变化 ,较之亲
本 ,转基因作物的生物合成和代谢过程会有所不同 ,因此转基因食品的化学组成可能不同) ,是否
对有毒重金属和农药等典型污染物具有超积累等问题 ,鲜见报导。我们的初步研究结果表明 ,Bt
水稻与亲本表现出对不同金属元素 (Cd、Zn 和 Fe 等)具有不同的富集效应。利用同位素示踪和
成像技术研究转基因植物对有毒重金属和农药是否具有超积累现象 ,较之其它方法更为直观和
简便。
5 　展望
国内外数十年的研究表明 ,同位素示踪技术在农药等农用化学物质 (小分子)的环境行为与
归趋以及 N、P 和 C养分循环等研究中具有常规方法无法比拟的技术优势 ,尤其在农用化学物质
结合残留研究中不可或缺。可以预见 ,随着 GM植物商业化进程的加快 ,有关外源基因及其表达
产物等生物大分子在农业生态系统中的环境行为与归趋 ,结合残留形成机制和特性 ,转基因植物
中 T2DNA 向土壤细菌水平转移的可能性 ,外源基因及其表达产物对土壤养分循环的影响 ,转基
因植物根系分泌物的组成以及转基因植物对典型污染物 (有毒重金属和农药等)超积累的可能性
等方面研究工作 ,将日益引起科技界的广泛的重视。通过对外源基因及其表达产物等生物大分
子进行同位素 (125 I、32 P、33 P 和14 C等)标记 ,并综合运用同位素示踪动力学、分子生物学和现代仪器
分析技术 ,有助于阐明常规方法在转基因植物的生态风险性评价研究中无法解决的科学难题。
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